Les auteurs remercient le Dr Paul Janmey à l&#39;Université de Pennsylvanie pour fournir des lignées cellulaires utilisées dans le présent document. QW reconnaît également JF Byfield et Evan Anderson pour leurs discussions éclairées sur les techniques AFM.

1. Calibrer la constante de ressort cantilever <ol><li> Chargez le cantilever dans le AFM conformément aux instructions du fabricant. Il est nécessaire de nettoyer le support en porte à faux avec de l&#39;éthanol avant toute expérimentation. Cela permettra de limiter la contamination bactérienne de la culture au cours des mesures AFM. </li><li> Calibrer InvOLS (Inverse Sensibilité de levier optique). Ce paramètre décrit la quantité de réponse de la photodiode (Volts) par nanomètre de déflection du cantilever. </li><li> Charger une lame de verre propre sur la scène de l&#39;échantillon, puis installez la tête AFM et régler le faisceau laser et l&#39;alignement conformément aux instructions du fabricant. Engager la pointe de l&#39;AFM sur la lame de verre. </li><li> Avec l&#39;élément piézo retirée, réaligner le miroir à une lecture de la photodiode de -2 V. effectuer une mesure de spectroscopie de force avec un seuil de déclenchement (réponse maximale de photodiodes) de 2 V. </li><li> Avec le piezo retirée, réaligner le miroir à une lecture de la photodiode de -2 V. Effectuez une force mesure spectroscopie avec un seuil de déclenchement (maximum de réponse de la photodiode) de +2 V. Remarque: Les valeurs de tension ici sont spécifiques à l&#39;asile AFM. Cette valeur doit être définie selon les spécifications fournies par le fabricant. Après l&#39;acquisition des données est terminée, un zoom sur la région firme contact de la courbe de force. Effectuez un ajustement linéaire dans cette région pour trouver la pente, qui sera en V / nm. La réciproque de cette valeur décrit la sensibilité optique de l&#39;ensemble cantilever-photodiode. </li><li> Rétablir l&#39;alignement du miroir à une déviation libre de 0 V. </li><li> Calibrer la constante de ressort en porte à faux. Procédé thermique air est utilisé pour déterminer la constante de ressort en porte à faux 28. </li><li> Après avoir calibré le InvOLS, élever le scanner loin de la scène de l&#39;échantillon tel qu&#39;il n&#39;y a pas d&#39;interactions entre la pointe et l&#39;échantillon. </li><li> Commencez la capture des données thermiques. Au cours de ce processus, la vibration thermique de la poutre en porte à faux est Recorded. Le logiciel AFM analyse un spectre de puissance d&#39;une telle vibration thermique et parcelles dans une fenêtre de données. </li><li> Après quelques secondes d&#39;acquisition de données, effectuer un ajustement pour le segment de données centrée sur le bas-fréquence (résonance fondamentale) de pointe pour déterminer la constante de rappel. </li></ol> 2. Chargement de l&#39;échantillon <ol><li> Installez l&#39;accessoire de chauffe-plat sur la scène AFM, si ce n&#39;est pas déjà équipé. </li><li> Réglez la température à 37 ° C, et d&#39;attendre 20 min pour que le système atteigne un équilibre thermique stable. </li><li> Placez la boîte de culture sur la scène AFM et le fixer à l&#39;aide de la pince fournie avec le chauffe-plat. Il est important de réduire au minimum le délai entre le retrait de l&#39;antenne de l&#39;incubateur et le placer sur la scène, afin d&#39;éviter un traumatisme pour les cellules. Pour des mesures de plus de 30 min, média indépendant CO 2 devrait être utilisé pour remplacer le milieu de culture normal. </li><li> Appliquez une petite goutte de 37 ° C le milieu de culture à la pointe du til AFM cantilever, et baisser la tête AFM jusqu&#39;à ce que la pointe est juste immergé dans un liquide. </li><li> Utilisation du haut-vue de la caméra CCD, réaligner le faisceau laser sur le cantilever (l&#39;alignement dans un liquide sera différente de celle de l&#39;air, à cause de la variation de l&#39;indice de réfraction du milieu). </li><li> Engager la pointe de l&#39;AFM sur une zone propre de la boîte de culture. </li><li> Effectuer le calibrage des InvOLS tel que décrit ci-dessus, pour la sensibilité en porte à faux dans le milieu liquide. </li></ol> Remarque: a) Lorsque les cellules sont mises en culture sur des hydrogels, l&#39;étalonnage de InvOLS doivent être effectués à l&#39;avance sur la surface de fond d&#39;une boîte de culture remplie de milieu de culture de cellules. Lors du passage à des échantillons de cellules, une attention particulière doit être portée à ne pas modifier l&#39;alignement du faisceau laser avec la console. b) InvOLS doit être recalibré à chaque fois qu&#39;il ya un