Ce travail a été soutenu par la NSF accorde MCB-0817827.

Calorimétrie de titrage isotherme (ITC) est une technique bien établie qui permet de déterminer tous les paramètres thermodynamiques (affinité, enthalpie et stœchiométrie) d&#39;une interaction de liaison dans une expérience. 1 CCI travaille en titrant un réactif dans un second réactif dans des conditions isothermes. Le signal mesuré est la chaleur dégagée ou absorbée lors de l&#39;interaction (liaison) des deux réactifs. Une série d&#39;injections sont pratiquées et le signal de la chaleur sera proche de zéro que le réactif limitant devient saturé. Montage de l&#39;isotherme donne les paramètres thermodynamiques. Plusieurs examens sont disponibles qui décrivent l&#39;instrumentation ainsi que les mathématiques de la collecte de données et d&#39;analyse. Calorimètres 2,3 Bien d&#39;autres sont disponibles (notamment les CCI 200 avec de petits volumes), ici, nous décrivons un protocole général pour la VP-ITC fabriqués par MicroCal (maintenant partie de GE Healthcare). 1. Préparation des échantillons <ol><li> Afin de préparer la macromolécule et le ligand dans un tampon, quelques problèmes potentiels doivent être abordés. S&#39;adapte précis nécessitent des concentrations appropriées de la macromolécule, l&#39;espèce qui va généralement dans la cellule de l&#39;échantillon de l&#39;ITC, et le ligand, l&#39;espèce dans la seringue. Parce que certaines protéines agrégées à des concentrations élevées nécessaires pour l&#39;espèce dans la seringue, le plus souvent la protéine est chargée dans la cellule d&#39;échantillon. La concentration optimale macromolécule est déterminé à partir &quot;c&quot;, le produit de l&#39;affinité prédit du système, qui peut être estimée en utilisant des méthodes orthogonales avant d&#39;utiliser le CCI, et la concentration totale macromolécule, où c = K a * [M]. Les valeurs optimales de la gamme C 10-1000, 1 s&#39;il est possible d&#39;obtenir des données précises pour la faiblesse des systèmes de sous-contraignante des conditions expérimentales spécifiques avec des valeurs C en dessous de la limite inférieure. 4 Ainsi, la concentration macromolécule doit être déterminée avec cette gamme de c valeurs à l&#39;esprit (par exemple, pour un K a de 10 6 M -1, les concentrations macromolécule de 10 à 1000 um devrait être utilisé). La connaissance préalable de l&#39;affinité de liaison du système peut contribuer à minimiser la protéine utilisée pour l&#39;ITC à travers une meilleure conception de l&#39;expérience de l&#39;ITC. La concentration du ligand doit être suffisamment grand (7-25 fois plus concentré que le Kd pour le site de liaison du ligand plus faible) de sorte que la saturation se produit dans le premier tiers à la moitié de la titration. Ajustement précis des données exige également la saturation du signal. Pour les systèmes avec affinité de liaison plus élevée, une concentration inférieure ligand doit être utilisé pour éviter la saturation trop tôt dans le titrage, ce qui donnera s&#39;adapte inexactes. Une fois la chaleur de contrôle de la dilution (titrage soit de ligand dans le buffer) a été soustraite de la titration, l&#39;enthalpie à saturation devrait approcher de zéro. </li><li> Parce que les impuretés de petites molécules peut donner lieu à des signaux artéfactuelle dans les mesures de l&#39;ITC, il est préférable, si possible, que la macromolécule et le ligand de manière exhaustive dialyse contre du tampon. Alternativement, chromatographie sur colonne, le dessalage colonnes de centrifugation, ou le tampon d&#39;échange filtres centrifuges (par exemple, Centricons) peut être utilisée pour changer le tampon de la macromolécule. Si le ligand est une petite molécule, il peut être préparé en utilisant le tampon de dialyse après la macromolécule a été dialysé ou par dialyse contre les membranes de dialyse avec seuils adaptés pour les petites molécules (c. 100-500 Da pour un Spectra / Por Float-A-Lyzer ). Les différences dans la composition de tampon entre le ligand et des solutions macromolécule peut conduire à des signaux des artefacts de la chaleur de la dilution des impuretés dans les échantillons. Après la préparation, vérifiez que le pH du match tampon, macromolécule et le ligand (unités de pH ± 0,05) que les artefacts de l&#39;enthalpie peuvent survenir en raison d&#39;effets de tampon protonation. 