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The authors declare that they have no competing financial interests.

Par rapport aux méthodes traditionnelles, le test de mutation des cellules germinales TGR fournit un moyen plus rapide, plus économique et plus sensibles de quantifier induit des mutations des cellules germinales in vivo. En évaluant transgène MF directement dans le sperme, par opposition à la descendance, le nombre d&#39;animaux, le temps et les ressources nécessaires pour évaluer le pouvoir mutagène de la lignée germinale d&#39;un seul composé est considérablement réduite. En termes de sensibilité, nous avons pu détecter une augmentation de 2,6 fois importante dans les cellules souches des spermatogonies MF après une exposition à 25 mg / kg FRA utilisant seulement 5 animaux par groupe de dose. En revanche, le test du locus spécifique a été incapable de détecter toute modification significative de MF à cette même dose en utilisant&gt; 3.000 souris dans le groupe exposé et&gt; 500 000 souris témoins 28. En plus de sa pertinence pour les deux enquêtes mécanistes et réglementaires, cette méthode donne l&#39;occasion à des études comparatives entre somatique et germinale ligne Mutatisur les taux. Des données récentes suggèrent que, pour certains agents mutations de cellules germinales peuvent être induites à une concentration inférieure à celle requise pour une mutation somatique. Par exemple, une exposition prolongée à la N-hydroxyméthylacrylamide, un métabolite de la acrylamide cancérigène alimentaire 12, augmente la fréquence des mutations des cellules germinales létales dominantes chez la souris sans affecter la fréquence de micronoyaux dans les cellules rouges du sang, une mesure traditionnelle de la cellule somatique dommages cytogénétiques 13. En outre, l&#39;exposition de souris à deux fréquences de mutation principale et secondaire du tabac la fumée de tabac élevés à répétition en tandem loci d&#39;ADN dans le sperme à des doses qui n&#39;augmentent pas la fréquence des micronoyaux dans le sang 14. Ces résultats remettent en question l&#39;hypothèse selon laquelle les tests de génotoxicité somatique est toujours protecteur de la lignée germinale, et renforcent la demande pour un moyen plus efficace et rentable pour quantifier germe fréquence de mutation cellulaire. Toutefois, la preuve pour préférentiels mutagènes des cellules germinales est encore faible, En grande partie en raison du manque de données disponibles pour comparer les taux de mutation dans les tissus des cellules somatiques et germinales. Le test de mutation TGR permet de tester en parallèle et la comparaison des taux de mutation induite dans plusieurs tissus utilisant le même transgène. Ainsi, le test de mutation comparative en utilisant le test TGR aiderait à combler les lacunes de données autour de la possibilité d&#39;effets sur les cellules germinales préférentiels. Évaluation simultanée de la mutation de cellules somatiques et germinales à des fins réglementaires permettrait également d&#39;améliorer l&#39;efficacité en réduisant le nombre d&#39;animaux nécessaires. La ligne directrice de l&#39;OCDE pour les mutations somatiques recommande un temps d&#39;administration de 28 jours, suivie d&#39;une période d&#39;échantillonnage de trois jours (28 + 3). Analyse de la queue des spermatozoïdes peut offrir une faible sensibilité à ce point de temps, car il cible les cellules exposées surtout pendant les spermatocytes et spermatides phases de la spermatogenèse (figure 3). Les cellules de ces phases ne synthétisent pas l&#39;ADN et perdent progressivement leur capacité de réparation de l&#39;ADN 6 &lt;/ Sup&gt;. En outre, l&#39;échantillonnage de la queue des spermatozoïdes à ce point dans le temps ne permettrait pas de détecter des mutations qui se produisent dans les cellules de spermatogonies et souches. Ainsi, pour l&#39;intégration dans la conception 28 + 3, la directrice de l&#39;OCDE recommande la collecte de cellules germinales à partir des tubules séminifères. Cette population mixte contient des cellules dérivées de la synthèse d&#39;ADN et de types de cellules de réparation compétent, notamment les cellules souches, et sont exposés à travers la majorité des phases spermatogenèse. Toutefois, en raison de la nature mixte de ces cellules, séminifère analyse de cellules de tubules ne fournit pas d&#39;information spécifique à la phase. En outre, il est à craindre que la présence de