La spécialité engrais Products Company (SFP) est reconnu pour fournir les fonds nécessaires pour cette étude.

Une. Préparation des échantillons <ol><li> Préparer 2 ml de solution d&#39;enzyme et 0,5 ml d&#39;une solution de substrat pour chaque série expérimentale. Diluer les solutions mères concentrées de l&#39;enzyme et du substrat dans des solutions tampons ayant une composition identique à minimiser la chaleur de dilution et de mélange au cours de l&#39;addition du substrat. <ol><li> Choisissez les conditions de tampon qui sont adéquates pour prévenir les changements de pH pendant l&#39;expérience. Par exemple, 20 mM HEPES pH 7 est adéquate pour des mesures à pH neutre. REMARQUE: si l&#39;échange de proton est impliquée, les enthalpies de protonation des tampons utilisés doivent être considérées, car elles affectent l&#39;AH de mesure de la réaction. Effets spécifiques possibles du tampon ou des molécules des additifs sur le système en cours d&#39;analyse doivent être pris en compte. Si des solvants organiques (par exemple le DMSO) sont inclus dans la solution d&#39;enzyme, les ajouter à la même concentration dans la solution de substrat. </li><li> Pour l&#39;expérience M1, commenceravec la concentration d&#39;enzyme dans la plage nM (par exemple de 1 nM) et avec une concentration de substrat d&#39;au moins trois ordres de grandeur plus élevée que la concentration en enzyme et au-dessus de la K M. </li><li> Pour l&#39;expérience M2, commencer avec la concentration de l&#39;enzyme dans la gamme pM-nM (par exemple 15 heures). concentration du substrat dans la seringue est dans la gamme mM (par exemple, 400 mM). NOTE: Dans l&#39;expérience unique d&#39;injection M1, les concentrations devraient être suffisants pour obtenir la conversion de substrat totale dans le produit au cours de la durée de l&#39;essai. Par conséquent, la concentration de l&#39;enzyme dépend de la vitesse de l&#39;enzyme: si les enzymes ayant un faible k cat sont à l&#39;étude, les concentrations d&#39;enzymes élevés (jusqu&#39;à 10 uM) doivent être utilisés. D&#39;autre part, les concentrations enzymatiques utilisées dans l&#39;expérience M2 doivent assurer que le substrat est injecté seulement marginalement (moins de 5%) consommée et que la réaction enzymatique se déroule à l&#39;état d&#39;équilibre. Pour cette raison, plus lal&#39;efficacité de l&#39;enzyme, plus faible est la concentration de l&#39;enzyme nécessaire. A la fin de l&#39;expérience, la concentration du substrat dans la cellule d&#39;échantillonnage doit être supérieure à K M. </li></ol></li><li> Vérifiez soigneusement enzyme et des concentrations de substrat avec une méthode d&#39;analyse appropriée (par exemple l&#39;absorption à 280 nm, colorimétriques, les dosages de BCA 11. Cela est nécessaire pour obtenir un calcul précis et fiable des paramètres thermodynamiques et cinétiques. </li><li> Mesurer le pH des solutions et vérifier que le décalage de pH à la fois l&#39;enzyme et les solutions de substrat est minimale dans les conditions expérimentales (± 0,05 unité de pH). </li></ol> 2. Exécution de l&#39;expérience REMARQUE: La même procédure doit être appliquée à la fois pour le M1 et M2 de l&#39;expérience, qui sont réalisées l&#39;une après l&#39;autre. <ol><li> Vérifier que la cellule d&#39;échantillonnage et de la seringue d&#39;injection sont nettoyés après le fabricant deinstructions. Remplir la seringue de chargement fournie avec l&#39;instrument à l&#39;eau distillée, insérez délicatement l&#39;aiguille dans la cellule de l&#39;échantillon, remplir la cellule et enlever le liquide en utilisant la même seringue. En utilisant cette méthode, laver la cellule d&#39;échantillonnage deux fois avec de l&#39;eau distillée et deux fois avec le tampon. </li><li> Charger la cellule d&#39;échantillonnage avec 2 ml de solution d&#39;enzyme à l&#39;aide de la seringue de chargement, en évitant soigneusement formation de bulles d&#39;air. Injecter lentement la solution dans la cellule jusqu&#39;à ce qu&#39;il se déverse sur la partie supérieure de la tige de la cellule. Produire une poussée de ca. 0,25 ml de solution dans la cellule. Répéter deux fois. Cette étape élimine les bulles d&#39;air piégées dans la cellule d&#39;échantillon. </li><li> Placer l&#39;aiguille de la seringue de chargement sur le rebord entre la tige de la cellule et l&#39;orifice de la cellule et retirer tout excès de