5 Assurez-vous de préparer suffisamment de chaque espèce. Pour les expériences en triple et un contrôle de la dilution, la quantité de matériel nécessaire dépendra de la CCI utilisés. Mais, pour la plupart des instruments CCI qui ont approximativement 2 ml de cellules volume d&#39;échantillon, au moins 6-7 ml de solution de macromolécule sera nécessaire, et peut être commodément préparés dans des tubes de 15 ml Falcon. Pour 300 seringues uL, 1-2 ml de solution devrait être suffisante, et peuvent être préparés dans des tubes Falcon soit ou microtubes. </li><li> La poussière et autres particules, peut causer des artefacts dans la ligne de base du thermogramme CCI. Il est impératif qu&#39;ils soient retirés avant l&#39;exécution de l&#39;expérience. Après la préparation des solutions mères de l&#39;échantillon, les échantillons doivent être centrifugés dans des microtubes de cinq minutes à 8000 à 14.000 RPM aux particules granulés dans la solution. Retirer le surnageant, en faisant attention à ne pas perturber le culot, et le placer dans un nouveau Falcon / microcentrifugeuse tube. Si des agents réducteurs sont nécessaires pour maintenir cystéines réduites, l&#39;utilisation de faibles concentrations et les stocks frais de β-Mercaptoethanol, PTCE (tris (2-carboxy) phosphine) ou le dithiothréitol pour minimiser les artefacts dus à l&#39;oxydation réducteur. En outre, la présence de solvants organiques dans la mémoire tampon (communes pour certains ligands de petites molécules qui peuvent avoir besoin de méthanol ou le DMSO pour être soluble) peut causer des artefacts du signal. Si des solvants organiques sont nécessaires pour le ligand, alors la solution macromolécule doit aussi contenir la même concentration pour éviter tout signal provenant de la chaleur de dilution du solvant organique. De légères différences dans la composition de tampon entre le ligand et macromolécule en raison de co-solvants, sels ou de pH sont possibles lors de la préparation des échantillons. Il est préférable de vérifier la dilution du ligand dans le tampon d&#39;échantillon ou le tampon d&#39;échantillon dans la macromolécule de s&#39;assurer que les signaux de la chaleur résultant de différences dans le contenu du buffer ne causent pas de données résultant uniquement d&#39;artefacts. </li><li> Vérifiez la concentration de la macromolécule et le ligand soin en utilisant des techniques appropriées à votre système (telles que les mesures d&#39;absorbance, HPLC, dosages colorimétriques, les essais BCA pour les protéines, etc) pour enregistrer leurs concentrations exactes. Les différences dans la concentration réelle et la concentration utilisée pour ajuster l&#39;isotherme provoquera des erreurs dans la stoechiométrie, enthalpie et l&#39;affinité de liaison déterminée à partir de l&#39;expérience. Il est commun pour dégazer les échantillons pour éviter les artefacts du signal due aux bulles d&#39;air ou la libération des gaz dissous pendant le titrage, en particulier à des températures élevées. </li></ol> 2. Mise en place de l&#39;Expérience <ol><li> Assurez-vous que la cellule d&#39;échantillon et d&#39;une seringue d&#39;injection sont nettoyés selon le protocole du fabricant avant le chargement de la macromolécule et le ligand. Rincer la cellule échantillon à deux ou trois fois avec 1,8 ml d&#39;eau distillée à l&#39;aide de la seringue Hamilton (recours aux soins avec la seringue de Hamilton que le baril est facilement cassé ou plié l&#39;aiguille). Suivant rincer la cellule d&#39;échantillon à plusieurs reprises avec 1,8 ml de tampon. Chargez la cellule d&#39;échantillon avec 1,8 ml de solution de macromolécule, en faisant attention à éviter la formation de bulles. </li><li> Remplissez la cellule de référence avec de l&#39;eau distillée. Pour la plupart des tampons, l&#39;eau distillée est bon d&#39;utiliser comme solution de référence. Cependant, pour des tampons avec notamment des forces ioniques élevées ou osmolalité, il est préférable d&#39;utiliser le tampon comme une référence. </li><li> Retirer les bulles d&#39;air à partir des cellules de référence et l&#39;échantillon en utilisant la seringue Hamilton. Déplacez doucement l&#39;aiguille de la seringue va-et-les côtés de la cellule de frapper toutes les bulles qui peuvent être au fond de la cellule et attachés à la même au sommet de la cellule. Retirez tout excès de volume de l&#39;échantillon et les cellules de référence. </li><li> Attacher une seringue en plastique à l&#39;orifice de remplissage de la seringue d&#39;injection à l&#39;aide de tubes. Rincer la seringue avec de l&#39;eau distillée. Suivez par un tampon de rinçage. Assurez-vous que la seringue d&#39;injection est complètement évacué en aspirant l&#39;air par le système. Placez l&#39;aiguille de la seringue dans la solution de ligand et dessiner la solution de ligand dans la seringue d&#39;injection jusqu&#39;à la seringue entière est pleine. Continuer le dessin un peu de volume en excès (environ 50 pi ou plus) dans le port et les tubes attachés. Fermer immédiatement l&#39;orifice de remplissage