אנו רוצים להודות ל אוונס, ב גריינג&#39;ר, ד Rissling, צ&#39;סים, א גודווין, Hayhurst ק וד Kuch לסיוע בתחום. ק חביב Galbreath סיפקו דגימות pika כבד מן Coola בלה העמק. תודה א Gonçalves דה סילבה ו - ק לארסן לדיונים המעניינים שתרמו לעיצוב של שיטת הדגימה פולשני זה גנטי. עבודה זו מומנה על ידי למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה דיסקברי, ו UBC מחקר Okanagan הפרט מענקים מרס השוויצרית הלאומית למדע מלגת קרן דוקטורט PBSKP3_128523 נתמך PH. מחקר זה נערך בעקבות פרוטוקול טיפול בבעלי חיים מאוניברסיטת קולומביה הבריטית (מספר תעודה: A07-0126).

1. שיער מוקש לפני הקמת מוקש, מיקום אידיאלי צריך להיות נחוש בתוך הגידול pika או מדרון שפיע. זה כולל ערימות חציר, שהם מצבורי צמחייה החיות לאסוף בסוף הקיץ, כמו גם scats טרי שנמצאו באתרים השירותים. רצועות של נייר אריזה (10-50 ס&quot;מ אורך) הם מגולגלת כדי לספק משטח 360 מעלות דביק מסודרים בצורה אינטרנט כמו על המעטפה הכניסה ערימת השחת של pika (איור 1) או השירותים באתר. בהתאם לתצורת הסלעים, חתיכת חוט דיג ניתן להשתמש כדי לתמוך את המבנה של מוקש את השיער, אבל זה בדרך כלל לא נחוץ כאשר הכניסות הם די קטנים (&lt;30 ס&quot;מ קוטר), תיאור מלא של השימוש חוט דיג ניתן למצוא הנרי Russello (2010) 3. מלכודות שיער נבדקים לעתים קרובות ככל האפשר, דגימות שיער שהופקדו על הקלטת (איור 2) נאספים אז שכותרתו. לאחר מועבר בחזרה למעבדה, שערות יוסרו מן הקלטת דביק באמצעות מלקחיים סטריליות והועברו לתוך צינורות קירור ומאוחסנים ב -20 ° C עד מניפולציה נוספת. דגימות שיער מקובצים יחד לאורך מוקש שיער נחשבים שייכים לאדם אחד, בעוד דוגמאות התקבצו באופן עצמאי הם הניחו להשתייך אנשים שונים. במקרה האחרון, שיער ממוקם אז צינורות שונים. הנחות אלה יכול להיות מאוחר יותר נבדק בדרך של טביעות אצבעות DNA וחישובים של הסתברות של זהות המבוססת על נתונים genotypic microsatellite. 2. מיצוי DNA מאז pika שיער דק מאוד ומכיל נורת שורש זעיר, אנו הראו בעבר כי לפחות 25 שערות נדרשים להשיג כמויות מספיקות של DNA לטוב הגברה במורד איכות PCR 3. השתמשנו במערכת ה-DNA IQ (Promega, במדיסון, וויסקונסין, ארה&quot;ב) גרסה שונה מעט של הוראות היצרן לבידוד דנ&quot;א דגימות שיער. ראשית, המדגם השיער הוא סובב את בצנטריפוגה מיקרו על מנת למנוע אובדן של השיער תוך פתיחת הצינור. אז הפתרון הדגירה הוא מוכן על ידי ערבוב 80 μl של פתרון הדגירה עם 10μl של DTT (1M) ו 10μl של proteinase K (18ng/ml) לתוצאות בריכוז סופי של 0.1 M ו - DTT 1.8ng/ml של דגירה ק proteinase הפתרון (100 μl) מתווסף המדגם מודגרות על 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. בינתיים, הפתרון תמוגה מוכן ידי הוספת 1 μl של DTT (1M) עבור כל 100 μl של חיץ תמוגה, וכתוצאה מכך ריכוז DTT הסופי של 0.01M. פתרון תמוגה הוכן (200 μl) הוא הוסיף אז המדגם, יחד עם 7 μl של שרף IQ DNA, vortexed למשך 3 שניות במהירות גבוהה מודגרות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. המדגם vortexed ואז למשך 2 שניות הוכנס לעמוד המגנטי, שם ההפרדה של חרוזים מגנטיים מפתרון מתרחשת. הפתרון שנותר הוא aspirated ואז מושלך, נזהר לא להפריע גלולה של שרף מגנטי. המדגם הוא טיפל אז עם 100 μl של הפתרון תמוגה מוכן, vortexed וחזר לעמוד המגנטי שבו ההפרדה מתרחשת שוב. המאגר תמוגה הוא aspirated וזנוח, וזה צעד חוזרת שלוש פעמים באמצעות חיץ לשטוף (100 μl). המדגם הוא עזב לאחר מכן לייבוש לעמוד המגנטי במשך 15 דקות. לאחר יבש, 100 μl של חיץ elution מתווסף המדגם מודגרות על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. המדגם vortexed ונוסף לעמוד המגנטי. הפתרון עכשיו המכיל את ה-DNA eluted הוא הועבר לאחר מכן צינור 1.5 Eppendorf מ&quot;ל ו המאוחסן -20 ° C עד מניפולציות נוספות. דגימות דנ&quot;א כבד הופק גם באמצעות מערכת IQ דנ&quot;א המשמש כביקורת חיובית amplifications PCR. 3. PCR הגברה הדנ&quot;א המתקבל מוקש שיער פולשנית שלנו דגימות כבד שימשו אז להגביר חבילה של סמנים מולקולריים נפוץ (microsatellite, AFLP, המיטוכונדריאלי ציטוכרום B ו ZFX / ZFY סמן sexing). PCRs בוצעו באמצעות תרמית Veriti Cycler (Applied Biosystems, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה&quot;ב) בנפח 25 μL המכיל: 10-20 ng DNA, 0.5 מיקרומטר של כל פריימר, 10 mM טריס-HCl (pH 8.3), 50 מ&quot;מ KCl, 1.5 mM MgCl 2, 200 מיקרומטר dNTPs, 10 μ שור בסרום אלבומין (BSA, ניו אינגלנד Biolabs, Ipswich, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב) ו 0.5 U AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA (Applied Biosystems). פרמטרים רכיבה על לוקוסים microsatellite היו אופטימיזציה באמצעות רכיבה על אופניים הנגיעה התוכנית (10 דק &#39;ב 95 ° C, 35 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 30 של חישול, ו 45 שניות ב 72 מעלות צלזיוס, ואחריו צעד סופי ב 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות). הטמפרטורה חישול ירידה של 1 ° C לכל מחזור 60-55 ° C עד שהגיע במחזור השישי, ובשלב 29 המחזורים הנותרים המשיכו ב 55 ° C. פרמטרים רכיבה על שברי המיטוכונדריה תוארו לעיל, אלא כללה 35 מחזורים עם חישולטמפרטורה של 50 ° C. Amplified אורך קטע פולימורפיזם נערך בעקבות פרוטוקול עבור הגנום חוליות שתואר על ידי בונין 4. לבסוף, sexing מולקולרית בוצע באמצעות PCR-RFLP של ZFX / ZFY לוקוסים עם העיכול הגבלה HinfI האנזים 5. המוצרים PCR מן, AFLPs microsatellite ו ציטוכרום רצפים B נוהלו על נתח ABI 3130XL גנטי (Applied Biosystems), בעוד מתעכל ZFX / ZFX שברי נוהלו לצד סולם נ&quot;ב 100 (ניו אינגלנד Biolabs) על 3% agarose ג&#39;ל המכיל 2.5% ג&#39;ל בטוח SYBR DNA כתם (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה, ארה&quot;ב) ו דמיינו באמצעות הדמיה אדום אישי ג&#39;ל המערכת (אלפא Innotech, סן ליאנדרו, קליפורניה, ארה&quot;ב). Microsatellite ו AFLPs היו דמיינו באמצעות Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) ואת chromatogram הדנ&quot;א המיטוכונדרי היה דמיינו באמצעות Sequencher v4.7 (ג&#39;ין קוד Corporation, אן הרבור, מישיגן, ארה&quot;ב). 4. נציג תוצאות הדנ&quot;א שנלקחו דגימות שיער שהושגו באמצעות מוקש פולשנית שלנו שימשו PCR להגביר סוג שונים של סמנים מולקולריים. כבסיס להשוואה, חילוץ באמצעות דגימות DNA הכבד היה מוגבר לצד דגימות שיער שלנו. גרעיני לוקוסים microsatellite היו מוגבר בהצלחה לשיער והן דגימות כבד (איור 3). למרות עוצמת האות היה גדול יותר בעת השימוש דגימות כבד, זה לא להשפיע לרעה על הניקוד גנוטיפ (איור 3). תוצאות דומות הושגו כאשר באמצעות AFLPs (איור 4), רצפי DNA המיטוכונדרי (איור 5), ואת סמן ZFX / ZFY sexing מולקולרית (איור 6). <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. דוגמה מוקש שיער פולשנית שהוקמה על ערימת חציר. רצועות של נייר מגולגל אריזה ברור מסודרים אופנה אינטרנט כמו לסגור את הכניסה ערימת השחת. חתיכה של חוט דיג משמש כאן כדי לספק תמיכה נוספת עבור מוקש השיער. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. מוקש שיער מוצלח המכיל מספר רב של שיער תקוע לקלטת האריזה. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. Chromatogram נציג microsatellite גרעיני (Ocp6) 8 מוצג כפי Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Chromatogram העליון התקבל על ידי ה-DNA הגברה של רקמת הכבד, והוא הטרוזיגוטיים (354/358) בשעה מוקד זה. Chromatogram התחתון מייצג אדם אחר מציג גנוטיפ הטרוזיגוטי (358/362) המבוסס על ה-DNA המופק שיער. בעוד האות של chromatogram מן המדגם שיער יש עוצמה נמוכה יותר מאשר במדגם הכבד, הבקיע גנוטיפ אינו מושפע לרעה הבדל זה האות. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. Chromatogram AFLP נציג (E31T32) מוצג כפי Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Chromatogram העליון התקבל על ידי ה-DNA הגברה של רקמת הכבד, chromatogram התחתון מייצג את ה-DNA המופק שיער. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5. רצף ה-DNA המיטוכונדרי נציג chromatogram (ציטוכרום B) מוצג כפי Sequencher v4.7 (ג&#39;ין קוד Corporation). Chromatogram העליון התקבל על ידי ה-DNA הגברה של רקמת הכבד, chromatogram התחתון מייצג את ה-DNA המופק שיער. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig6.jpg" alt="איור 6"/> איור 6. Sexing נציג סמן מולקולרי (ZFX / ZFY) מוגבר של הכבד והן דגימות שיער. גישה זו נשענת על תצפית כי כרומוזום Y בעל אתר הגבלה HinfI באזור זה כי חסר כרומוזום X. לכן, נשים לייצר שני שיתוף נודדות שברים של 432 נ&quot;ב תוך הזכרים לייצר שברי 432 נ&quot;ב, 261 נ&quot;ב ו - 171 נ&quot;ב.

