Ce travail a été partiellement financé par la Direction de la reproduction de l&#39;Institut national de la santé infantile et le développement humain (NICHD - R21 HD059015) et par la Charles H. Bois Fondation Enfant Young Investigator Award de recherche en santé (Boston, MA).

1. La mutagenèse dirigée de la séquence de gène très riches en GC KISS1R <ol><li> Modèle: pleine séquence d&#39;ADNc de l&#39;humain avec une KISS1R Myc-étiquette fusionnée à son extrémité N-terminale. Cette séquence est clonée dans le vecteur d&#39;expression pCS2 +, qui est compatible avec les lignées cellulaires de mammifères utilisée ensuite pour transfections. Ce vecteur d&#39;expression est appelé aux présentes pCS2 KISS1R + Myc. </li><li> Conception d&#39;amorce: amorces sont conçus pour transporter des mutations souhaitées, conformément aux instructions de l&#39;QuikChange kit de mutagenèse dirigée (Stratagene). En résumé: <ul><li> Les deux amorces (marche avant et arrière) doit contenir la mutation désirée et recuit à la même séquence sur les brins opposés du plasmide (par exemple avant et arrière amorces sont complémentaires les unes aux autres) <img src="/files/ftp_upload/2897/step1.jpg" alt="Etape 1" /></li><li> Primaires devrait être de 25 à 45 bases de long et fin en une ou plusieurs bases de C ou G <img src="/files/ftp_upload/2897/step2.jpg" alt="Etape 2" /> <img src="files/ftp_upload/2897/step3.jpg" alt="Étape 3" /></li><li> Mutation introduite (s) doit être au milieu d&#39;apprêt et flanqué de ~ 10-15 bases de la séquence correcte des deux côtés </li><li> La température de fusion (Tm) des amorces doit être égale ou supérieure à 78 ° C. Utilisez les formules suivantes pour estimer Tm: <ul><li> Lors de l&#39;introduction de mutations: Tm = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / N - discordance% (N est la longueur d&#39;amorce dans des bases) </li><li> Lors de l&#39;introduction insertions ou délétions: Tm = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / N (N n&#39;inclut pas les bases qui sont insérés ou supprimés) </li><li> Utilisez amorces dessalé (pas de purifications supplémentaires nécessaires). <img src="/files/ftp_upload/2897/step4.jpg" alt="Etape 4" /></li></ul></li></ul></li><li> Les meilleures conditions d&#39;amplification comprennent l&#39;ajout d&#39;PCRx Enhancer solution (Invitrogen) et le DMSO. Au moins deux concentrations de DMSO, tel que 4% et 8%, devrait être testé. Les conditions de PCR sont indiquées dans le tableau I et dans la figure 1, et les résultats d&#39;une amplification par PCR de représentant pCS2 + MycKISS1R est montré dans la figure 2. </li><li> Éliminer l&#39;ADN des parents sur les produits d&#39;amplification par la digestion de l&#39;ADN méthylé avec Dpnl pour 1h 30min à 37 ° C: mélanger dans un tube à centrifuger 17.5μl du produit PCR avec des 2μl NEBuffer 10x 4 et 0.5μl des Dpnl (10U; New England Biolabs). </li><li> Transformez Dpnl-traitée produit PCR: 2μl mélange de Dpnl traités ADN avec 45μl d&#39;XL10-Gold Ultracompetent E. coli (Stratagene) en pré-refroidi 15 ml tube de culture cellulaire. Ajouter 2μl du β-mercaptoéthanol et suivez les instructions Stratagene. Plate 100-400μl de bactéries transformées en LB-agar contenant 100μg/ml ampicilline et incuber à 37 ° C. </li><li> Miniprep 2-4 colonies individuelles pour isoler l&#39;ADN plasmidique. Confirmer l&#39;introduction réussie des mutations souhaitées par le séquençage et l&#39;analyse de l&#39;ADN isolé. </li></ol> 2. Transfection transitoire de MycKISS1R en cellules HEK-293 <ol><li> Les expériences suivantes sont effectuées dans des cellules humaines embryonnaires de rein (HEK-293) en culture dans un incubateur à CO 2 (5% de CO 2) à 37 ° C dans du DMEM supplémenté avec 10% sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine. </li><li> Graine cellules HEK-293 au 2.5x10 5 cellules / ml dans des plaques 6 puits et de les laisser pousser une nuit à 37 ° C avant la transfection. NOTE: (i) l&#39;utilisation des puits en triple pour chaque condition expérimentale, (ii) la confluence des cellules idéale au moment de la transfection est 30% -50%. </li><li> Transfecter cellules HEK-293 utilisant le réactif de transfection GenePorter (Genlantis), selon les instructions du fabricant: Mélanger la moitié de l&#39;DMEM sans sérum avec 0.5μg pCS2 + MycKISS1R ainsi que le contrôle 0.5μg (vide) vecteur pour totaliser 1 pg d&#39;ADN / puits. Mélanger l&#39;autre moitié avec 10 ul réactif de transfection par pg d&#39;ADN transfecté. NOTE: Idéal de concentration d&#39;ADN plasmidique peut varier. </li></ol> 3. Traitement des cellules et la lyse <ol><li> 24h après transfection, remplacez milieu cellulaire avec 1ml DMEM contenant 2,5% de FBS (pour diminuer le métabolisme cellulaire). NOTE: Cette diminution dans le sérum peut faciliter et / ou d&#39;amplifier la détection de résultats. </li><li> Ajouter inhibiteur de lysosome (100 ug / puits de leupeptine) directement dans chaque puits d&#39;un ensemble de 6 puits assiette. Incuber à 37 ° C pendant 6 ou 16 h (ou un autre moment souhaité) </li><li> Ajouter fraîchement préparés inhibiteur de protéasome (10 uM / puits de MG132) directement dans tous les puits de deux ensemble des plaques 6 puits. Incuber à 37 ° C pendant 2, 4, 6 ou 16h (ou parfois souhaité). Ajouter des véhicules à tous les puits de la quatrième à 6 puits plaque (0 point dans le temps) et incuber à 37 ° C pendant 16h </li><li> Quand l&#39;incubation est terminée, déplacer les plaques de glace et d&#39;effectuer cette procédure de lyse ensemble sur la glace pour empêcher la dégradation des protéines: <ul><li> Pour augmenter le rendement en protéines, de combiner les trois exemplaires sur les plaques de 6 puits dans un centr seuleTube ifuge </li><li> Aspirer et laver les cellules moyenne une fois avec 1 ml d&#39;glacée tampon phosphate salin (PBS) </li><li> Ajouter 100 pi de tampon glacé de lyse (20 mM HEPES, pH 7,4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, le désoxycholate de sodium à 0,25%) contenant des inhibiteurs de protéase (1x cocktail contenant 100 mM AEBSF-HCl, 80μM aprotinine, bestatine 5mM, E-64 1,5 mM, EDTA 0,5 M, 2 mM de leupeptine et 1 mM de pepstatine A, plus 2 mM PMSF) dans chaque puits </li><li> Retirer les cellules avec un grattoir cellulaire et le transfert de lysats de centrifuger les tubes </li><li> Passez les cellules ~ 10 fois par une aiguille de calibre 20. REMARQUE: Ne pas soniquer échantillons destinés à la détection par Western blot des protéines membranaires. Sonication conduit à l&#39;agrégation des protéines membranaires, qui ne migrent pas correctement pendant l&#39;électrophorèse </li><li> Incuber lysats cellulaires pour 1h à 4 ° C sur une plate-forme à bascule </li><li> Lysats cellulaires Centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 10000 rpm et les surnageants x transfert à de nouveaux tubes. REMARQUE: Ne pas déranger granulés lors de cette étape </li><li> Déterminer la concentration de protéines dans 10 ul de surnageant en utilisant la méthode BCA (Pierce) </li><li> Diluer lysats à 1mg/ml avec un tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéase. </li></ul></li></ol> 4. Immunoprécipitation et Western blot de détection d&#39;MycKISS1R <ol><li> Effectuez les étapes suivantes immunoprécipitation sur la glace (ou à 4 ° C): <ul><li> Laver la quantité appropriée d&#39;agarose conjugué d&#39;anticorps anti-myc (2.5μg / échantillon) à deux reprises avec PBS glacé et ajoutez ceci à 400μg de protéines lysat. </li><li> Immunoprécipiter l&#39;MycKISS1R sur des lysats nuit à 4 ° C dans une plate-forme à bascule avec une agitation douce. </li><li> Isoler des billes d&#39;agarose par centrifugation d&#39;impulsion à 4 ° C (jusqu&#39;à 10 000 x rpm) </li><li> Aspirer et jeter surnageants (sans déranger les boulettes) </li><li> Laver une fois avec des perles glacée tampon de lyse et deux fois avec PBS glacé. Inverser les tubes doucement avant de filer </li><li> Perles Ressuspend contenant de l&#39;anticorps lié au MycKISS1R tampon d&#39;échantillon de chargement 2x contenant 10% de β-mercaptoéthanol. </li></ul></li><li> Western blot d&#39;immunocomplexes MycKISS1R: <ul><li> Échantillons de chaleur pendant 30 min à 37 ° C. NOTE: Ne pas faire bouillir les échantillons destinés à la détection par Western blot des protéines membranaires. Comme sonication, ébullition conduit également à l&#39;agrégation de ces protéines </li><li> Déplacer les tubes immédiatement dans la glace pendant 5 min </li><li> Séparer les