de la seringue et déconnecter la seringue tube en plastique. Purge et remplissage de la seringue d&#39;injection deux fois plus pour éliminer les bulles de la seringue. Retirer la seringue de la solution de ligand et essuyez le côté avec une Kimwipe pour enlever les gouttes, en faisant attention de ne pas toucher le bout de la seringue à l&#39;Kimwipe car cela peut enlever le volume de la seringue. Aussi, faites attention de ne pas frapper ou un bocal de la seringue car cela peut également causer la perte de volume à partir du bout de la seringue. Placez la seringue dans la cellule de l&#39;échantillon. </li><li> Configurez les paramètres pour l&#39;exécution du CCI. Pour les systèmes de liaison avec les signaux forte chaleur, un grand nombre d&#39;injections à faible volume donneront des points de données plus pour le montage (par exemple 75 injections de 3 pi). Pour les systèmes qui ont des signaux faibles de la chaleur, un petit nombre d&#39;injections grand volume sont préférables (par exemple 33 injections de 8 pi). Le plus souvent, moins d&#39;injections avec des volumes d&#39;injection plus élevées sont utilisées. Cela peut prendre plusieurs titrations d&#39;optimiser les conditions qui sont les meilleurs pour votre système. Il est important de noter que l&#39;enthalpie de liaison peuvent être soit exothermique ou endothermique, selon le système étudié. Malheureusement, certains systèmes ont des signaux à basse température, ce qui rend la chaleur de réaction difficile à déterminer. Problèmes avec de tels systèmes peuvent potentiellement être surmonté en augmentant la concentration de la macromolécule, en changeant la température de l&#39;expérience (en fonction de la capacité thermique du système de liaison), et / ou modifier le pH ou la force ionique du tampon. </li><li> Voir également l&#39;espacement de temps entre chaque injection. Il est impératif que après chaque injection de ligand, le système est donné le temps de s&#39;équilibrer et le signal de la chaleur revient à la normale avant l&#39;injection suivante se produit. Pour la plupart des systèmes, trois à cinq millesnutes devrait être suffisant. Le temps entre les injections doit être augmentée pour les systèmes où l&#39;équilibration ne se produit pas dans les cinq minutes. </li><li> Parce qu&#39;il y aura un certain mélange entre la macromolécule et solutions ligand dans la seringue une fois qu&#39;il est inséré dans la cellule d&#39;échantillon, la première injection donnera des résultats erronés. Il est préférable d&#39;utiliser de petits volumes (par exemple 2 pl) pour l&#39;un ou de deux premières injections (afin qu&#39;ils puissent plus tard être mis au rebut) et garder les injections suivantes, les valeurs souhaitées. </li><li> Choisissez la température de l&#39;expérience (à 25 ° C étant le plus commun, bien que des températures entre 2 et 80 ° C peut être utilisé). Il est préférable de choisir une température qui correspond à d&#39;autres expériences (reliure, cinétique, etc) effectuées sur le système ligand-macromolécule. L&#39;ITC peut être mis en place pour s&#39;équilibrer à une température différente de la température de l&#39;expérience. Si l&#39;expérience va être effectuée à une température supérieure à 10 ° C, hors de la température ambiante, alors il est préférable de régler la température d&#39;équilibration de l&#39;instrument dans les 5 ° C de la température expérimentale. Cela diminuera le temps de l&#39;instrument prendra pour atteindre la température de l&#39;expérience. La vitesse d&#39;agitation de la seringue doit également être envisagée. L&#39;agitation est nécessaire pour un mélange adéquat du ligand et macromolécule pendant le titrage, mais certaines protéines sont déstabilisés par une agitation rapide. Pour ces cas, la vitesse d&#39;agitation doit être fixé à un taux relativement faible. Une fois tous les paramètres expérimentaux ont été mis en place, puis l&#39;expérience peut être démarré. </li><li> Une fois l&#39;expérience terminée, l&#39;ITC peut être nettoyée selon le protocole du fabricant. La solution dans la cellule échantillon à la fin de l&#39;expérience peut être maintenu si les expériences complémentaires sur le mélange macromolécule-ligand sont souhaitées. </li><li> Répétez le titrage d&#39;au moins une ou deux fois plus pour obtenir des données reproductibles. Exécutez un contrôle où ligand est titré dans le buffer dans la cellule de l&#39;échantillon pour déterminer la chaleur de dilution pour le ligand. Pour certains systèmes où il est coopératif contraignante, des informations supplémentaires sur le processus de liaison peut être acquise par l&#39;injection de la macromolécule dans le ligand. Les orientations d&#39;injection différents peuvent donner des informations supplémentaires, qui peuvent être utiles pour le montage global. 