<ol>
	<li>Kendall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demography+and+Genetic+Structure+of+a+Recovering+Grizzly+Bear+Population.">Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population.</a> J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).</li><li>Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+genetic+evaluation+of+population+size,+natal+philopatry,+and+roosting+behavior+of+non-breeding+eastern+imperial+eagles+(Aquila+heliaca)+in+central+Asia.">A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia.</a> Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).</li><li>Henry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+population+structure+and+ex+situ+representation+of+the+endangered+Amur+tiger.">In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger.</a> Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).</li><li>Henry, P., Russello, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+high+quality+DNA+from+elusive+small+mammals+using+low-tech+hair+snares.">Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares.</a> Eur J Wildlife Res. , (2010).</li><li>Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+amplified+fragment+length+polymorphism+(AFLP)+markers+in+surveys+of+vertebrate+diversity.+Method+Enzymol+395.">Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395.</a> , 145-145 (2005).</li><li>Fontanesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexing+European+rabbits+(Oryctolagus+cuniculus),+European+brown+hares+(Lepus+europaeus)+and+mountain+hares+(Lepus+timidus)+with+ZFX+and+ZFY+loci.">Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci.</a> Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).</li><li>Piggott, M. P., Taylor, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+collection+of+animal+DNA+and+its+applications+in+conservation+management+and+understanding+the+population+biology+of+rare+and+cryptic+species.">Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species.</a> Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).</li><li>Banks, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demographic+monitoring+of+an+entire+species+(the+northern+hairy-nosed+wombat,+Lasiorhinus+krefftii)+by+genetic+analysis+of+non-invasively+collected+material.">Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material.</a> Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).</li><li>Litvaitis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+range-wide+survey+to+determine+the+current+distribution+of+New+England+cottontails.">A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails.</a> Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).</li><li>Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+nine+polymorphic+microsatellite+loci+in+the+North+American+pika,+Ochotona+princeps.">Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps.</a> Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