solution. </li><li> Démarrez le programme VP-Viewer et, à partir de l&#39;interface de l&#39;ordinateur, équilibrer l&#39;instrument ITC à une température de 3 ° C en dessous de la température expérimentale souhaitée. Cela est nécessaire pour éviter les longues équilibrationles périodes antérieures à l&#39;expérience, à cause de l&#39;appareil de refroidissement passif instrumentale. </li><li> Remplir la cellule de référence avec de l&#39;eau distillée avec le même mode opératoire ci-dessus. Lorsque les tampons ayant une force ionique élevée ou élevée sont osmolalité dans la solution d&#39;échantillon, le même tampon doit être utilisé en tant que solution de référence. </li><li> Relier une seringue en plastique à l&#39;orifice de remplissage de la seringue d&#39;injection, à l&#39;aide d&#39;un tube mince de silicium. Remplir la seringue d&#39;injection de placer la pointe de l&#39;aiguille dans l&#39;eau et en tirant vers le haut, jusqu&#39;à ce que l&#39;eau qui sort de l&#39;orifice de remplissage par le haut, ce qui indique que la seringue d&#39;injection est remplie. Déplacez ensuite le bout de la seringue de l&#39;eau et dresser l&#39;air, pour vider la seringue d&#39;injection. Avec cette procédure, laver la seringue d&#39;injection avec un tampon, et aspirer l&#39;air à travers le système. Par la suite, placer l&#39;aiguille d&#39;injection dans un tube étroit contenant 0,5 ml de solution de substrat, soigneusement élaborer et de remplir complètement la seringue d&#39;injection, ce qui laisse peu de solution au fond du tube. </li><li> De l&#39;interface de l&#39;ordinateur, appuyez sur &quot;Fermer remplissage port&quot;. Retirer le tube de chargement de silicium. Appuyez sur &quot;Purge et recharge&quot; pour permettre à la seringue d&#39;injection pour déloger les bulles d&#39;air et de les expulser de nouveau dans la solution globale. Répéter deux fois. </li><li> Déplacer la seringue d&#39;injection, essuyer sur les côtés pour enlever les gouttes et placer l&#39;aiguille de la seringue d&#39;injection dans la cellule d&#39;échantillon. </li><li> Sur l&#39;ordinateur, définissez les paramètres de fonctionnement appropriés. L&#39;enzyme expérimental et des concentrations en substrat peuvent être indiquées. <ol><li> Dans l&#39;expérience M1, mettre au moins deux ajouts (5-30 pi) de substrat pour vérifier la reproductibilité. Réglez l&#39;heure de l&#39;espacement entre chaque injection (par exemple 1000 sec) suffisamment large pour assurer que les retours de signaux de chaleur à la ligne de base avant la prochaine addition. </li><li> Dans l&#39;expérience M2, mis multiple (par exemple 15 x 5-10 pi) injections. Définissez l&#39;intervalle entre les injections (par exemple 180 sec) permettant au système de stabilize la puissance thermique à la nouvelle ligne de base après chaque injection. NOTE: Le temps d&#39;espacement entre les injections dans l&#39;expérience M2 doit être suffisamment courte pour éviter la conversion d&#39;une quantité importante de substrat, ce qui permet les mesures soient effectuées dans des conditions de régime permanent. </li><li> Dans l&#39;expérience M2, utiliser de petits volumes (par exemple 2 pi) pour la première injection, dont la valeur correspondante est éliminée au cours de l&#39;analyse ultérieure des données. En effet, il présente souvent des artefacts dus à la diffusion initiale de substrat à travers l&#39;embout de la seringue, et pour la présence de bulles d&#39;air emprisonnées dans l&#39;aiguille de la seringue. </li><li> Réglez la puissance de référence, le niveau approximatif dans lequel la ligne de base sera placé avant la réaction commence, à une valeur de 20. Définissez ensuite l&#39;enzyme expérimental et des concentrations de substrat et choisir un nom pour l&#39;expérience. </li><li> Définir la température expérimentale, typiquement à 25 ° C. ITC permet des températures de travail entre 2<html> ° C et 80 ° C. L&#39;expérience est prêt pour l&#39;exécution. Appuyez sur le bouton &quot;Démarrer&quot; pour lancer l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Une fois l&#39;expérience terminée, nettoyer la cellule d&#39;échantillonnage et la seringue selon les instructions du fabricant. </li><li> Répétez l&#39;expérience au moins une ou deux fois de plus pour vérifier la reproductibilité des données. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Dans le programme d&#39;analyse, cliquez sur le bouton &quot;Lecture des données&quot;, et naviguez vers le dossier où le fichier de l&#39;expérience réalisée M2. Itc est situé. Cliquez sur la flèche déroulante de la &quot;Type de fichiers&quot; et sélectionnez &quot;Enzyme Assay (il?)&quot;. Par la suite, cliquez sur et ouvrez le fichier de l&#39;expérience M2. Itc. </li><li> Obtenir l&#39;AH de la réaction à partir de l&#39;intégration de la courbe de l&#39;expérience M1 conformément à l&#39;équation 5. &quot;Width =&quot; 126 &quot;/&gt; (5) <ol><li> Cliquez sur le bouton &quot;Lecture des données&quot;, et sélectionnez le fichier. CCI de l&#39;expérience M1 effectué. Utilisation origine, diviser la trace dans différentes parties contenant un pic pièce et économisez chaque pic en tant que fichier OPJ.. Ouvrir le fichier correspondant au premier pic, résultant de la déviation de référence dans le thermogramme de l&#39;expérience unique M1 d&#39;injection, intégrer et diviser la valeur de la surface obtenue, exprimée en μcal, par la concentration finale en substrat dans la cellule de l&#39;échantillon, exprimée en uM, et par le volume de cellule exprimé en litres, la détermination, conformément à l&#39;équation 5, l&#39;AH de la réaction. </li><li> Répétez la même procédure pour le deuxième pic de l&#39;expérience M1 et obtenir une valeur moyenne pour les deux mesures de AH. </li></ol></li><li> Déterminer dQ / dt à partir de l&#39;expérience M2 mesurer la différence entre la valeur de référence initiale et la nouvelle ligne de base après chaque injection. Convertir le eXperimental données à des vitesses de réaction en fonction de l&#39;équation 4, en utilisant la valeur de l&#39;enthalpie obtenue dans l&#39;expérience M1 et accrocher les données à l&#39;équation de Michaelis-Menten. <ol><li> Dans le programme d&#39;analyse, cliquez sur le bouton &quot;Lecture des données&quot;, et sélectionnez le fichier. CCI de l&#39;expérience réalisée M2. Cliquez sur la flèche déroulante de la &quot;Type de fichiers&quot; et sélectionnez &quot;Enzyme Assay (il?)&quot;. </li><li> La boîte de dialogue Enzyme Assay s&#39;ouvre, permettant la sélection de l&#39;un des quatre modèles. Sélectionnez &quot;Méthode 2 - Substrat seulement&quot; de la fenêtre. </li><li> Dans la fenêtre AH, indiquer la valeur de AH obtenu à l&#39;étape 4.2. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;Concentration&quot; pour vérifier les valeurs de concentration pour être utilisé dans la procédure d&#39;ajustement. Cliquez sur le bouton &quot;Temps moyen (P)&quot;. La boîte de dialogue s&#39;ouvre donnant la possibilité de changer ou accepter la valeur par défaut. Cette valeur représente le temps avant chaque injectionion, dans lequel les moyennes de l&#39;appareil le signal de puissance pour déterminer le niveau de puissance à chaque concentration de substrat. Cliquez sur OK pour confirmer la valeur par défaut. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;zéro Axe Y&quot;. Le curseur se transforme en une croix permettant de double-cliquer sur un point, de mettre à y = 0. Double-cliquez juste avant le premier point d&#39;injection. </li><li> Cliquez sur le bouton Calculer Taux d&#39;. Rate est tracée en fonction de la concentration du substrat, obtenu en divisant le substrat ajouté au cours du titrage pour le volume de la cellule de l&#39;échantillon (en tenant compte des effets de dilution). Cette opération donne un terrain typique de Michaelis-Menten qui peut être monté pour obtenir K M et k cat. </li><li> Si certains points doivent être supprimés, cliquez sur le bouton &quot;Tronquer données&quot;. Déplacez les marqueurs de données pour exclure les points de données mauvaises et double-cliquez sur un des marqueurs ou appuyez sur Entrée. </li><li> Utilisez la fonction &quot;Ajuster à modéliser&quot; pour s&#39;adapter à la courbe et àobtenir les constantes cinétiques. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;importance de l&#39;ITC pour étudier l&#39;activité enzymatique par rapport aux méthodes existantes En plus de ses applications classiques pour étudier les équilibres de liaison, calorimétrie de titration isotherme offre une méthode fiable et rapide pour caractériser les réactions enzymatiques en solution en utilisant la chaleur de réaction comme une sonde, sans nécessiter de modification ou l&#39;étiquetage système. Les paramètres cinétiques kc...

