Ce travail est soutenu par une subvention du NIH RO1 (NINDS).

1. Préparation de l&#39;injection des virus <ol><li> rAAVs ont été achetés auprès du fournisseur recommandé commerciaux, mais ils peuvent aussi être produits dans son propre laboratoire (voir la discussion ci-dessous). La solution de virus est généralement produit à un titre de ~ 1x10 12 copies du génome par millilitre (GC / ml) et peut être utilisé à titre complet à manipuler un grand nombre de cellules. Alternativement, ils peuvent être dilués pour obtenir le niveau désiré de l&#39;étiquetage clairsemé. La dilution appropriée doit être déterminée par l&#39;utilisateur, mais une dilution de 1:10 est recommandé de commencer. </li><li> Dégel des virus sur la glace immédiatement avant utilisation. Transférer le désiré pré-dilution du volume de la solution de virus dans un petit (~ 250μl) tube de PCR. Diluer la solution de virus en utilisant un volume approprié de DPBS stérile dans une hotte de culture de tissus. Magasin de solution de virus dilué sur la glace jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit nécessaire. </li></ol> REMARQUE: la manipulation de tous les virus doivent être menées conformément à un protocole sur la biosécurité approuvé par votre institution 2. Chargement de seringues et assemblage d&#39;équipements <ol><li> Connectez l&#39;aiguille de chargement à la seringue en verre et d&#39;élaborer la solution de virus du tube de PCR en tirant doucement sur le piston. Tirez le piston jusqu&#39;à ce qu&#39;une bulle d&#39;air très faible peut être vu dans la seringue, ce qui indique que l&#39;ensemble de la solution est dans la seringue et n&#39;est pas laissé dans l&#39;aiguille de chargement. Sinon, une petite quantité de colorant inerte peut être ajouté à la solution pour le rendre visible. REMARQUE: Un petit tube de PCR doit être utilisé comme l&#39;aiguille de chargement ne sont généralement pas assez longtemps pour atteindre le fond de la plupart des autres tubes. </li><li> Retirer l&#39;aiguille de chargement et le lieu de la seringue sur le bloc seringue d&#39;une pompe seringue, en le fixant avec le dispositif de retenue seringue. </li><li> Insérez doucement l&#39;extrémité du tube connectif dans la seringue; insérez l&#39;autre extrémité dans le support de l&#39;aiguille. Insérez l&#39;aiguille d&#39;injection dans le porte-aiguille. L&#39;extrémité de l&#39;aiguille d&#39;injection doit s&#39;adresser directement à la fin de l&#39;intérieur tube conjonctif de la porte-aiguille. </li><li> Enfoncez lentement le piston pour pousser manuellement la solution à travers le tube conjonctif. Poussez jusqu&#39;à une petite goutte de solution est visible à l&#39;extrémité de l&#39;aiguille d&#39;injection. </li><li> Soigneusement la position du plongeur à côté du bloc poussoir et le fixer en place avec le support de bloc poussoir. </li><li> Réglez les paramètres d&#39;injection: le taux d&#39;injection devrait être d&#39;environ 8μl/min (~ 130nl / s); volume d&#39;injection est généralement de 1-2UL; sélectionner le diamètre seringue appropriée pour la taille de la seringue que vous utilisez (voir le manuel de la pompe seringue pour les directives). </li><li> Réglez le réchaud à ~ 38 ° C et couvrir avec une serviette en papier ou d&#39;autres barrières minces pour protéger les chiots pendant la phase de récupération. </li></ol> 3. Procédure d&#39;injection et de récupération chiot <ol><li> Préparer P0 ou P1 souriceaux pour injection, en les soumettant à l&#39;anesthésie à froid suivant un protocole IACUC approuvé. Imbibez un papier essuie quelques avec de l&#39;eau et le placer sur la glace. Placez le nombre désiré de chiots (4-5) sur la serviette en papier (les garder bien séparées) et incorporer délicatement les serviettes en papier sur les chiots afin qu&#39;ils soient couverts par une serviette de papier humide. Placer délicatement une petite quantité de glace pilée sur le dessus de l&#39;essuie-tout et incuber les chiots pendant environ 5 minutes. Les chiots peuvent être conservés sur la glace pendant 15 minutes et récupérer les fines tard. </li><li> Après le chiot est suffisamment anesthésié, placez-le sur un bloc de montage (nous utilisons un bloc de styromousse qui détient normalement 15ml tubes) et la positionner pour obtenir les meilleurs accès au site d&#39;injection. Pour le cortex il est plus facile de poser les plats des animaux sur son ventre, tandis que pour le cervelet, il est utile de positionner la tête de chiot sur le bord du bloc d&#39;offrir un meilleur accès à l&#39;arrière du crâne. Le chiot peut être fixé en place avec un pansement, si désiré. </li><li> Tenez le chiot la tête en place avec une main pendant que l&#39;aiguille est insérée manuellement à travers le crâne à l&#39;endroit désiré avec l&#39;autre main. Il est utile de tirer la peau serré pour l&#39;empêcher de bouger pendant l&#39;injection. Pour le cortex, il est utile de faire les injections par rapport à un repère anatomique bien définis, tels que la suture lambda du crâne, car cela aide à des injections avenir. Le cervelet peut être vu à travers le crâne comme une mince bande de tissu qui se trouve directement à la caudale du colliculus. La profondeur à laquelle l&#39;aiguille doit être introduite varie légèrement entre chaque animal et de souches et peut être mesurée par des marqueurs prédéterminés sur l&#39;aiguille, mais pour le cortex et le cervelet, nous constatons que la profondeur de ~ 0,5 - 1mm de la surface est généralement approprié. La profondeur d&#39;insertion pour d&#39;autres sites devraient être déterminées expérimentalement par l&#39;utilisateur final. REMARQUE: L&#39;aiguille doit pénétrer facilement dans le crâne, si elle n&#39;a pas, ne poussez pas trop fort car cela peut blesser l&#39;animal. Repositionner l&#39;aiguille et essayez à nouveau délicatement. </li><li> Injectez la solution de virus. L&#39;injection est de commencered en appuyant sur la touche START sur la pompe ou déprimante d&#39;une pédale, selon le modèle de la pression de l&#39;injecteur utilisé. En l&#39;absence d&#39;une pédale, il est recommandé d&#39;avoir un collègue aider à appuyer sur le bouton afin de minimiser les mouvements des mains inutiles qui peuvent affecter l&#39;injection. </li><li> Après le volume sélectionné a été injecté, laisser l&#39;aiguille en place pendant quelques secondes puis retirez délicatement l&#39;aiguille en le faisant glisser en douceur. Veillez à tenir le chiot la tête en place pour minimiser les mouvements parasites. Depuis le matériel d&#39;injection est nettoyé et stérilisé entre les expériences avec de l&#39;éthanol et la plaie est petite, l&#39;utilisation d&#39;antiseptiques est inutile. </li><li> Placez le chiot sur la plaque chauffante couverte avec le réglage de la température à ~ 38 ° C pour le réchauffer pour la récupération, à quelques minutes généralement 5-10. Pendant ce temps vous pouvez continuer injectant autres chiots. </li><li> Après tous les chiots ont récupéré (ils doivent être roses et mobiles) de prendre une partie de la maison de la literie et frottez doucement les chiots avec elle. Retour des chiots à la mère en tant que groupe. </li></ol> REMARQUE: Il est très important de s&#39;assurer que les chiots sont chauds et exposés à la literie à domicile avant de les retourner à la mère et de les retourner en tant que groupe. Ne pas le faire peut entraîner chez la mère de blesser ou tuer les chiots. 