דגימה גנטית פולשנית הפכה חלופה אטרקטיבית כדי המסורתית שיטות לכידה לחיות מכמה סיבות. ראשית, על ידי בחשאי לאסוף חומר ביולוגי (למשל, צואה, שערות, נוצות, רוק וריר) מאוכלוסיות הבר, החוקרים יכולים ללמוד מינים אלה מבלי להפריע, טיפול, או אפילו לצפות אותם, ובכך מקטין את הסיכונים הן חיות החוקרים. שנית, דגימה גנטית פולשנית מאפשרת לביולוגים לחקור אוכלוסיות של מינים חמקמקה ונדירה, משימה יכול להוכיח קשה לחיות עם השמנה הגישות המסורתיות יותר 6. ושלישית, NGS עלולה להגדיל את גודל המדגם על ידי צמצום הפרעה לבעלי חיים, מאמצים הדגימה, עלויות, ובכך מסייעת לצמצם הטיות אומדנים של פרמטרים באוכלוסייה 7. זו הנקודה האחרונה עשויה להוכיח מכריע בהתמודדות עם מינים מאוימים, שכן ההערכות מוטה של ​​פרמטרים האוכלוסייה עלול לגרום וניהול הולם. במאמר הנוכחי אנו מתארים וידאו שיטה פשוטה, חדשנית, זולה פולשנית מדגם יונקים קטנים חמקמק, באמצעות Pika האמריקאית כדוגמה. אנו מראים כי ה-DNA המופק שיער מבצע דומה ל-DNA שנלקחו דגימות כבד ביחס microsatellite, AFLP, המיטוכונדריה וסמנים sexing, מה שהופך את שיטת הדגימה פולשנית חלופה אטרקטיבית כדי לחיות דגימה או לכידה קטלנית. באופן כללי, אנו צופים כי שיטה זו תהיה שימושית בשלב איסוף הנתונים של מחקרים גנטיים התנהגותיים האוכלוסייה קטנה של מיני יונקים נדירים או חמקמק, תוך צמצום ההשפעה על אורגניזמים תחת מחקר.

שיער מוקש: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רולס של סרט אריזה ברור (3M, סנט פול, מינסוטה, ארה&quot;ב) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דייג קו (10 £) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריוגני צינור (2ml) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי מלקחיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנקן נוזלי דיואר (אופציונלי) </li></ul> מיצוי DNA: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת ה-DNA IQ (קט # DC6701; Promega) עם רקמת והוצאה שיער Kit (קט # DC6740; Promega). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MagneSphere ההפרדה Stand טכנולוגיה מגנטית (קט # Z5342; Promega) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרו צנטריפוגות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלאה תנור או מים באמבטיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 מ&quot;ל Eppendorf צינורות </li></ul>

a noninvasive hair sampling technique to obtain high quality dna from elusive small mammals

פולשנית גישות דגימה גנטית הם הופכים חשובים יותר ויותר ללמוד אוכלוסיות חיות הבר. מספר מחקרים דיווחו על שימוש בטכניקות דגימה פולשנית לחקור אוכלוסייה ודמוגרפיה גנטיקה של אוכלוסיות הבר 1. גישה זו הוכיחה להיות שימושי במיוחד כאשר התמודדות עם מינים נדירים או חמקמק 2. בעוד מספר שיטות אלה פותחו שיער מדגם, צואה חומר ביולוגי אחר טורפים ובינוניות יונקים, הם נשארו בעיקר נבדק אצל יונקים קטנים חמקמק. בסרטון הזה, אנו מציגים רומן, מוקש שיער זול פולשנית מכוון יונק קטן וחמקמק, pika האמריקאית (Ochotona princeps). אנו מתארים את כללי הגדרת מוקש של השיער, אשר מורכב רצועות אריזה קלטת מסודרים אופנה אינטרנט כמו והניח לאורך נתיבי נסיעה בבית הגידול של pikas. אנו מדגימים את היעילות של המלכודת על איסוף כמות גדולה של שיער כי אז יכול להיות אסף והביא למעבדה. לאחר מכן, אנו מדגימים את השימוש במערכת ה-DNA IQ (Promega) כדי לבודד דנ&quot;א להציג את התועלת של שיטה זו כדי להגביר סמנים מולקולריים נפוץ כולל מיקרו גרעיני, הגברה אורך קטע פולימורפיזמים (AFLPs), רצפים של המיטוכונדריה (800bp) וכן sexing סמן מולקולרי. בסך הכל, אנחנו מדגימים את השירות של מוקש שיער הרומן הזה לא פולשנית כטכניקה הדגימה ביולוגים אוכלוסיית חיות הבר. אנו צופים כי גישה זו תהיה ישימה מגוון רחב של יונקים קטנים, פתיחת אזורי החקירה בתוך אוכלוסיות טבעיים, תוך צמצום ההשפעה על אורגניזמים המחקר.