La détermination quantitative de réactions biochimiques permet de mieux comprendre les processus biologiques à la base de la vie. Calorimétrie propose une méthodologie sans étiquette pour caractériser quantitativement pratiquement toutes les réactions chimiques en solution. Cette technique mesure la chaleur dégagée ou absorbée au fil du temps, et est donc un système de détection universel et une méthodologie très pratique pour quantifier la quantité de molécules réagissant (c.-à-thermodynamique de liaison), ainsi que pour mesurer la vitesse de réaction (c.-à-cinétique). En particulier, calorimétrie de titration isotherme (ITC) a été adopté comme méthode de choix pour caractériser la thermodynamique des équilibres biomoléculaires, impliquant la protéine-ligand, protéine-protéine, protéine-ions métalliques et des interactions protéine-ADN 1-6. En outre, la capacité de l&#39;ITC de fournir des informations cinétique en fait un système très puissant pour mesurer la catalyse enzymatique, bien que le potentiel de cette application est encoresous-estimé 7-9. L&#39;équation de Michaelis-Menten 10 est une description quantitative des réactions enzymatiques, car il fournit une relation entre la vitesse de réaction et la concentration du substrat, en fonction de deux paramètres cinétiques: la constante de Michaelis (K M) et la constante de vitesse catalytique (k cat) . Le k cat / rapport K M est mentionné comme l&#39;efficacité catalytique d&#39;une enzyme. Dans la pratique, la détermination de K et M k cat pour une réaction spécifique fournit une description complète de la catalyse. Dans une réaction enzymatique typique (figure 1), un substrat (S) interagit avec l&#39;enzyme (E) la formation du complexe enzyme-substrat (ES), qui est ensuite activé dans l&#39;état de transition (ES *). Celui-ci est converti en le complexe enzyme-produit (EP) qui se dissocie éventuellement. Ces étapes sont décrits par la réaction suivante. <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> (1) où k 1 est la constante de vitesse pour la formation du complexe ES, k-1 est la constante de vitesse de la dissociation du complexe ES, tandis que k cat est la constante de vitesse catalytique ou le numéro de chiffre d&#39;affaires. Selon l&#39;équation de Michaelis-Menten 10, la vitesse de la réaction peut être calculé comme suit: <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> (2) dans laquelle K = M (k-1 + k cat) / k 1 et k cat = v max / [E], avec v max étant la vitesse maximale atteinte lorsque tous enzyme est lié au substrat. La titration calorimétrique isotherme est l&#39;instrument utilisé dans cette étude pour caractériser l&#39;hydrolyse enzymatique de l&#39;urée. Cet instrument est constitué d&#39;un écran adiabatique contenant deux cellules en forme frappées (figure 1). Ceux-ci sont connectés à l&#39;extérieur par des tubes d&#39;accès étroits. La cellule de l&#39;échantillon (environ 1,4 ml) est chargé avec la solution d&#39;enzyme, tandis que la cellule de référence est généralement remplie avec de l&#39;eau ou avec le solvant utilisé pour l&#39;analyse. Une seringue en rotation avec une longue aiguille et une palette d&#39;agitation attaché, contenant habituellement ca. 0,3 ml de solution de substrat, est monté sur la cellule d&#39;échantillon. Un dispositif thermoélectrique mesure la différence de température entre l&#39;échantillon et la cellule de référence et, à l&#39;aide d&#39;un &quot;réseau de contre-réaction de la cellule&quot;, il maintient cette différence à zéro par addition ou soustraction de chaleur. Pendant l&#39;expérience, le substrat est injecté dans la solution d&#39;enzyme à une température constante choisie. Lorsque la sallezymatic réaction a lieu, la quantité de chaleur libérée ou absorbée est proportionnelle au nombre de molécules de substrat qui sont converties en molécules de produit. En outre, le taux de flux de chaleur est directement liée à la vitesse de la réaction. Les données mesurées, apparaissant comme un écart de la trace de la chaleur à partir de la ligne de base initiale (figure 1), représentent la puissance thermique (μcal / sec) fournie par l&#39;instrument de la cellule d&#39;échantillon, qui est proportionnel au flux de chaleur se produisant dans la cellule d&#39;échantillonnage au fil du temps. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Représentation schématique de titration calorimétrique isotherme d&#39;étudier les réactions enzymatiques. Une réaction enzymatique se produisant lors de la titration de substrat (dans la seringue d&#39;injection) dans la solution d&#39;enzyme (dans la cellule d&#39;échantillon) a pour résultat un changement de la therpuissance mal dégagée par le calorimètre, nécessaire pour maintenir la différence de température entre la cellule de l&#39;échantillon et la constante de la cellule de référence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> Dans l&#39;ensemble, le changement de chaleur (Q) est proportionnelle à l&#39;enthalpie molaire de la réaction (AH) et le nombre de moles de produit généré (n), qui à son tour est donné par le temps de volume total de la concentration: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> (3) La formation de produit avec le temps (dP / dt), qui correspond à la vitesse de la réaction, peut ainsi être liée à la quantité de chaleur engendrée pendant la même période (dQ / dt) par la relation: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> (4) Selon cette équation, afin d&#39;obtenir un Michaelis-Menten Parcelle il est nécessaire de mesurer i) l&#39;enthalpie molaire totale AH, et ii) l&#39;écoulement dQ / dt de la chaleur à différentes concentrations de substrat. Habituellement, ceci est effectué dans deux expériences différentes: dans la première expérience (méthode 1, M1), le substrat est injecté dans la solution d&#39;enzyme et de la chaleur pour la conversion complète du substrat est mesurée; dans la seconde expérience (méthode 2, M2), de multiples injections de substrat sont effectuées et le taux de production de chaleur est mesuré à différentes concentrations de substrat. Ces deux ensembles de données sont suffisantes pour calculer les paramètres cinétiques K M et k cat. Dans le présent article, un protocole général pour déterminer les paramètres cinétiques pour les réactions enzymatiques réalisées à l&#39;aide ITC est décrite. Nous avons appliqué la méthode à hydrolyse de l&#39;urée par Canavalia de l&#39;uréesoi, comme un système de référence. Le bon accord entre les résultats obtenus en utilisant cette méthode et les données rapportées dans la littérature démontre la fiabilité de cette approche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:323px;">dissolving in water and adjusting pH with NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">TRIZMA-Base</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td>dissolving in water and adjusting pH with HCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">4270</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">30427</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Urea</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U4128</td>
			<td>dissolving in water at 40 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Canavalia ensiformis urease (type C-3)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U0251</td>
			<td>dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VP-ITC on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">SYS13901</td>
			<td>instrument&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>data acquisition software supplied with the instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hot biological catalysis: isothermal titration calorimetry to characterize enzymatic reactions