cellules non-cibles peuvent influencer le MF observé (par exemple faux positifs appels mutagène sur les cellules germinales en raison de la contamination de cellules somatiques mutés, ou dilution d&#39;un signal de cellules germinales muté à partir de cellules germinales réparation de l&#39;ADN déficientes) . Actuellement, il n&#39;existe pas de données suffisantes pour conclure si les résultats des cellules des tubules séminifères à 28 + 3 offre la même sensibilité et la spécificité d&#39;uns de la queue des spermatozoïdes à des moments ultérieurs. Notre laboratoire compare actuellement les CM induits dans les cellules des tubules séminifères et la queue des spermatozoïdes prélevés après différents temps d&#39;échantillonnage pour aborder cette question. Nous notons que la directrice de l&#39;OCDE suggère une période d&#39;échantillonnage de remplacement de 28 jours pour les tissus en division lente tels que le foie qui peut également être adapté à l&#39;analyse des cellules germinales. Néanmoins, les données disponibles sont encore insuffisantes et nous sommes actuellement pas en mesure de recommander un modèle expérimental unique pour l&#39;analyse simultanée de cellules somatiques et les cellules germinales en utilisant le test de mutation TGR à des fins réglementaires. Une des caractéristiques de cet essai qui devrait être noté est que les événements de mutation sont évalués sur un transgène non murin. Cependant, il ya suffisamment de preuves pour suggérer que le transgène répond aux agents mutagènes environnementaux d&#39;une manière similaire à des gènes endogènes 20. En outre, parce que les origines précises des événements mutationnels indépendants sont difficiles àrésoudre, les résultats sont généralement rapportées comme une fréquence de mutants (par opposition à une fréquence de mutation). La fréquence de mutation peut être effectivement résolu que si les résultats sont corrigés pour l&#39;expansion clonale (par exemple. La division et la multiplication d&#39;une cellule mutée qui peut contribuer à la fréquence observée des mutants transgéniques) par séquençage d&#39;ADN. Le séquençage des transgènes mutants peut être effectuée pour caractériser les mutations de lacZ, et identifier les mutants qui peuvent être dérivés à partir des événements de l&#39;expansion clonale, bien que cela augmente considérablement le temps et le coût de l&#39;analyse. En plus du gène lacZ, theλgt10 vecteur transgénique héberge un gène par mutation reporter alternatif dépendant de la température: une variante du gène λ du cil, ce qui est plus court (294 pb par rapport à la 3021 pb lacZ, figure 1) et plus facile à la séquence 29. Le séquençage permet également l&#39;analyse du spectre de mutation induite, donnant un aperçu de la mutatiomécanisme final du composé en question. Un exemple extrême de l&#39;expansion clonale est l&#39;apparition d&#39;un &quot;jackpot&quot; mutation (c&#39;est à dire., Mutations transgéniques à un stade très précoce du développement d&#39;un organe qui contribuent à une MF considérablement élevée, parfois des centaines de milliers de fois supérieures à fond). Animaux ou des tissus avec un &quot;jackpot&quot; mutation doivent être retirés de l&#39;analyse. Le test que nous avons décrit est largement applicable à d&#39;autres modèles, tels que la TGR BigBlue souris et le rat, la souris et le plasmide lacZ, qui abritent une mutation vecteurs rapporteurs similaires (passés en revue dans 20). La grande majorité des études sur les cellules germinales menées à ce jour qui emploient des méthodes similaires ont porté presque exclusivement sur ​​mutagènes bien caractérisées telles que FRA et le rayonnement (revue dans 30). Il est prévu que la récente publication de la ligne directrice d&#39;essai de l&#39;OCDE pour l&#39;essai TGR, ce test serade plus en plus populaire pour le dépistage chimique et évaluation réglementaire. L&#39;incorporation de la cellule germinale test de mutation TGR dans une batterie de test réglementaire comblera le vide existant en permettant une évaluation efficace de l&#39;induction de mutations dans les cellules germinales 11. De plus, ce dosage peut être utilisé pour mesurer MF dans pratiquement n&#39;importe quel tissu, en fournissant un moyen adapté pour comparer les sensibilités relatives des cellules somatiques et les cellules germinales à l&#39;induction de mutations par points de terminaison à des agents environnementaux génétiques identiques.