4. Nettoyage de l&#39;équipement <ol><li> Après l&#39;injection est terminée et les chiots ont été rendus à leur mère, nettoyer l&#39;installation d&#39;injection en mettant pleinement de chargement de la seringue avec de l&#39;acétone ou d&#39;éthanol à 70%. Rincer la solution à travers les temps de réglage d&#39;injection de plusieurs, en utilisant une solution fraîche à chaque fois. Cela permettra d&#39;éliminer toute solution de virus restants et précipités. L&#39;acétone ou l&#39;éthanol sera ensuite s&#39;évaporer. REMARQUE: L&#39;acétone est préférée pour le nettoyage, mais si votre configuration utilise les composants d&#39;acétone-sensibles, tels que les colles cyanoacrylate, puis d&#39;utiliser l&#39;éthanol à 70% pour ces étapes. </li><li> Désinfectez la zone de travail avec les déchets et jetez l&#39;eau de Javel dans un récipient approprié Biohazard. </li></ol> 5. Analyse <ol><li> Sacrifice des animaux à l&#39;âge désiré en utilisant une méthode d&#39;euthanasie IACUC approuvé. Fixation de perfusion est recommandée pour faciliter la visualisation ultérieure de neurones infectés, en particulier chez les animaux adultes. </li><li> Procédures immunomarquage standard peut être utilisé pour amplifier le signal fluorescent. Brièvement, 100 um flottante sections vibratome sont perméabilisées avec du PBS 1% de Triton X-100 et bloquée dans du PBS 1% de Triton X-100 de sérum de chèvre normal 10%. Les articles sont incubés dans une solution de blocage avec des anticorps primaires nuit à 4 ° C, suivi par d&#39;autres à laver et de blocage. Les articles sont ensuite incubés dans une solution de blocage avec des anticorps secondaires pendant 2 heures à température ambiante, lavé à fond, monté sur des lames et lamelle avec des anti-décoloration des médias de montage. Cryocoupes peut également être utilisé pour visualiser les neurones marqués, mais la fluorescence endogène pourrait être perdu. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Une procédure d&#39;injection va produire une infection réussie robuste de neurones dans la région du site d&#39;injection, sans endommager les tissus observables ou d&#39;autres effets nocifs sur l&#39;animal. Comme l&#39;illustre la figure 1, la propagation de l&#39;infection peut être observé dans Cre-reporter souris (ROSA26R) 12 injectée avec rAAV8-Cre dans des sites anatomiques différents. Les injections dans des régions spécifiques, telles que le cortex et le colliculus supérieur, génèrent habituellement des infections locales à la propagation minimal pour les régions adjacentes (Fig. 1A-B). L&#39;utilisation de solution de titrage de virus élevé rend l&#39;infection des zones adjacentes, telles que l&#39;hippocampe, plus probable (figure 1A). Injection avec des résultats faible titre solution de virus dans l&#39;infection rare, qui reste généralement à proximité du site d&#39;injection, comme indiqué dans l&#39;injection du cervelet rAAV8-Cre sur la ligne médiane de la souris journaliste ROSA26R (figure 1C-D). Nous avons observé la recombinaison chez la souris journaliste ROSA26R dans les 2 jours après l&#39;injection du rAAV8-Cre, ce qui suggère que l&#39;infection, la recombinaison et l&#39;expression de gènes rapporteurs peuvent tous survenir relativement rapidement. En outre, nous avons utilisé avec succès cette technique pour étudier les effets de la délétion du gène à un locus non-ROSA utilisant un allèle floxés conditionnel, dont les résultats seront publiés ailleurs. Le nombre de cellules infectées devraient en corrélation avec le titre de la solution injectée virale. Par exemple, l&#39;injection d&#39;un mélange de solutions de titre élevé de deux rAAV8 virus exprimant différentes protéines fluorescentes dans le cervelet infecte de nombreuses cellules de Purkinje qui sont étiquetés différemment (figure 2A). Inversement, l&#39;injection d&#39;une solution de faible titre de virus peut entraîner une infection rare pour aider à visualiser des cellules individuelles (figure 2B). Neurones marqués par fluorescence peut être observée directement dans fraîches coupées, les tissus vivants (figure 2B) ou peuvent être soumis à immunomarquage pour améliorer les signaux fluorescents endogènes d&#39;acquisition d&#39;images plus tard, par grand champ ou confocal microscopie à fluorescence (Fig. 2A, Fig. 3A-C). Enfin, rAAV8 est capable d&#39;infecter une variété de types de neurones dans le cortex de l&#39;étiquetage des processus solides fines (Fig. 3A-C). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" /> Figure 1: coloration LacZ dans le cerveau de souris journaliste ROSA26R qui ont été injectés avec rAAV8-Cre au P0 a démontré une activité Cre et la localisation de l&#39;infection. <ol type="A"><li> Large champ vue sagittale d&#39;un cerveau P14 montrant un titre élevé (1x10 12 GC / ml) dans le cortex et les injections colliculus supérieur. L&#39;utilisation de virus de titre élevé rend plus probable que les zones adjacentes seront également infectés. </li><li> Coupe sagittale de P14 cortex injecté à faible titre (1x10 11 GC / ml) du virus montre une infection locale avec moins de se propager. </li><li> Une vue d&#39;un cervelet wholemount P28 injecté à la ligne médiane avec un faible titre (1x10 9 GC / ml) solution de virus montre que l&#39;infection est rare et reste généralement à proximité du site d&#39;injection. </li><li> Vue sagittale de la ligne médiane du cervelet dans C). Notez que généralement que les cellules de Purkinje sont infectés par rAAV8. </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" /> Figure 2: étiquetage cérébelleuse par injection avec des titres élevés et faibles de rAAV8 exprimer des protéines fluorescentes. <ol type="A"><li> Une coupe sagittale de P21cerebellum infectées avec un mélange de deux virus exprimant l&#39;EGFP (vert) et DsRed (rouge). Un mix titre élevé de virus a été utilisé pour infecter un grand nombre de cellules de Purkinje. </li><li> Une cellule de Purkinje du cervelet en direct P14 de l&#39;infection virale très faible titre imagé immédiatement après la dissection. </li></ol><img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" /> Figure 3: étiquetage corticale par rAAV8-DsRed. Des exemples de la variété des types de neurones corticaux dans les coupes coronales d&#39;un cortex P21 qui a été infecté par rAAV8-DsRed au P0.