Calorimétrie de titration isotherme (ITC) est une technique bien décrite qui mesure la chaleur dégagée ou absorbée au cours d&#39;une réaction chimique, en l&#39;utilisant comme une sonde intrinsèque de caractériser pratiquement tous les processus chimiques. De nos jours, cette technique est largement utilisée pour déterminer des paramètres thermodynamiques des équilibres de liaison biomoléculaires. En outre, le CCI a été démontré pour être en mesure de mesurer directement la cinétique et les paramètres thermodynamiques (k chat, K M, AH) de réactions enzymatiques, même si cette application est encore sous-exploité. Comme les changements thermiques se produisent spontanément au cours de la catalyse enzymatique, le CCI ne nécessite aucune modification ou l&#39;étiquetage du système en cours d&#39;analyse et peut être réalisée en solution. En outre, le procédé a besoin de peu de quantité de matière. Ces propriétés font de l&#39;ITC un outil précieux, unique et puissant pour étudier la cinétique enzymatique dans plusieurs applications, telles que, par exemple, la découverte de médicaments. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Dans ce travail, une méthode basée sur ITC expérimentale pour quantifier la cinétique et la thermodynamique des réactions enzymatiques est décrit en détail. Cette méthode est appliquée pour déterminer k cat M et K de l&#39;hydrolyse enzymatique de l&#39;urée par Canavalia ensiformis (jack bean) uréase. Calcul de l&#39;enthalpie molaire intrinsèque (AH int) de la réaction est effectuée. Les valeurs ainsi obtenues sont en accord avec les données précédentes rapportés dans la littérature, ce qui démontre la fiabilité de la méthode.