Mutations de l&#39;ADN sporadiques dans la lignée germinale peuvent conduire à la réussite de la reproduction réduite et, si hérité, peuvent provoquer une maladie génétique ou une prédisposition accrue au cancer chez les enfants 1-3. Preuve substantielle démontre qu&#39;une grande proportion de mutations de novo sont héritées de la lignée germinale paternelle 4, et que le nombre de mutations dans la descendance est positivement corrélée avec l&#39;âge du père au moment de la conception 5. La proportion plus élevée de mutations de sexe masculin est considéré comme un résultat de la différence d&#39;âge au cours de la gamétogenèse entre les sexes, le plus grand nombre de divisions cellulaires de la spermatogenèse par rapport au nombre de divisions cellulaires oogenic dans la lignée germinale femelle 2, et une diminution progressive de l&#39;ADN réparer l&#39;efficacité avec l&#39;âge chez les hommes. Tous ces facteurs contribuent à une probabilité accrue d&#39;erreurs de réplication dans la lignée germinale mâle 6. Cependant, l&#39;impact de l&#39;exposition paternelle à Envirofacteurs nnement sur ​​la fréquence des mutations de novo reste incertaine. Néanmoins, un grand nombre d&#39;agents d&#39;environnement sont connues pour induire des mutations germinales chez les rongeurs 7, et il existe des preuves croissantes que certains de ces agents peut aussi affecter la lignée germinale humaine 8. Malgré ces préoccupations, les produits chimiques sont régulièrement testés pour leur capacité à induire des mutations dans les cellules somatiques à des fins réglementaires et il est généralement admis que les tests somatiques sont suffisantes pour protéger la lignée germinale. Par conséquent, les produits chimiques ne sont que rarement évalués pour leur capacité à induire des mutations germinales. Tests de mutagénicité des cellules germinales Une raison a été largement omis de la réglementation processus de prise de décision est un manque de méthodes pratiques. Méthodes basées sur des rongeurs traditionnels, tels que les mortels 9 et 10 tests spécifiques locus dominantes, estiment les taux de mutation des cellules germinales en marquant phénotypes mutants dans des embryons ou des descendants deparents exposés. Ces tests nécessitent l&#39;utilisation d&#39;un très grand nombre d&#39;animaux, de temps et de ressources pour acquérir des résultats statistiquement significatifs. Bien que plusieurs méthodes modernes de quantification de mutation des cellules germinales ont récemment vu le jour, beaucoup souffrent de lacunes en termes de praticité, l&#39;efficacité et la pertinence biologique. Par exemple, répéter mutations de longueur à répétition en tandem simples (RETE) loci élargi peut être quantifiée dans les cellules germinales mâles utilisant une approche PCR de molécule unique 15. Toutefois, l&#39;exécution de cette méthode peut être techniquement difficile et laborieux, et contrairement à des mutations ponctuelles, la signification biologique et la santé des changements dans la longueur de répétition du RETE loci très instable restent peu claires 16. Technologies de séquençage du génome entier modernes peuvent fournir une foule de données biologiquement significative lorsqu&#39;elle est appliquée au problème de mutations héréditaires 4,17, mais le coût élevé, les taux d&#39;erreur élevés, validation associé requispour confirmer les mutations, et bioinformatiques défis limiter encore l&#39;application systématique de cette option à titre d&#39;essai réglementaire 18. Ici, nous décrivons une méthode pratique pour quantifier directement les mutations induites dans les cellules germinales de souris mâles transgéniques. Ce protocole est décrit par le modèle de MutaMouse transgénique, qui a de multiples copies d&#39;un vecteur concaténés λgt10 de phage recombinant contenant un gène rapporteur lacZ intégré Escherichia coli dans les deux copies du chromosome 3 19 (figure 1). Ce protocole est également s&#39;appliquer à d&#39;autres rongeurs transgéniques (TGR) modèles basés sur les mêmes principes (BigBlue souris et le rat, ou lacZ plasmide souris, etc.) Ou légèrement différents gènes rapporteurs (de la souris delta gpt et le rat, modèles TGR examinés en Lambert et . al 20). Cette méthode est basée sur l&#39;essai de mutation décrit dans l&#39;une TGR récemment publiéet révisée de l&#39;OCDE directrice pour l&#39;essai 21 et nous élaborons sur les considérations spéciales nécessaires pour accueillir évaluation des mutations dans la lignée germinale mâle en raison des caractéristiques uniques de la spermatogenèse. En bref, l&#39;essai consiste à exposer des souris mâles transgéniques à une substance mutagène, suivie par un temps d&#39;échantillonnage lorsque les lésions pré-mutation sont fixés à des mutations stables. A l&#39;instant d&#39;échantillonnage choisi, les souris sont euthanasiées et les cellules germinales sont recueillies à partir de l&#39;une ou l&#39;autre de la queue de l&#39;épididyme ou les tubes séminifères. Comme nous le verrons, des effets mutagènes à différents stades de la spermatogenèse peut être déterminé en sélectionnant le délai entre l&#39;exposition et la collecte de l&#39;échantillon. Inserts transgéniques, comprenant des copies multiples du génome du phage λ par cellule, sont isolés de l&#39;ADN génomique des cellules germinales et emballés dans des capsides vides de phage λ créant des particules de phage infectieux de λ qui sont ensuite utilisés pour infecter un E. hôte coli. Les bactéries infectées sont cultivées sur sélecmédias tives qui peuvent distinguer les cellules contenant un vecteur