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L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+serotyped+with+AAV8+capsid+are+more+efficient+than+AAV-1+or+-2+serotypes+for+widespread+gene+delivery+to+the+neonatal+mouse+brain.">Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain.</a> Neuroscience. 138, 501-510 (2006).</li><li>Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. 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L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode d&#39;injection néonatale virale présenté ici offre un moyen simple et rapide de générer des mosaïques in vivo pour l&#39;étude du développement du cerveau postnatal. La méthode tire parti des allèles floxés qui sont actuellement disponibles ainsi que ceux qui sont faits par le gène High Throughput ciblage des projets 6. Comparé à l&#39;utilisation de l&#39;expression transgénique de la CRE, cette méthode fournit un moyen rapide de tester la fonction des gènes da...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> rAAV8-Cre,-GFP, DsRed-, </td><td> Vecteur Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, afin personnalisée </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> Harvard Pump 11 Plus </td><td> Harvard Apparatus </td><td> # 702208 </td><td> (Pas de port pédale) </td></tr><tr><td> Rétiniennes kit d&#39;injection épithélium pigmentaire </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> RPE-KIT </td><td> Contient conjonctifs aiguilles tuyau d&#39;injection, (36G), et porte-aiguille </td></tr><tr><td> Nanofil seringue, 100 ul </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> Nanofil-100 </td><td> Comprend aiguilles réutilisables de chargement </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;anticorps GFP </td><td> Aves </td><td> GFP-1020 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;anticorps DsRed </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> Bloc de chauffage </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R la souris </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