Uréase (CE 3.5.1.5; urée amidohydrolase) est une enzyme contenant du nickel unités multiples trouvée dans archées, les bactéries, eucaryotes unicellulaires et les plantes. Ceci agit de protéines dans la dernière étape de minéralisation de l&#39;azote organique, catalysant l&#39;hydrolyse de l&#39;urée en ammoniac et de carbamate, qui se décompose spontanément pour donner une deuxième molécule d&#39;ammoniac et de bicarbonate (Equation 6) 12. <img fo:...

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Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Flux de chaleur des mesures de calorimétrie isotherme titrage libéré ou absorbé dans les réactions chimiques. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier la catalyse enzymatique. Dans ce document, le protocole pour la configuration instrumentale, expérience en cours d&#39;exécution, et l&#39;analyse des données est généralement décrite, et appliquée à la caractérisation des enzymatique hydrolyse de l&#39;urée par l&#39;uréase jack bean.

Hot Catalyse biologique: calorimétrie de titration isotherme pour caractériser enzymatiques Réactions

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

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20.4K vues.  University of Bologna.  Flux de chaleur des mesures de calorimétrie isotherme titrage libéré ou absorbé dans les réactions chimiques. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier la catalyse enzymatique. Dans ce document, le protocole pour la configuration instrumentale, expérience en cours d'exécution, et l'analyse des données est généralement décrite, et appliquée à la caractérisation des enzymatique hydrolyse de l'urée par l'uréase jack bean. 

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Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle diameters ranging from 30-250 nm by varying the reaction conditions. Through the selection of a microwave compatible solvent, silicic acid precursor, catalyst, and microwave irradiation time, these microwave-assisted methods were capable of overcoming the previously reported shortcomings associated with synthesis of silica nanoparticles using microwave reactors. The siloxane precursor was hydrolyzed using the acid catalyst, HCl. Acetone, a low-tan &#948; solvent, mediates the condensation reactions and has minimal interaction with the electromagnetic field. Condensation reactions begin when the silicic acid precursor couples with the microwave radiation, leading to silica nanoparticle sol formation. The silica nanoparticles were characterized by dynamic light scattering data and scanning electron microscopy, which show the materials&#39; morphology and size to be dependent on the reaction conditions. Microwave-assisted reactions produce silica nanoparticles with roughened textured surfaces that are atypical for silica sols produced by St&#246;ber&#39;s methods, which have smooth surfaces.

Silica nanoparticles were prepared using acid-catalysis of a siloxane precursor and microwave-assisted synthetic techniques resulting in the controlled growth of nanomaterials ranging from 30-250 nm in diameter. The growth dynamics can be controlled by varying the initial silicic acid concentration, time of the reaction, and temperature of reaction.

Préparation de nanoparticules de silice Grâce assistée par micro-ondes acide catalyse

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Recherche

Chimie

Retropinacol/Cross-pinacol Coupling Reactions - A Catalytic Access to 1,2-Unsymmetrical Diols

Unsymmetrical 1,2-diols are hardly accessible by reductive pinacol coupling processes. A successful execution of such a transformation is bound to a clear recognition and strict differentiation of two similar carbonyl compounds (aldehydes &#8594; secondary 1,2-diols or ketones &#8594; tertiary 1,2-diols). This fine-tuning is still a challenge and an unsolved problem for an organic chemist. There exist several reports on successful execution of this transformation but they cannot be generalized. Herein we describe a catalytic direct pinacol coupling process which proceeds via a retropinacol/cross-pinacol coupling sequence. Thus, unsymmetrical substituted 1,2-diols can be accessed with almost quantitative yields by means of an&#160;operationally simple performance under very mild conditions. Artificial techniques, such as syringe-pump techniques or delayed additions of reactants are not necessary. The procedure we describe provides a very rapid access to cross-pinacol products (1,2-diols, vicinal diols). A further extension of this new process, e.g. an enantioselective performance could provide a very useful tool for the synthesis of unsymmetrical chiral 1,2-diols.

A novel account for the synthesis of unsymmetrical 1,2-diols based on a retropinacol/cross-pinacol coupling mechanism is described. Due to the catalytic execution of this reaction a considerable improvement compared to conventional cross-pinacol couplings is achieved.

Retropinacol / Croix-pinacol réactions de couplage - Un accès catalytique de 1,2-diols asymétriques

Unsymmetrical 1,2-diols are hardly accessible by reductive pinacol coupling processes. A successful execution of such a transformation is bound to a clear ...

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family of easy accessible, very cheap, and air stable, but highly active and universally applicable C-C cross-coupling catalysts with an excellent functional group tolerance. Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium [(P(NC5H10)3)2Pd(Cl)2] (1), the least stable complex within this series towards protons; e.g. in the form of water, allows an eased nanoparticle formation and hence, proved to be the most active Heck catalyst within this series at 100 &#176;C and is a very rare example of an effective and versatile catalyst system that efficiently operates under mild reaction conditions. Rapid and complete catalyst degradation under work-up conditions into phosphonates, piperidinium salts and other, palladium-containing decomposition products assure an easy separation of the coupling products from catalyst and ligands. The facile, cheap, and rapid synthesis of 1,1',1"-(phosphinetriyl)tripiperidine and 1 respectively, the simple and convenient use as well as its excellent catalytic performance in the Heck reaction at 100 &#176;C make 1 to one of the most attractive and greenest Heck catalysts available.
We provide here the visualized protocols for the ligand and catalyst syntheses as well as the reaction protocol for Heck reactions performed at 10 mmol scale at 100 &#176;C and show that this catalyst is suitable for its use in organic syntheses.