d&#39;une copie mutée de lacZ de cellules hébergeant de type sauvage lacZ. L&#39;effet mutagène de l&#39;exposition sur la lignée germinale mâle est déterminée en comparant la fréquence des transgènes mutantes entre le contrôle et les souris traitées (Figure 2, examinées dans Lambert et al. 20). Un grand nombre de cellules germinales peut être analysée à partir d&#39;une seule souris, ce qui donne une sensibilité supérieure ce dosage par rapport aux procédés traditionnels, tout en réduisant le nombre d&#39;animaux requis. Et parce que aucun équipement ou de formation spécialisée est nécessaire, ce test fournit une option pratique et efficace pour les tests de mutation des cellules germinales dans la plupart des laboratoires moléculaires modernes de la biologie de toxicologie /. Une condition essentielle pour l&#39;application effective de l&#39;essai de mutation des cellules germinales TGR est une compréhension du cycle de la spermatogenèse (Figure 3). Le temps pour les cellules germinales de souris au progrès de stcellules em dans les tubules séminifères à spermatogonies, spermatocytes, spermatides, et enfin à la maturité des spermatozoïdes dans l&#39;épididyme (c.-à-la spermatogenèse.) est d&#39;environ 49 jours. Mutation peut se produire à diverses étapes de ce cycle et est souvent spécifique composé. Deux caractéristiques clés qui revêtent un intérêt particulier à la mutagenèse dans les cellules germinales mâles sont l&#39;arrêt de la synthèse de l&#39;ADN lors de la méiose tôt, et la perte progressive de la capacité de réparation d&#39;ADN 6 à la fin de l&#39;après-méiose, deux processus qui sont nécessaires pour l&#39;induction et la fixation de la plupart des mutations. En raison de ces caractéristiques uniques de la spermatogenèse, il ya trois variables expérimentales critiques pour la conduite de la TGR mutation des cellules germinales essai: (1) le temps de l&#39;administration du composé d&#39;essai; (2) le temps d&#39;échantillonnage; et (3) la sélection de la population de cellules germinales de recueillir pour analyse (figure 3 et tableau 1). Le temps d&#39;administration est le experimeNTAL variables qui détermine la façon dont les cellules cibles longues sont exposées aux composés d&#39;essai. La longueur de la durée d&#39;administration peut également être utilisé pour cibler l&#39;exposition à des types cellulaires spécifiques ou des phases de la spermatogenèse. Par exemple, une administration quotidienne unique pourrait être utilisée pour déterminer les effets d&#39;une exposition de courte durée sur un type cellulaire particulier. De même, l&#39;exposition peut être porté à toute une phase de la spermatogenèse, par exemple en ciblant les spermatocytes seule division méiose, ou division mitotique des spermatogonies en utilisant un temps d&#39;administration de 2 semaine et un temps d&#39;échantillonnage approprié. Temps de l&#39;administration chronique et subchronique sont utilisées pour évaluer les effets de l&#39;exposition à long terme, pour assurer la distribution de pharmacocinétique du composé suffisante de test, ou de permettre une accumulation suffisante de mutations de mutagènes faibles (par exemple le temps d&#39;administration de 28 jours recommandé dans le test de l&#39;OCDE directive). Temps d&#39;échantillonnage est la variable critique pour déterminer à quila phase de la spermatogenèse les cellules cibles étaient dans au moment de l&#39;exposition. La période d&#39;échantillonnage dicte combien de temps, et donc combien plus loin le long du cycle de la spermatogenèse, les cellules passer après l&#39;exposition. Par exemple, pour étudier les effets dans les spermatogonies de cellules souches, un temps d&#39;échantillonnage&gt; 49 jours est nécessaire si la collecte de sperme en pleine maturité, ou&gt; 42 jours si la collecte de cellules germinales immatures à partir des tubules séminifères, afin de s&#39;assurer que toutes les cellules recueillies ont eu suffisamment de temps pour développer à partir de cellules exposées tiges. Il est important de noter que le temps d&#39;échantillonnage d&#39;au moins 70 jours serait préférable de démontrer un véritable effet sur les cellules souches à prévoir suffisamment de temps pour la distribution de pharmacocinétique de la substance toxique, pour l&#39;élimination des cellules exposées à des phases ultérieures de la spermatogenèse, et pour tenir compte de une période de stérilité temporaire qui peut se produire ~ 6 semaines après l&#39;exposition à des composés hautement mutagènes 22. De même, un temps d&#39;échantillonnage de 21 jours permettrait de garantir que les spermatozoïdes colleDirection exécutive de l&#39;épididyme de la queue de l&#39;auraient tout juste de terminer la méiose, le dernier jour de l&#39;exposition. Les cellules germinales peuvent être collectées comme spermatozoïdes matures de la queue de l&#39;épididyme, ou un mélange de différents types de tubes séminifères des cellules de la spermatogenèse. Sperme mûr dans le reste de la queue de ~ 3 jours, ce qui permet de déterminer avec précision par rapport au type de cellule ou de la phase de la spermatogenèse à partir de laquelle le sperme est issue de tout protocole expérimental donné. Ainsi, l&#39;analyse de la queue de sperme permis hautement recherches sur les effets de mutations spécifiques au stade ciblé. D&#39;autre part, les suspensions de cellules recueillies à partir des tubules séminifères contiennent un mélange de différents types de cellules germinales dans les différentes phases du développement, et offrent donc une moins bonne résolution de la phase de