6 </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Montage des données peut être facilement réalisée en utilisant des macros dans un programme des données d&#39;appareillage (généralement fourni par le fabricant avec l&#39;instrument). Chargez le fichier de données d&#39;abord. Vérifiez la thermogramme premières pour tous les signes de bulles d&#39;air ou d&#39;autres artefacts dans le signal. S&#39;il ya des artefacts (tels que des pointes dans la ligne de base ou des pics quand il n&#39;y avait pas d&#39;injection à ce point dans le temps), puis notez ces points de données tels qu&#39;ils devraient être supprimés. Ensuite, charger les données de dilution ligand de contrôle, et de soustraire les données de dilution ligand de l&#39;isotherme de liaison. À ce moment, supprimer tous les points de données fausses, y compris le ou les deux premiers points de données de titrage où des artefacts de dilution se produire (voir l&#39;étape 7). </li><li> Sélectionnez le modèle de données de montage (un site de liaison, deux / plusieurs sites de liaison, liaison coopérative, etc) pour être utilisé pour ajuster les données. Les données peuvent être adaptés aux estimations initiales des paramètres d&#39;ajustement, stœchiométrie (n), enthalpie (AH) et l&#39;affinité de liaison (Ka). Si la connaissance préalable de l&#39;affinité de liaison, ou d&#39;autres paramètres, est connu à partir d&#39;expériences orthogonaux, alors ces valeurs peuvent être saisies. Cela permet d&#39;éviter l&#39;ajustement devient piégé dans des minima locaux lors du montage. Une fois les données ont été adapté pour le premier titrage, répétez les étapes 15 et 16 pour le reste des isothermes. Alternativement, les données peuvent être adaptés au niveau mondial en utilisant des programmes tels que SEDPHAT. SEDPHAT 6 peut être particulièrement utile dans le montage global de binaires ensembles de données complexes (molécules à savoir A + B) en combinaison avec des ensembles de données complexes ternaires (molécules A + B + C). Par exemple, dans la liaison de C molécule à un complexe d&#39;AB, il n&#39;est pas toujours clair s&#39;il pouvait y avoir aucun signal due à la liaison de C à A ou de B à A (si A n&#39;est pas complètement saturée). </li><li> Afin de s&#39;assurer que les données ne sont pas artéfactuelle CCI, l&#39;affinité de liaison et de stoechiométries obtenus à partir de l&#39;ITC devraient être comparés à une méthode orthogonale 7,8. En outre, la valeur d&#39;enthalpie CCI peut être comparé à l&#39;enthalpie d&#39;une parcelle de Van&#39;t Hoff. 9 Il peut également s&#39;avérer utile d&#39;utiliser différentes concentrations du ligand ou macromolécule comme la valeur absolue du signal de la chaleur devrait augmenter avec la concentration croissante macromolécule. Les artefacts sont plus susceptibles de survenir si les tampons dans la cellule et la seringue ne sont pas appariés. Une autre possibilité pour les artefacts se pose à partir d&#39;échantillons impurs. </li><li> Nous recommandons que l&#39;utilisateur de commencer avec de simples binaires titrages complexes pour lesquels il ya des informations précédentes disponibles sur K d et stoichiometry. Ensuite, si les ligands se lient supplémentaires, l&#39;utilisateur peut essayer plus compliqué titrages complexe ternaire, en variant les concentrations de ligand, et peut-être passer la seringue et les composants cellulaires. Une comparaison des enthalpies pour les deux chemins à la formation de complexes ternaires devrait être additif comme enthalpie est une fonction d&#39;état. 10 Encore une fois, SEDPHAT 6 est susceptible d&#39;être très utile ici. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" /> Figure 1. Un exemple représentatif d&#39;un titrage bien comportés pour la liaison du cofacteur NADPH à E. coli chromosomiques dihydrofolate réductase (ecDHFR). Panneau (A) représente le thermogramme premières; (B), l&#39;isotherme de liaison de l&#39;ajustement thermogramme intégrés en utilisant le modèle d&#39;un site dans le logiciel Origin, et (C) l&#39;ajustement de l&#39;isotherme en utilisant le modèle d&#39;un site de liaison le long SEDPHAT avec résidus ajustement. À partir du logiciel d&#39;origine, en utilisant le modèle à un site de liaison, n = 1,09 ± 0,02, K d = 0,194 ± 0,001 uM, AH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, et Ag = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. S&#39;adapte sur les données en utilisant Sedphat s&#39;offrir un n de 0,94 ± 0,01, un Kd de 0,195 ± 0,013 Am, un AH de -22,5 ± 0,2 kcal / mol, TΔS de -13,39 kcal / mol et d&#39;Ag -9,15 kcal / mol.