changement dans l&#39;alignement laser. c) Il est également recommandé de prendre InvOLS que la moyenne de la valeur à partir de plusieurs courbes d&#39;étalonnage, sepuis chaque calibrage génère un autre InvOLS. La variation de InvOLS est, cependant, comparé à la valeur moyenne de petite taille. Par exemple, l&#39;étalonnage d&#39;un Bruker DNP-10 en porte à faux avec une constante de 0,06 N / m en liquide de 100 fois au printemps produire une valeur de InvOLS moyenne de 66,3 nm / V, avec un écart type de seulement 0,5 nm / V. 3. Collecte courbes de force d&#39;indentation Cell <ol><li> Sélectionnez une cellule pour l&#39;indentation. A l&#39;aide d&#39;un microscope optique, déplacer la platine pour positionner le porte à faux au-dessus de la cellule de telle sorte que la pointe se situe dans la région péri-noyaux. Le réglage précis de la position en porte à faux peut être réalisée en appliquant des compensations à l&#39;X et Y scanners. Remarque: Le cantilever AFM doit être retirée de la surface de l&#39;échantillon tout en déplaçant la platine porte-échantillon pour sélectionner une cellule cible. Cela protège le cantilever de frapper dans l&#39;échantillon, puisque la surface de l&#39;échantillon ne peut être plat. </li><li> Commute en mode de spectroscopie. Réglez l&#39;indentationtaux dans la plage de 1 à 10 um / sec, assez faible pour éviter des effets hydrodynamiques. </li><li> Réglez le point de déclenchement de déviation, ce qui limite l&#39;effort maximal en retrait pour éviter d&#39;endommager les cellules. Sélectionner l&#39;option de déclenchement relative, ce qui permettra de corriger toute dérive dans le signal de déviation. A force maximale de 2 nn est un bon point de départ pour la plupart des échantillons. Cette valeur doit cependant être ajustée en fonction de la rigidité de l&#39;échantillon. Pour les échantillons mous une valeur inférieure devrait être utilisé pour éviter indentation excessive de l&#39;échantillon. Pour les échantillons raides une grande valeur doit être utilisée pour générer indentation mesurable. </li><li> De régler la distance de la force suffisamment grande pour que la pointe sera complètement détachée de la cellule entre la mesure de force. Habituellement, la distance de la force est fixé à 5 um. </li><li> Commander l&#39;AFM de prendre une courbe de force unique. </li><li> Recueillir au moins trois courbes de force à différents endroits dans la région péri-noyaux de chaque cellule. Bien qu&#39;il soit avantageux de prendre multiplecourbes sur chaque cellule de données statistiques fiables, en prenant trop de courbes de force peuvent conduire à des changements dans la rigidité de la cellule due au stress de la sonde AFM. </li><li> Lorsque la collecte des données est terminée, retirer la pointe, et répétez les étapes 3.1-3.6 pour autant de cellules que nécessaire pour de bonnes données statistiques sur la rigidité de la cellule sous une certaine condition de l&#39;échantillon. Habituellement, les 30 cellules sont mesurées pour chaque condition. </li></ol> Pour caractériser la répartition de rigidité dans une cellule unique, le mode de la carte de force est appliquée. Dans le mode Force-carte, définissez une taille de numérisation afin d&#39;inclure la région d&#39;intérêt; définir une résolution appropriée; définir les paramètres d&#39;indentation que ceux choisis pour les courbes de force mono; l&#39;AFM sera alors raster dans la zone de l&#39;échantillon défini et de prendre des courbes de force mono au niveau de chaque pixel dans la région de l&#39;échantillon. 4. Analyse des données Les courbes de force enregistrées sont analysées à l&#39;aide d&#39;une procédure MATLAB coutume de calculer la rigidité de la cellule. Ce qui suit est une brève description de la procédure MATLAB: <ol><li> Le programme MATLAB identifie le point de contact coordonne z0 et d0 (voir la figure 1) en utilisant un algorithme adopté d&#39;une méthode publiée par Lin et al 29.: </li><li> Pour chaque point de données dans la courbe de force, effectuer un ajustement linéaire des données vers la gauche du point d&#39;intérêt, et un modèle Hertz correspond à la droite (à l&#39;aide du point sélectionné en tant que premier point de contact), jusqu&#39;à l&#39;ensemble indentation maximale (200-300 nm recommandé). </li><li> Pour chaque point, calculer l&#39;erreur RMS relative des deux crises et additionner ces valeurs. </li><li> Le point qui atteint l&#39;erreur de montage totale minimum est sélectionné comme premier point de contact. Note: Le temps de calcul peut être réduit par la mise en œuvre d&#39;une recherche-section d&#39;or plutôt