la spermatogenèse, dans lequel les mutations sont originaires. En outre, les suspensions de cellules récupérées à partir des tubules séminifères ont tendance à contenir une représentation des spermatides-dessus, suivie par les spermatocytes, et very peu spermatogonies et les cellules souches (ces proportions sont représentés par des barres blanches gradués sur la figure 3). En outre, les suspensions préparées à partir des tubules séminifères peuvent également contenir diverses cellules somatiques. Ainsi, en raison tant de types de cellules sont présentes, les effets de mutations peuvent être influencées par une variété de cellules non cibles. Toutefois, la collecte des échantillons de tubes séminifères offre une option économique pour le dépistage simultané de plusieurs types de cellules germinales, et une intégration facile de l&#39;analyse des cellules germinales dans le protocole d&#39;essai standard de l&#39;OCDE pour une mutation somatique. Pour réitérer, selon les besoins du chercheur, le temps d&#39;administration, la durée de l&#39;échantillonnage et de la population de cellules recueillies peuvent être ajustés pour interroger les effets de l&#39;exposition à divers types de cellules et à des phases différentes de la spermatogenèse. En choisissant soigneusement ces variables, les expériences peuvent être conçus pour des études mécanistiques ciblées, ou pour le test réglementaire plus généraliséefins ing. Pour atteindre la maîtrise de l&#39;analyse, nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;une administration orale aiguë de 100 mg / kg de N-éthyl-N-nitrosourée (FRA), suivie par une période d&#39;échantillonnage de 70 jours de contrôle positif. Analyse de la queue des spermatozoïdes vise ainsi les cellules souches des spermatogonies (figure 3), qui présentent généralement une multiplication par 4-5 dans la fréquence des mutants (MF) par rapport aux témoins suite à cette dose très mutagène de FRA. Il est à noter que cette dose est connue pour induire la stérilité six semaines après l&#39;exposition, ainsi il peut ne pas être une dose de commande approprié pour la réduction des temps d&#39;échantillonnage. Cette dose sera également produire une augmentation détectable dans la plupart des tissus MF 20 somatiques. Les résultats représentatifs présentés ci-dessous ont été recueillies à la suite d&#39;un régime d&#39;exposition aiguë +70 utilisant trois doses de FRA jusqu&#39;à et y compris 100 mg / kg.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1326">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:664px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MutaMouse</td>
			<td>Covance</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">E.coli (lacZ-/galE-)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;">See reference 25 in manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>3001-2-40</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (D-PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690 FLUKA</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>2/10/7900</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lennon LB broth base</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780-029</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel mesh filter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3770</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transpack packaging extract</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200220</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH)</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ampicilin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11593-027</td>
			<td style="width:664px;">prepare 20 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-024</td>
			<td style="width:664px;">prepare 5 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15509-097</td>
			<td style="width:664px;">Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenyl-&#946;-D-galactopyranoside (P-Gal)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6501</td>
			<td style="width:664px;">dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td style="width:664px;">prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 &#181;l per sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate (NaAc)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td style="width:664px;">prepare 3M solutution, pH 5.2</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4390</td>
			<td style="width:664px;">prepare 10% solution in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1 M MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">24.6 g MgSO4&#183;7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">20% maltose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4&#183;7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4&#7506;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Bottom agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X&#160; 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C before pouring into Petri plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline sodium citrate (SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">SM Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4&#183;7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Top agar, mutant plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C. Add MgSO4 to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Top agar, titre plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transgenic rodent assay for quantifying male germ cell mutant frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