Watch this Scientific Journal Video about A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals at JoVE.com

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

אנו מציגים גישה דגימה פולשנית ביעילות לאסוף דגימות שיער של יונקים קטנים חמקמק, כפי שמוצג על pika האמריקאי. אנו מדגימים את השירות של שיטה זו על ידי מיצוי דנ&quot;א של השיער שנדגמו הגברה מספר סוגים של סמנים מולקולריים נפוץ לימודי האקולוגיה ושימור חיות בר.

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

a-noninvasive-hair-sampling-technique-to-obtain-high-quality-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Views.  University of British Columbia, Okanagan Campus. אנו מציגים גישה דגימה פולשנית ביעילות לאסוף דגימות שיער של יונקים קטנים חמקמק, כפי שמוצג על pika האמריקאי. אנו מדגימים את השירות של שיטה זו על ידי מיצוי דנ"א של השיער שנדגמו הגברה מספר סוגים של סמנים מולקולריים נפוץ לימודי האקולוגיה ושימור חיות בר.

Video: A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

פולשנית In vivo קטנים בעלי חיים MRI ו MRS: הפרוצדורות בסיסי

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

Microarrays DNA: בקרת איכות המדגם, הכלאת מערך סריקה ו

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

טכניקה חדשה לניתוח כמותי של נשירת שיער בעכברים באמצעות ניתוח גווני אפור

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological information. The pathways generated by this online application are machine-readable and fully compatible with essentially all web-browsers and computer operating systems. It uses a specially developed, web-enabled pathway drawing interface that permits the selection and placement of different combinations of pre-drawn biological or biochemical entities to depict reactions, interactions, transport processes and binding events. This palette of entities consists of chemical compounds, proteins, nucleic acids, cellular membranes, subcellular structures, tissues, and organs. All of the visual elements in it can be interactively adjusted and customized. Furthermore, because this tool is a web server, all pathways and pathway elements are publicly accessible. This kind of pathway &#34;crowd sourcing&#34; means that PathWhiz already contains a large and rapidly growing collection of previously drawn pathways and pathway elements. Here we describe a protocol for the quick and easy creation of new pathways and the alteration of existing pathways. To further facilitate pathway editing and creation, the tool contains replication and propagation functions. The replication function allows existing pathways to be used as templates to create or edit new pathways. The propagation function allows one to take an existing pathway and automatically propagate it across different species. Pathways created with this tool can be &#34;re-styled&#34; into different formats (KEGG-like or text-book like), colored with different backgrounds, exported to BioPAX, SBGN-ML, SBML, or PWML data exchange formats, and downloaded as PNG or SVG images. The pathways can easily be incorporated into online databases, integrated into presentations, posters or publications, or used exclusively for online visualization and exploration. This protocol has been successfully applied to generate over 2,000 pathway diagrams, which are now found in many online databases including HMDB, DrugBank, SMPDB, and ECMDB.

PathWhiz is a comprehensive, online pathway drawing tool for generating biochemical and biological pathways. It uses publicly accessible databases and easily expandable palettes consisting of pre-drawn pathway components. This protocol describes how to easily build new pathways, replicate and edit existing pathways, and propagate previously drawn pathways to different organisms.

כלי אינטרנט לאיכות יצירה גבוהה מסלולים ביולוגיים מכונית קריאות

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

לכידת לייזר פרוטוקול מיקרודיסקציה התשואות באיכות גבוהה RNA מ-העכבר קפואים טרי-קפוא

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...