Fonctionnement normal du cerveau repose non seulement sur le développement embryonnaire où les grandes voies neuronales sont établis, mais aussi sur le développement postnatal lorsque les circuits neuronaux sont élevés et raffinée. Le dérèglement à ce stade peut entraîner des troubles neurologiques et psychiatriques comme l&#39;autisme et la schizophrénie 1,2. De nombreux gènes ont été étudiés dans le cerveau prénatal et trouve cruciale pour de nombreux processus développementaux 3-5. Cependant, leur fonction dans le cerveau postnatal est largement inconnu, en partie parce que leur suppression chez la souris conduit souvent à la létalité au cours du développement néonatal, et en partie parce que leur condition en début de développement entrave l&#39;analyse post-natal. Pour surmonter ces obstacles, les allèles floxés de ces gènes sont actuellement générés chez des souris 6. Lorsqu&#39;il est combiné avec des allèles transgéniques qui expriment la recombinase Cre dans des types cellulaires spécifiques, suppression conditionnelle peut être réalisé pour étudier la fonction des gènes dans le cerveau postnatal. Cependant, cette méthode nécessite allèles supplémentaires et du temps supplémentaire (3-6 mois) pour générer des souris avec des génotypes appropriés, limitant ainsi l&#39;expansion de l&#39;analyse génétique à grande échelle dans le cerveau de souris. Ici nous démontrons une approche complémentaire qui utilise viro-Cre exprimée d&#39;étudier ces allèles floxés rapidement et systématiquement dans le développement du cerveau postnatal. En injectant recombinant virus adéno-associés (rAAVs) 7,8 encodage Cre dans le cerveau néonatal, nous sommes capables de supprimer le gène d&#39;intérêt dans les différentes régions du cerveau. En contrôlant le titre viral et la co-exprimant un marqueur fluorescent protein, nous pouvons atteindre simultanément l&#39;inactivation du gène mosaïque et clairsemés étiquetage neuronale. Cette méthode contourne l&#39;exigence de nombreux gènes dans le développement précoce, et nous permet d&#39;étudier leur fonction de cellules autonomes dans de nombreux processus essentiel dans le développement du cerveau postnatal, y compris la croissance axonale et dendritique, de branchement, et le carrelage, ainsi que la formation des synapses et de raffinement. Cette méthode a été utilisée avec succès dans notre propre laboratoire (résultats non publiés) et d&#39;autres 8,9, et peut être étendue à d&#39;autres virus, tels que des lentivirus 9, ainsi que l&#39;expression de shRNA ou dominant des protéines actives 10. Par ailleurs, en combinant cette technique avec l&#39;électrophysiologie ainsi que récemment développé des outils d&#39;imagerie optique 11, cette méthode fournit une nouvelle stratégie pour étudier comment les voies génétiques influencent le développement des circuits neuronaux et la fonction chez les souris et les rats.