Avec un nombre de plages moyenne de 200 000 plaques par animal, on observe généralement un fond moyenne MF d&#39;environ 2,8 x 10 -5 dans les cellules germinales mâles avec une déviation standard de 1,7 x 10 -5 dans nos groupes de contrôle (basé sur les données de huit indépendant expériences). Avec ce nombre de plaque, le niveau de fond et de la variance, les groupes de dose avec n = 5 animaux chacun sont suffisants pour détecter une augmentation de 2 fois dans MF avec une puissance&gt; 0,8. Les résultats sont généralement signalées dans les tableaux ou graphiques formats. Tableau 2 et figure 6 montrent des résultats représentatifs de la queue des spermatozoïdes des hommes MutaMouse (n = 5 par groupe) exposés à une dose unique orale aiguë de 0, 25, 50 et 100 mg / kg N-éthyl-N-nitrosourée (ENU), suivie par un temps d&#39;échantillonnage de 70 jours. Cette période de 70 jours permet de mesurer des événements mutationnels qui ont eu lieu dans les spermatozoïdes qui sont des cellules souches des spermatogonies au moment de l&#39;exposition (Figure 3). La densité de la plaque sur des plaques typiques mutantes et titrage sont présentés sur la figure 7. Comme représenté dans le tableau 2 et figure 6, une exposition de courte durée ENU induit une augmentation dose-dépendante significative de la MF de cellules souches des spermatogonies. La faible dose a induit une augmentation significative de 2,6 fois par rapport aux témoins, ce qui a une ligne de base MF de 2,6 x 10 -5. Induction maximale a eu lieu dans la dose élevée, ce qui a provoqué une augmentation d&#39;un facteur 4,4 par rapport aux témoins. Un exemple de cette analyse effectuée sur les cellules des tubules germinales séminifères se trouve à Douglas et al. 27, où MF a été déterminée dans des cellules de tubule germinales à différents intervalles de temps après une répétition de l&#39;injection intra-péritonéale de 5 jours de 50 mg / kg ENU. Dans cette étude, la proportion de mutants dans les cellules séminifères ont augmenté jusqu&#39;à 15 jours après le traitement et sont restées constantes par la suite. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr tr=""><td> Expoque le régime </td><td> Des tissus prélevés </td><td> Type de cellules recueillies (cellule cible) </td><td> Phase de cellule cible au début de l&#39;exposition </td><td> Phases passés lors de l&#39;exposition </td></tr><tr><td> Aiguë + 70 </td><td> Cauda </td><td> Spermatozoïdes matures </td><td> les cellules souches </td><td> les cellules souches </td></tr><tr><td> 14 + 21 </td><td> Cauda </td><td> Spermatozoïdes matures </td><td> Spermatogonies </td><td> Spermatide </td></tr><tr><td> 14 + 35 </td><td> Cauda </td><td> Spermatozoïdes matures </td><td> les cellules souches </td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td> + 28 3 </td><td> Cauda </td><td> Spermatozoïdes matures </td><td> Spermatocyte </td><td> Spermatocyte Spermatide Spermatozoïdes matures </td></tr><tr><td></td><td> Tubules </td><td> les cellules souches </td><td> les cellules souches </td><td> les cellules souches </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatogonies </td><td> Spermatogonia </td><td> Spermatogonies </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatocyte </td><td></td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatide </td><td></td><td> Spermatide </td></tr><tr><td> 28 + 49 </td><td> Cauda </td><td> Spermatozoïdes matures </td><td> cel souches </td><td> les cellules souches </td></tr><tr><td></td><td> Tubules </td><td> les cellules souches Spermatogonies Spermatocyte Spermatide </td><td> les cellules souches </td><td> les cellules souches </td></tr></tbody></table> Tableau 1 Les types de cellules et les phases de la spermatogenèse qui sont ciblés par le transgénique essai rongeur de mutation par divers modèles expérimentaux. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Groupe dose </td><td> Animaux # </td><td> Mutant PFU </td><td> Total des PFU </td><td> MF (x10 -5) </td><td> Moyenne MF (x 10 -5) </td><td> Facteur de changement </td><td> p-valeur </td></tr><tr><td> Contrôle </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 180245 </td><td> 2.8 </td><td> 2.6 </td><td> 1.0 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 137835 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 11 </td><td> 385672 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> 431396 </td><td> 0,5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 152413 </td><td> 3.