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+ferredoxin+binding+to+ferredoxin:NADP++reductase+and+the+role+of+water+at+the+complex+interface.">Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface.</a> Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).</li><li>Burrows, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+monomer-dimer+equilibrium+of+interleukin-8+reveals+it+is+a+monomer+at+physiological+concentration.">Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration.</a> Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).</li><li>Baker, B. M., Murphy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry.">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

CCI a été largement utilisé dans l&#39;étude des interactions ligand macromolécule, 11 avec des études portant sur ​​la protéine-ligand, ADN-ligand 12 13 et de l&#39;ARN-macromolécule 14 études. CCI peut même être utilisée avec des matériaux solides, comme les nanoparticules, qui forment des suspensions uniforme. 15 De plus, les systèmes ternaires, où un ligand est déjà lié à la macromolécule et un second ligand est titré, peut être utilisée pour déterminer la thermodynamique, par Par exemple, la liaison du substrat à un système enzymatique cofacteur. 7 Les études peuvent aussi être effectués pour des molécules à très haute affinité de liaison qui serait normalement pas dépasser la limite de détection de l&#39;ITC en effectuant des dosages de liaison par compétition avec les plus faibles ligands contraignant. 16 Renseignements sur les faiblement contraignante ligands peuvent également être obtenues par des essais de compétition. 17 Le rôle de l&#39;eau dans la liaison peut être exploré par le CCI, 18 ainsi que la dépendance de l&#39;enthalpie sur la réorganisation du solvant. 19 Récemment, la thermodynamique des changements de conformation des variantes DNAK ont été mesurés lors de la liaison des ADP et l&#39;ATP. 20 protéine-protéine d&#39;association peut être étudiée par le CCI, ce qui donne des informations sur des complexes hétéro 21 ainsi que sur l&#39;homo-association. 22 effets de la température sur l&#39;enthalpie contraignante donnera la capacité thermique de l&#39;événement de liaison. 2 Le nombre de protons absorbée ou libérée lors de la liaison peut également être déterminée à partir d&#39;expériences réalisées dans des tampons avec des enthalpies d&#39;ionisation différents. 5 Si des études supplémentaires sont CCI fait à différentes valeurs de pH, le pKa du groupe impliqué peut potentiellement être déterminée. 23 Pour résumer, des mesures précises de la concentration de la macromolécule et le ligand est impératif pour une expérience de l&#39;ITC bon. Concentrations dans l&#39;échantillon ont également besoin d&#39;être dans une fourchette appropriée pour obtenir des données fiables. Des précautions doivent être prises avec le tampon sous forme d&#39;impuretés à petites molécules et l&#39;inadéquation du pH se traduit artefacts dans le thermogramme.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> 1,7 ml microtubes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 ml tubes Falcon </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 959-49B </td></tr><tr><td> 2,5 ml seringue Hamilton </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity

Calorimétrie de titrage isotherme (ITC) est un outil utile pour la compréhension de l&#39;image complète d&#39;un thermodynamiques réaction de liaison. Dans les sciences biologiques, les interactions macromoléculaires sont essentielles dans la compréhension de la machinerie de la cellule. Les conditions expérimentales, tel que le tampon et la température, peuvent être adaptés au système de liaison particulière à l&#39;étude. Cependant, une planification minutieuse est nécessaire car certains ligands et des plages de concentration macromolécule sont nécessaires pour obtenir des données utiles. Les concentrations de la macromolécule et le ligand besoin d&#39;être déterminée avec précision pour des résultats fiables. Un soin particulier doit également être prises lors de la préparation des échantillons sous forme d&#39;impuretés peuvent influer considérablement sur l&#39;expérience. Lorsque expériences CCI, avec les contrôles, sont effectuées correctement, les informations utiles contraignants, tels que la stoechiométrie, l&#39;affinité et l&#39;enthalpie, sont obtenus. En effectuant des expériences supplémentaires en vertu de tampon ou de conditions différentes de température, des informations plus détaillées peuvent être obtenues sur le système. Un protocole pour la configuration de base d&#39;une expérience ITC est donné.

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Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Un protocole général pour l&#39;utilisation de la calorimétrie de titration isotherme pour surveiller la thermodynamique contraignante pour les systèmes biologiques avec les modérés affinités de liaison est présenté.

Calorimétrie titration isotherme pour Mesure macromolécules-ligand d&#39;affinité

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

isothermal-titration-calorimetry-for-measuring-macromolecule-ligand

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52.7K vues.  University of Tennessee. Un protocole général pour l'utilisation de la calorimétrie de titration isotherme pour surveiller la thermodynamique contraignante pour les systèmes biologiques avec les modérés affinités de liaison est présenté.

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Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

Le titrage de coronavirus humains en utilisant un dosage immunoperoxydase

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

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Biologie

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Mesure de la rigidité à la flexion des cellules bactériennes utilisant un piège optique

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

Collecte variable de concentration isotherme ensembles de données de titrage calorimétrique afin de déterminer des mécanismes de liaison

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Titration biochimique de glycogène<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Isolation basée sur l&#39;affinité de Tagged noyaux de<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Le titrage à haut débit de la luciférase-virus recombinants exprimant

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

Mesure<em&gt; In vitro</em&gt; Activité ATPase pour Enzymatic Caractérisation

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree of compositional heterogeneity of a complex do not usually impede progress in conducting such studies. In contrast, a complex intended for structural characterization should be purified in a state that is both compositionally and structurally homogeneous as well as at a higher concentration than required for proteomics. Recently, there have been significant advances in the application of electron microscopy for structure determination of large macromolecular complexes. This has heightened interest in approaches to purify native complexes of sufficient quality and quantity for structural determination by electron microscopy. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been optimized to extract and purify an 18-subunit, ~ 0.8 MDa ribonucleoprotein assembly from budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) suitable for negative stain and electron cryo microscopy. Herein is detailed the modifications made to the TAP method, the rationale for making these changes, and the approaches taken to assay for a compositionally and structurally homogeneous complex.

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Purification de Native Complexes pour l&#39;étude structurale utilisant une méthode de Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

Calorimétrie titration isotherme pour Mesure macromolécules-ligand d'affinité

Résumé

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Le titrage de coronavirus humains en utilisant un dosage immunoperoxydase

Mesure de la rigidité à la flexion des cellules bactériennes utilisant un piège optique

Collecte variable de concentration isotherme ensembles de données de titrage calorimétrique afin de déterminer des mécanismes de liaison

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

Titration biochimique de glycogène

Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante

Isolation basée sur l'affinité de Tagged noyaux de

Le titrage à haut débit de la luciférase-virus recombinants exprimant

Mesure

Purification de Native Complexes pour l'étude structurale utilisant une méthode de Tag Tandem Affinity