protéines par SDS-PAGE sur un gel gradient 4-15%. </li><li> Transfert à Immobilon-FL membrane de PVDF (pour la détection infra-rouge) à 25V pendant 30 min dans un tampon de transfert (Tris base 48mm, 39mm de glycine, 1,2 SDS, 20% de méthanol, pH 9,2) en utilisant le Bio-Rad semi-sec Transfert un appareil </li><li> Laver les membranes pendant 5 min à température ambiante avec une solution saline tamponnée Tris (TBS) et le bloc pour 1h à température ambiante avec Odyssey Licor de blocage sur une plate-forme à bascule (alternativement, 5% de lait dans du TBS peut être utilisé pour bloquer la liaison non spécifique). </li><li> Membranes Incuber une nuit à 4 ° C avec le lapin d&#39;anticorps anti-myc (1:500) dans la solution de blocage contenant 0,1% de Tween-20 </li><li> Retirer anticorps primaire et lavez les membranes 3 fois de 5 min chacune avec du TBS contenant 0,1% de Tween-20 (TBST) </li><li> Incuber les membranes pour 1h à température ambiante avec de chèvre Infra-RedDye ® 800CW-anticorps anti-IgG de lapin (1:10.000) en bloquant tampon contenant 0,1% de Tween-20 et 0,01% de SDS </li><li> Retirer anticorps secondaire, se laver les membranes 3 fois de 5 min chacune avec TBST et une dernière fois avec le SCT seulement (pour enlever les Tween-20) </li></ul></li><li> Imagerie et quantification des MycKISS1R utilisant le LI-COR Odyssey imageur infra-rouge: <ul><li> Le MycKISS1R sur les membranes seront imagées par le LI-COR Odyssey imageur infra-rouge. Pour commencer, placez la membrane sur le coin inférieur gauche de scanner Odyssey, en l&#39;alignant sur la grille. Couvrir avec le tapis de caoutchouc, lisser les bulles avec un rouleau et fermez le couvercle </li><li> Créer un nouveau fichier de projet sur l&#39;ordinateur. Nommez le fichier, cliquez sur «Terminé», puis entrez le login scanner sur &quot;scan&quot;. Taille du boîtier de console scanner pour s&#39;adapter à votre membrane, puis choisir la résolution de 169μm et une qualité d&#39;image moyenne </li><li> Choisissez les paramètres d&#39;intensité pour 700 (rouge) et 800 (vert) des canaux selon la force attendue de chaque signal. C&#39;est à des fins de visualisation du signal et ne seront pas d&#39;influence sur la quantification. Cliquez sur &quot;Start Scan&quot; </li><li> Nom et enregistrer la numérisation, puis cliquez sur &quot;OK&quot; pour l&#39;ouvrir dans une nouvelle fenêtre pour la quantification. Monomères MycKISS1R devrait être visible à environ 43kD </li><li> Utilisation de la «boîte» de l&#39;outil (sur la barre latérale de gauche), tracez une boîte autour de la première bande. Faites glisser la boîte autour pour s&#39;assurer que toutes les bandes s&#39;intégrer, puis &quot;copier&quot; et &quot;coller&quot; la boîte sur toutes les bandes </li><li> Sélectionnez toutes les cases en utilisant &quot;Ctrl + A&quot;, puis sélectionnez l&#39;option de soustraire de fond médiane. Cliquez sur &quot;rapport&quot; sur le menu en haut et d&#39;un tableur avec les valeurs de quantification apparaît. Les résultats représentatifs sont présentés ici represented que rabattable augmenter au fil des cellules non traitées (temps zéro) </li></ul></li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <ol><li> La mutagenèse dirigée de la séquence du gène KISS1R très riches en GC: Tableau 1. Montre la combinaison de réactifs pour améliorer l&#39;efficacité de l&#39;amplification KISS1R. Cette combinaison est utilisée avec succès pour introduire plusieurs mutations dirigées contre des régions distinctes de l&#39;KISS1R séquence d&#39;ADNc, ainsi que pour l&#39;amplification de ce gène très riches en GC. La figure 1 montre les conditions de cyclisme et l&#39;amplification de la mutagenèse de KISS1R. Ces conditions ont été modifiées par l&#39;QuikChange kit de mutagenèse dirigée (Stratagene). Figure 2. Montre un résultat représentatif en utilisant ce protocole optimisé. L&#39;ajout de 4% ou 8% de DMSO combiné avec l&#39;Enhancer améliore considérablement le rendement PCRx d&#39;amplification de la GC riche KISS1R ADNc contenant le plasmide. Dans cette expérience représentative, le DMSO 4% prévu conditions d&#39;amplification légèrement meilleur par rapport à 8% de DMSO. Transformation des produits d&#39;amplification Dpnl-traitées avec