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 mg / kg </td><td> 6 </td><td> 17 </td><td> 162353 </td><td> 10.5 </td><td> 6.9 </td><td> 2.6 </td><td> 0,0002 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 14 </td><td> 150094 </td><td> 9.3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 154401 </td><td> 2.6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 9 </td><td> 9 </td><td> 154401 </td><td> 5.8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 </td><td> 12 </td><td> 196978 </td><td> 6.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 mg / kg </td><td> 11 </td><td> 17 </td><td> 155727 </td><td> 10,9 </td><td> 9.3 </td><td> 3.6 </td><td> &lt;0,0001 </td></tr><tr><td></td><td> 12 </td><td> 11 </td><td> 135847 </td><td> 8.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 13 </td><td> 25 </td><td> 193499 </td><td> 12,9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 14 </td><td> 12 </td><td> 133859 &lt;/ Td&gt; <td> 9.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 </td><td> 14 </td><td> 252807 </td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100 mg / kg </td><td> 16 </td><td> 26 </td><td> 170968 </td><td> 15.2 </td><td> 11,5 </td><td> 4.4 </td><td> &lt;0,0001 </td></tr><tr><td></td><td> 17 </td><td> 28 </td><td> 234584 </td><td> 11,9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 18 </td><td> 10 </td><td> 145289 </td><td> 6.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 19 </td><td> 35 </td><td> 292236 </td><td> 12,0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 </td><td> 22 </td><td> 190848 </td><td> 11,5 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Le tableau 2 de la fréquence de mutants de la queue du sperme dans lacZ mâle transgénique de mglace exposée aiguë à FRA quand ils étaient les spermatogonies souches (de temps d&#39;administration = 1 journée, le temps d&#39;échantillonnage = 70 jours). PFU = plaque forming unit, MF = fréquence des mutants. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig1highres.jpg" /> Figure 1: Une représentation schématique de la construction du phage λgt10. <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig2highres.jpg" /> Figure 2: Un aperçu du rongeur germe test de mutation des cellules transgéniques. <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" /> Figure 3 Une vue schématique de la spermatogenèse chez la souris et les types de cellules et de phases qui sont ciblés par le transgénique essai rongeur de mutation par différents modèles expérimentaux. Remarque: Les barres blanches diplômés représentent la proportion relative des types de cellules présentes dans les suspensions cellulaires préparées à partir des tubules séminifères (c. spermatides&gt; Spermatocytes&gt; spermatogonies&gt; cellules souches). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig4highres.jpg" /> Figure 4 Collection de la queue de l&#39;épididyme de souris. A) Faire une incision dans l&#39;abdomen vers le scrotum. B) Identifier le coussinet adipeux de l&#39;épididyme. C) Tirez doucement sur ​​le coussinet adipeux de faire ressortir les testicules et de l&#39;épididyme. D) Recherchez et exciser la queue de l&#39;épididyme. Figure 5 Préparation de la suspension de cellules germinales à partir des tubules séminifères. A) Une incision est faite dans la capsule épithéliale du testicule, de l&#39;exposition des tubes séminifères. B) Les tubes séminifères sont pressés hors de la capsule. C) un rouleau de tissu est délicatement passé sur les tubes à un angle de 5-10 ° par rapport à libérer les cellules germinales contiennent. D) La suspension de cellules germinales sont collectées pour un autre traitement. <img alt="Figure 6" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig6highres.jpg" /> Figure 6 Représentation graphique de la fréquence des mutations de lacZ dans MutaMouse sperme exposé aiguë que les cellules souches de FRA (n = 5). Chaquetriangle représente la MF d&#39;un animal. * p &lt;0,05 comme déterminé par régression de Poisson. <img alt="Figure 7" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig7highres.jpg" /> Figure 7 plaques d&#39;agar représentatifs de l&#39;essai de mutation de rongeurs transgéniques avec des plaques formées sur une pelouse de E. coli bactéries hôtes. A) Les plaques &quot;mutants&quot; auront très peu de plaques (marqués par des flèches), en particulier dans les groupes de dose de contrôle, qui de temps en temps avoir zéro plaques sur des plaques. B) Les plaques &quot;de titre&quot; peuvent avoir des centaines de plaques.