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1&#039;,1&#039;&#039;-phosphinetriyltripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium [(P(NC5H10)3)2Pd(Cl)2] (1) is an easy accessible, cheap, and air stable, but highly active Heck catalyst with an excellent functional group tolerance that efficiently operates under mild reaction conditions to give the coupling products in very high yields.

Mizoroki-Heck réactions de couplage croisé catalysées par Dichloro {bis [1,1 &#39;, 1&#39;&#39; - (phosphinetriyl) tripiperidine]} palladium Sous légère réaction Conditions

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family ...

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. Recycling of the electron donors NADH or NADPH requires the use of additional enzymes and sacrificial substrates. Interestingly, several oxidoreductases accept hydrogen peroxide as electron donor. While being inexpensive, this reagent often reduces the stability of enzymes. A solution to this problem is the in situ generation of the cofactor. The continuous supply of the cofactor at low concentration drives the reaction without impairing enzyme stability. This paper demonstrates a method for the light-catalyzed in situ generation of hydrogen peroxide with the example of the heme-dependent fatty acid decarboxylase OleTJE. The fatty acid decarboxylase OleTJE was discovered due to its unique ability to produce long-chain 1-alkenes from fatty acids, a hitherto unknown enzymatic reaction. 1-alkenes are widely used additives for plasticizers and lubricants. OleTJE has been shown to accept electrons from hydrogen peroxide for the oxidative decarboxylation. While addition of hydrogen peroxide damages the enzyme and results in low yields, in situ generation of the cofactor circumvents this problem. The photobiocatalytic system shows clear advantages regarding enzyme activity and yield, resulting in a simple and efficient system for fatty acid decarboxylation.

We describe a protocol for the light-catalyzed generation of hydrogen peroxide &#8212; a cofactor for oxidative transformations.

Lumière-driven Enzymatic décarboxylation

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of metabolic transformations. Hyperpolarization via dissolution DNP circumvents part of the sensitivity issues thanks to the large out-of-equilibrium nuclear magnetization stemming from the electron-to-nucleus spin polarization transfer. The high NMR signal obtained can be used to monitor chemical reactions in real time. The downside of hyperpolarized NMR resides in the limited time window available for signal acquisition, which is usually on the order of the nuclear spin longitudinal relaxation time constant, T1, or, in favorable cases, on the order of the relaxation time constant associated with the singlet-state of coupled nuclei, TLLS. Cellular uptake of endogenous molecules and metabolic rates can provide essential information on tumor development and drug response. Numerous previous hyperpolarized NMR studies have demonstrated the relevancy of pyruvate as a metabolic substrate for monitoring enzymatic activity in vivo. This work provides a detailed description of the experimental setup and methods required for the study of enzymatic reactions, in particular the pyruvate-to-lactate conversion rate in presence of lactate dehydrogenase (LDH), by hyperpolarized NMR.

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

Dissolution Polarisation Dynamique Nucléaire Instrumentation pour en temps réel la vitesse de réaction enzymatique mesures par RMN

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

A Protocol for Safe Lithiation Reactions Using Organolithium Reagents

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents warrants proper technique, thorough training, and proper personal protective equipment. To aid in the training of researchers using organolithium reagents, a thorough, step-by-step protocol for the safe and effective use of tert-butyllithium on an inert gas line or within a glovebox is described. As a model reaction, preparation of lithium tert-butyl amide by the reaction of tert-butyl amine with one equivalent of tert-butyl lithium is presented.

The safe and proper use of organolithium reagents is described.

Un protocole pour la salubrité de lithiation Réactions Utilisation organolithium Réactifs

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

Réactions de Cascade enzymatique pour la synthèse des aminoalcools chiraux de L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products research has also found applications as an effective teaching tool. Specifically, this technique has been used to introduce second- and third-year undergraduates to aspects of natural products chemistry in the laboratory. In this report, two experiments are presented: the PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and the PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the endemic Australian plant species Correa reflexa. By employing PHWE in these experiments, the crude clove extract, enriched in eugenol and acetyleugenol, was obtained in 4-9% w/w from cloves by second-year undergraduates and seselin and (+)-epoxysuberosin were isolated in yields of up to 1.1% w/w and 0.9% w/w from C. reflexa by third-year students. The former exercise was developed as a replacement for the traditional steam distillation experiment providing an introduction to extraction and separation techniques, while the latter activity featured guided-inquiry teaching methods in an effort to simulate natural products bioprospecting. This primarily derives from the rapid nature of this PHWE technique relative to traditional extraction methods that are often incompatible with the time constraints associated with undergraduate laboratory experiments. This rapid and practical PHWE method can be used to efficiently isolate various classes of organic molecules from a range of plant species. The complementary nature of this technique relative to more traditional methods has also been demonstrated previously.