ultracompetent E. coli donne généralement de 100 à plus de 1000 colonies, et le taux d&#39;introduction réussie des mutations souhaitées est de 80-90% déterminée par séquençage de l&#39;ADN. </li><li> Utiliser des constructions MycKISS1R pour étudier la physiologie des récepteurs: Dans cette expérience représentative, le type sauvage pCS2 + MycKISS1R amplifié selon le protocole optimisé décrite ici est utilisée pour étudier la dégradation in vivo des récepteurs KISS1 dans une lignée cellulaire pertinents (HEK-293) exprimant de manière transitoire MycKISS1R. Après le traitement des transfectées cellules HEK-293 avec les lysosomes (leupeptine) ou du protéasome (MG132) inhibiteurs selon le protocole décrit dans les méthodes, les cellules sont lysées et traitées pour western blot. Le panneau supérieur de la figure 3 montre le scan de monomères MycKISS1R tandis que le panneau du bas montre la quantification des bandes indiquées sur le panneau supérieur. La quantification des bandes indique que ni ni 6h 16h de traitement leupeptine affecté les niveaux de protéines MycKISS1R. Inversement, le traitement avec MG132 a entraîné une augmentation dépendant du temps en protéines MycKISS1R dans ces cellules, qui culmine avec une accumulation de 45 fois du récepteur après 16h d&#39;incubation avec MG132. Ces observations indiquent que, contrairement à la plupart G récepteurs couplés aux protéines, KISS1R est dégradée par le protéasome (plutôt que le lysosome). </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td> DMSO </td><td></td></tr><tr><td> Réactifs </td><td> 0 </td><td> 4% </td><td> 8% </td></tr><tr><td> Eau </td><td> 35 </td><td> 33 </td><td> 31 </td></tr><tr><td> 10x Pfu Ultra tampon Taq </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> mélange de dNTP (10 mM) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Sens Primer (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Antisens Primer (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10x PCRx Enhancer Solution </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Pfu Ultra Taq polymérase (2.5U/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ADN plasmidique (20ng/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Combinaison de réactifs utilisés avec succès à muter et à amplifier les KISS1R riches en GC <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Cyclisme conditions de la mutagenèse et l&#39;amplification du succès riches en GC KISS1R: Un début 2min chaude a été suivie par 18 cycles de 30 sec fondre à 95 ° C; 1 min de recuit à 55 ° d&#39;extension C et 6 min à 68 ° C. Un supplément de 10 min d&#39;extension à 68 ° C a été ajouté à la fin du dernier cycle. Ces paramètres ont été ajustés par rapport au protocole original de la mutagenèse QuikChange II kit XL-mutagénèse dirigée (Stratagene). <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Visualisation des riches en GC pCS2 + Myc KISS1R amplifié en présence ou en absence de DMSO: Cinq aliquotes des pCS2 + KISS1R Myc amplifié en présence de 0, 4 ou 8% de DMSO ont été chargés dans ce représentant de gel d&#39;agarose 1% coloré avec éthidium bromure et visualisés en utilisant la lumière UV. Les bandes de plasmide de 6Kb sont visibles sur les deux voies chargées avec des produits de PCR amplifié en présence de 4% et 8% de DMSO, mais pas sur la première voie, qui a été chargé avec une PCRproduit amplifié en l&#39;absence de DMSO. <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Effet de la leupeptine ou MG132 sur les niveaux de Myc KISS1R protéines dans les cellules HEK-293: cellules HEK-293 exprimant Myc KISS1R ont été traités avec 100μg/ml leupeptine ou 10 uM MG132 à 37 ° C pendant le temps désigné. Myc KISS1R sur 400μg de lysat cellulaire a été immunoprécipité avec 2.5μg d&#39;agarose-anticorps anti-myc anticorps et analysés par western blot. (A) de détection de l&#39;Odyssée LI-COR du KISS1R Myc après une incubation d&#39;immunoblots de lapin anti-Myc-tag anticorps suivie d&#39;une incubation avec IRDye 800CW-anticorps anti-lapin (B) Quantification des bandes KISS1R Myc montré en (A) en utilisant le LI-COR logiciel de quantification Odyssée. Les résultats sont représentés en tant rabattable augmenter au fil des cellules non traitées (temps 0).