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Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Rongeurs transgéniques test pour quantifier Homme cellules germinales Mutant Fréquence

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

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Biology

16.1K vues.  Environmental Health Centre. De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

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Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

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Biologie

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Mise à jour embryonnaires de souris des cellules souches basée Assay pour quantifier l&#39;efficacité d&#39;induction cardiogénique

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Quantifier la fréquence des tumeurs se propageant Cellules utilisant Limiter la greffe de cellules syngéniques de dilution dans Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Transplantation des cellules germinales et de tissus testiculaire xénogreffe chez la souris

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell migration, gene expression, cell cycle progression and cell adhesion 1. Rho proteins are molecular switches that are active in GTP-bound and inactive in GDP-bound state. Their activation is mediated by a family of Guanine-nucleotide Exchange Factor (GEF) proteins. Rho-GEFs constitute a large family, with overlapping specificities 2. Although a lot of progress has been made in identifying the GEFs activated by specific signals, there are still many questions remaining regarding the pathway-specific regulation of these proteins. The number of Rho-GEFs exceeds 70, and each cell expresses more than one GEF protein. In addition, many of these proteins activate not only Rho, but other members of the family, contributing further to the complexity of the regulatory networks. Importantly, exploring how GEFs are regulated requires a method to follow the active pool of individual GEFs in cells activated by different stimuli. Here we provide a step-by-step protocol for a method used to assess and quantify the available active Rho-specific GEFs using an affinity precipitation assay. This assay was developed a few years ago in the Burridge lab 3,4 and we have used it in kidney tubular cell lines 5,6,7. The assay takes advantage of a "nucleotide free" mutant RhoA, with a high affinity for active GEFs. The mutation (G17A) renders the protein unable to bind GDP or GTP and this state mimics the intermediate state that is bound to the GEF. A GST-tagged version of this mutant protein is expressed and purified from E. coli, bound to glutathione sepharose beads and used to precipitate active GEFs from lysates of untreated and stimulated cells. As most GEFs are activated via posttranslational modifications or release from inhibitory bindings, their active state is preserved in cell lysates, and they can be detected by this assay8. Captured proteins can be probed for known GEFs by detection with specific antibodies using Western blotting, or analyzed by Mass Spectrometry to identify unknown GEFs activated by certain stimuli.

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

The method presented here describes an assay to follow activation of RhoA specific GDP/GTP Exchange Factors (GEFs) in cultured cells by making use of a mutant RhoA GST fusion protein that has high affinity for activated GEFs. GEFs are precipitated from cell lysates, detected by Western blotting and quantified by densitometry.

Précipitation par affinité des actifs des Rho GEF l&#39;aide d&#39;un TPS-étiqueté Mutant Rho protéines (TPS-RhoA (G17A)) à partir de lysats cellulaires épithéliales

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

Séparation des types cellulaires de la spermatogenèse Utilisation STA-PUT vitesse de sédimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex vivo Culture de la drosophile pupes testicule et seul mâle kystes lignée germinale: Dissection, l&#39;imagerie et le traitement pharmacologique

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

La génération d&#39;transgénique<em&gt; Hydra</em&gt; Par micro-injection d&#39;embryons

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Un criblables<em&gt; In Vivo</em&gt; Essai de modulateurs mitochondriale utilisant transgénique Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Moyen-throughput Screening tests pour l’évaluation des effets sur Ca2 +-signalisation et Acrosome Reaction en sperme humain

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...