Employing Pressurized Hot Water Extraction PHWE to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

Here, we employ a pressurized hot water extraction (PHWE) method, which utilizes an unmodified household espresso machine to introduce undergraduates to natural products chemistry in the laboratory. Two experiments are presented: PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the Australian plant Correa reflexa.

Utilisant l’Extraction de l’eau chaude sous pression (PHWE) d’étudier la chimie des produits naturels dans le laboratoire d’études de premier cycle

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared according to the methodology developed by surface organometallic chemistry (SOMC). In this framework, catalytic cycles can be determined by isolating crucial intermediates. All air-sensitive materials are handled under inert atmosphere (using gloveboxes or a Schlenk line) or high vacuum lines (HVLs, &#60;10-5 mbar). The preparation of SiO2-700 (silica dehydroxylated at 700 &#176;C) and subsequent applications (the grafting of complexes and catalytic runs) requires the use of HVLs and double-Schlenk techniques. Several well-known characterization methods are used, such as Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), elemental microanalysis, solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy (SSNMR), and state-of-the-art dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy (DNP-SENS). FTIR and elemental microanalysis permit scientists to establish the grafting and its stoichiometry. 1H and 13C SSNMR allows the structural determination of the hydrocarbon ligands coordination sphere. DNP SENS is an emerging powerful technique in solid characterization for the detection of poorly sensitive nuclei (15N, in our case). SiO2-700 is treated with about one equivalent of the metal precursor compared to the amount of surface silanol (0.30 mmol&#183;g-1) in pentane at room temperature. Then, volatiles are removed, and the powder samples are dried under dynamic high vacuum to afford the desired materials [(&#8801;Si-O-)Hf(&#951;2&#960;-MeNCH2)(&#951;1-NMe2)(&#951;1-HNMe2)]. After a thermal treatment under high vacuum, the grafted complex is converted into metal imido silica complex [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)]. [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] effectively promotes the metathesis of imines, using the combination of two imine substrates, N-(4-phenylbenzylidene)benzylamine, or N-(4-fluorobenzylidene)-4-fluoroaniline, with N-benzylidenetert-butylamine as substrates. A significantly lower conversion is observed with the blank runs; thus, the presence of the imido group in [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is correlated to the catalytic performance.

A new group IV metal catalyst for imine metathesis is prepared by grafting amine metal complex onto dehydroxylated silica. Surface metal fragments are characterized using FT-IR, elemental microanalysis, and solid-state NMR spectroscopy. Further dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy experiments complement the determination of the coordination sphere.

Imine Metathesis par Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

A Microwave-Assisted Direct Heteroarylation of Ketones Using Transition Metal Catalysis

Heteroarylation introduces heteroaryl fragments to organic molecules. Despite the numerous available reactions reported for arylation via transition metal catalysis, the literature on direct heteroarylation is scarce. The presence of heteroatoms such as nitrogen, sulfur and oxygen often make heteroarylation a challenging research field due to catalyst poisoning, product decomposition and the rest. This protocol details a highly efficient direct &#945;-C(sp3) heteroarylation of ketones under microwave irradiation. Key factors for successful heteroarylation include the use of XPhos Palladacycle Gen. 4 Catalyst, excess base to suppress side reactions and the high temperature and pressure achieved in a sealed reaction vial under microwave irradiation. The heteroarylation compounds prepared by this method were fully characterized by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H NMR), carbon nuclear magnetic resonance spectroscopy (13C NMR) and high-resolution mass spectrometry (HRMS). This methodology has several advantages over literature precedents including broad substrate scope, rapid reaction time, greener procedure and operational simplicity by eliminating the preparation of intermediates such as silyl enol ether. Possible applications for this protocol include, but are not limited to, diversity-oriented synthesis for the discovery of biologically active small molecules, domino synthesis for the preparation of natural products and ligand development for new transition metal catalytic systems.

Heteroaryl compounds are important molecules utilized in organic synthesis, medicinal and biological chemistry. A microwave-assisted heteroarylation using palladium catalysis provides a rapid and efficient method to attach heteroaryl moieties directly to ketone substrates.

Une hétéroarylation directe de cétones assistée par micro-ondes à l’aide d’une catalyse métal de transition

Heteroarylation introduces heteroaryl fragments to organic molecules. Despite the numerous available reactions reported for arylation via transition metal ...