<ol>
	<li>Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GPR54+Gene+as+a+Regulator+of+Puberty.">The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty.</a> N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).</li><li>de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypogonadotropic+Hypogonadism+Due+to+Loss+of+Function+of+the+KiSS1-Derived+Peptide+Receptor+GPR54.">Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).</li><li>Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kisspeptin+Directly+Stimulates+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Release+via+G+Protein-Coupled+Receptor+54.">Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).</li><li>Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GPR54-Activating+Mutation+in+a+Patient+with+Central+Precocious+Puberty.">A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty.</a> N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).</li><li>Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Phenotype+Analysis+in+Five+Patients+with+Isolated+Hypogonadotropic+Hypogonadism+due+to+a+L102P+Inactivating+Mutation+of+GPR54.">Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54.</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).</li><li>Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Novel+Missense+Mutations+in+G+Protein-Coupled+Receptor+54+in+a+Patient+with+Hypogonadotropic+Hypogonadism.">Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism.</a> J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).</li><li>Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-Causing+Mutation+in+GPR54+Reveals+the+Importance+of+the+Second+Intracellular+Loop+for+Class+A+G-Protein-Coupled+Receptor+Function.">Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function.</a> J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).</li><li>Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR54+regulates+ERK1/2+activity+and+hypothalamic+gene+expression+in+a+Galpha(q/11)+and+beta-arrestin-dependent+manner.">GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner.</a> PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).</li><li>Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KISS1R+Intracellular+Trafficking+and+Degradation:+Effect+of+the+Arg386Pro+Disease-Associated+Mutation.">KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation.</a> Endocrinology. , (2011).</li><li>Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+a+Specific+Position+in+a+DNA+Sequence.">Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence.</a> J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).</li><li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unusual+Origin+of+the+Polymerase+Chain+Reaction.">The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction.</a> Sci Am. 262, 56-61 (1990).</li><li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences.">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li><li>Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+GC-rich+genes+by+following+a+combination+strategy+of+primer+design,+enhancers+and+modified+PCR+cycle+conditions.">Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions.</a> Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).</li><li>Kong, K. C., Poyner, D. R., Wheatly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. , 197-204 (2010).</li><li>Hall, R. A., George, S. R., O'Dowd, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9.">Chapter 9.</a> G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. , 170-171 (2005).</li><li>Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+Involvement+in+Agonist-Induced+Down-Regulation+of+Mu+and+Delta+Opioid+Receptors.">Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors.</a> J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).</li><li>Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Receptor+Fate+by+Ubiquitination+of+Activated+Beta+2-Adrenergic+Receptor+and+Beta-Arrestin.">Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin.</a> Science. 294, 1307-1313 (2001).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La mutagenèse dirigée a été utilisée pour étudier la fonction des protéines par l&#39;introduction de changements de nucléotides dans la séquence codante des gènes cibles de plus de trois décennies. La technique originale a été décrite en 1978 par le chimiste britannique-canadien et lauréat du Prix Nobel Michael Smith 10. Michael Smith a partagé le Prix Nobel 1993 de chimie avec Kary Mullis, le biochimiste américain qui a inventé la Polymerase Chain Reaction (PCR) 11. La méthode ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 10x PCRx Enhancer Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 52391 </td></tr><tr><td> PfuUltra haute fidélité Détergent alternative ADN polymérase </td><td> Stratagene </td><td> 600385 </td></tr><tr><td> DPN-I </td><td> New England Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10-Gold Ultracompetent E. cellules coli </td><td> Stratagene </td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10 à 013-CV </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Réactif de transfection Geneporter </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> Leupeptine </td><td> Calbiochem </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la protéase cocktail et PMSF </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> Sc-24948 </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td></tr><tr><td> anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugué </td><td> Millipore </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> Tampon de charge 2x </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Critère de Tris-HCl préfabriqué gel gradient 4-15% </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon-FL membrane PVDF </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> Tampon de blocage Odyssey </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> Lapin d&#39;anticorps anti-myc </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> Chèvre anti-lapin IRDye 800CW </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32211 </td></tr><tr><td> Imagerie infrarouge Odyssey système </td><td> LI-COR Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> Cocktail inhibiteur de protéase Halt (100x) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