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Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Une<em&gt; In vivo</em&gt; Méthode pour tester la fonction des gènes dans le cerveau postnatal est décrite. AAV recombinants exprimant Cre et / ou une protéine fluorescente sont injectées dans le cerveau de souris néonatales. Inactivation d&#39;un gène mosaïque et clairsemés étiquetage neuronale sont atteints, permettant une analyse rapide de la fonction des gènes dans les processus essentiels au développement des circuits neuronaux.

Analyse mosaïque de fonction des gènes dans le développement de cerveau de souris à l&#39;aide postnatale à base de virus recombinaison Cre

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

mosaic-analysis-gene-function-postnatal-mouse-brain-development-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K vues.  Keck School of Medicine, University of Southern California. Une In vivo Méthode pour tester la fonction des gènes dans le cerveau postnatal est décrite. AAV recombinants exprimant Cre et / ou une protéine fluorescente sont injectées dans le cerveau de souris néonatales. Inactivation d'un gène mosaïque et clairsemés étiquetage neuronale sont atteints, permettant une analyse rapide de la fonction des gènes dans les processus essentiels au développement des circuits neuronaux.

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Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

Livraison de gènes au cerveau de rat postnatal par des non-ventriculaire injection Plasmide et électroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Recherche

Neurosciences

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

En électroporation in ovo dans Mésencéphale Poussin pour étudier la fonction des gènes dans le développement neurone dopaminergique

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imagerie fibres sérotoninergiques dans la moelle épinière de souris Utilisation du CLARITY / Technique CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induisant la recombinaison Cre-lox dans le Cortex cérébral par l’intermédiaire de In Utero électroporation de souris

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Transplantation de Homochronic des interneurones précurseurs dans cerveau de souris postnatale précoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

Étudier le fonctionnement du cerveau chez les enfants à l’aide de magnétoencéphalographie

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

Production, Purification et contrôle de la qualité pour les vecteurs de base de Virus Adeno-associé

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Implantation chronique d’ensemble-corticale Electrocorticographic tableau dans l’ouistiti commun

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Transplantation de progéniteurs interneuron corticales génétiquement modifiés dans les cerveaux de souris postnatales précoces

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...