Le récepteur kisspeptine (KISS1R) est un G récepteurs couplés aux protéines reconnu comme l&#39;élément déclencheur de la puberté et un régulateur de la compétence de reproduction à l&#39;âge adulte 1,2,3. Mutations d&#39;inactivation dans KISS1R identifiées chez des patients ont été associés à un hypogonadisme hypogonadotrophique iodiopathic (IHH) 1,2 et une puberté précoce 4. Les études fonctionnelles de ces mutants sont cruciaux pour notre compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation de la reproduction par ce récepteur ainsi que ceux qui façonnent les résultats des maladies qui résultent de la signalisation KISS1R anormale et la fonction. Cependant, la séquence très riches en GC du gène KISS1R rend plutôt difficile d&#39;introduire ou d&#39;amplifier les mutations du gène codant pour ce récepteur par PCR. Nous décrivons ici une méthode pour introduire des mutations de l&#39;intérêt dans cette séquence très riches en GC qui a été utilisée avec succès pour générer plus d&#39;un douzaine de mutants KISS1R dans notre laboratoire. Nous avons optimisé les conditions de PCR afin de faciliter l&#39;amplification d&#39;une gamme de mutants KISS1R qui incluent substitutions, délétions ou des insertions dans la séquence KISS1R. L&#39;ajout d&#39;une solution de PCR Enhancer, ainsi que d&#39;un faible pourcentage de DMSO ont été particulièrement utiles pour améliorer l&#39;amplification. Cette procédure optimisée peut être utile pour d&#39;autres riches en GC modèles ainsi. Le vecteur d&#39;expression codant pour la KISS1R est été utilisée pour caractériser la signalisation et la fonction de ce récepteur afin de comprendre comment les mutations peuvent modifier KISS1R fonction et conduire à la reproduction phénotypes associés. En conséquence, les applications potentielles de mutants générés par KISS1R mutagenèse dirigée peut être illustrée par de nombreuses études 1,4,5,6,7,8. À titre d&#39;exemple, la mutation gain-de-fonction dans le KISS1R (Arg386Pro), qui est associée à la puberté précoce, a montré une prolongation de la réactivité du récepteur à 4 stimulation de ligand ainsi que de modifier le taux de dégradation des KISS1R 9 . Fait intéressant, nos études indiquent que KISS1R est dégradée par le protéasome, par opposition à la dégradation lysosomale classiques décrites pour la plupart G récepteurs couplés aux protéines 9. Dans l&#39;exemple présenté ici, la dégradation de l&#39;KISS1R est étudiée dans cellules rénales embryonnaires humaines (HEK-293) exprimant de manière transitoire Myc-taggés KISS1R (MycKISS1R) et traités avec des inhibiteurs du protéasome ou lysosome. Les lysats cellulaires sont immunoprécipitées en utilisant une agarose conjugué d&#39;anticorps anti-myc suivie par une analyse Western blot. Détection et quantification des MycKISS1R sur des transferts est effectuée en utilisant le système Odyssey infrarouge LI-COR. Cette approche peut être utile dans l&#39;étude de la dégradation d&#39;autres protéines d&#39;intérêt aussi bien.

Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders at JoVE.com

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Des mutations dans le récepteur kisspeptine (KISS1R) sont associés à des troubles de la reproduction chez les patients. Nous décrivons ici comment introduire des mutations d&#39;intérêt dans la séquence riches en GC d&#39;KISS1R ainsi que l&#39;utilisation de constructions KISS1R de caractériser la voie de dégradation du récepteur par immunoprécipitation et Western blot

Mutagenèse et d&#39;analyse des mutations génétiques dans la séquence riches en GC récepteur KISS1 identifiés chez l&#39;homme souffrant de troubles de la reproduction

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

mutagenesis-analysis-genetic-mutations-gc-rich-kiss1-receptor

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K vues.  University of Miami Miller School of Medicine. Des mutations dans le récepteur kisspeptine (KISS1R) sont associés à des troubles de la reproduction chez les patients. Nous décrivons ici comment introduire des mutations d'intérêt dans la séquence riches en GC d'KISS1R ainsi que l'utilisation de constructions KISS1R de caractériser la voie de dégradation du récepteur par immunoprécipitation et Western blot

Vidéo: Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Dosage de l&#39;induction neurale dans l&#39;embryon de poulet

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Recherche

Biologie

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Culture primaire et l&#39;électroporation plasmidique de l&#39;Organe de Corti murin.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilisation de la séquence d&#39;arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Cultures alternatives pour souches pluripotentes humaines production cellulaire, le maintien et l&#39;analyse génétique

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Haute résolution Time-lapse d&#39;imagerie et d&#39;analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Approches génétiques et biochimiques pour<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; In vitro</em&gt; Évaluation de Protein oligomérisation: Étude de cas Ryanodine Receptor

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open Source Analyse unique pour particules super-résolution Microscopie avec VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.

Visualisation des Variants génétiques, quelques cibles et des Mutations ponctuelles dans le cadre de tissu morphologique avec un ARN essai In Situ hybridation avec