que linéaire balayage de la courbe de force entière. </li><li> Exemple de déformation δ et l&#39;indentation force F sont calculés comme suit: <img alt="Équation 1"FO: content-width = &quot;3.073in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot; /&gt; </li><li> Ferrure des moindres carrés est appliqué pour s&#39;adapter à la F c données δ dans la région après le contact, z ≥ z 0, le modèle Hertz pour extraire le module d&#39;Young, E de la cellule: <img alt="Équation 2" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> , Où v est le coefficient de Poisson. Remarque: lorsque δ est supérieur à 10% de l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon (hauteur de la cellule), la rigidité de la cellule de mesure est influencée par la rigidité du substrat. L&#39;épaisseur de la région péri-nucléaire est habituellement de l&#39;ordre de quelques micromètres. Par conséquent, seuls les premiers 200-300 nm de courbe δ F est apte au modèle Hertz. </li></ol>

<ol>
	<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Wagner, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Softness,+strength+and+self-repair+in+intermediate+filament+networks.">Softness, strength and self-repair in intermediate filament networks.</a> Exp. Cell Res. 313, 2228-2235 (2007).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+behavior+in+living+cells+consistent+with+the+tensegrity+model.">Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 7765-7770 (2001).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+prestress.+I.+Stiffness+and+prestress+are+closely+associated+in+adherent+contractile+cells.">Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282, 606-616 (2002).</li><li>Kasza, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamin+A+is+essential+for+active+cell+stiffening+but+not+passive+stiffening+under+external+force.">Filamin A is essential for active cell stiffening but not passive stiffening under external force.</a> Biophysical Journal. 96, 4326-4335 (2009).</li><li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanics+as+an+indicator+of+cytoskeletal+structure+and+function.">Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and function.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 397-430 (1988).</li><li>Schafer, A., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+myosin+II+activity+on+stiffness+of+fibroblast+cells.">Influence of myosin II activity on stiffness of fibroblast cells.</a> Acta Biomaterialia. 1, 273-280 (2005).</li><li>Guck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+deformability+as+an+inherent+cell+marker+for+testing+malignant+transformation+and+metastatic+competence.">Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence.</a> Biophysical Journal. 88, 3689-3698 (2005).</li><li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2, 780-783 (2007).</li><li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer.">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nature Nanotechnology. 7, 757-765 (2012).</li><li>Rotsch, C., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+changes+of+cytoskeletal+structure+and+mechanics+in+fibroblasts:+an+atomic+force+microscopy+study.">Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study.</a> Biophysical Journal. 78 (00), 520-535 (2000).</li><li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Lu, Q. Y., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+extract+selectively+targets+nanomechanics+of+live+metastatic+cancer+cells.">Green tea extract selectively targets nanomechanics of live metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 22, 215101 (2011).</li><li>Hoffman, B. D., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+dissecting+the+physical+responses+of+cells+to+force.">Cell mechanics: dissecting the physical responses of cells to force.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 259-288 (2009).</li><li>Hoffman, B. D., Massiera, G., Van Citters, K. M., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consensus+mechanics+of+cultured+mammalian+cells.">The consensus mechanics of cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10259-10264 (2006).</li><li>Lau, A. W., Hoffman, B. D., Davies, A., Crocker, J. C., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology,+stress+fluctuations,+and+active+behavior+of+living+cells.">Microrheology, stress fluctuations, and active behavior of living cells.</a> Physical Review Letters. 91, 198101 (1981).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+probes+length+scale+dependent+rheology.">Microrheology probes length scale dependent rheology.</a> Physical Review Letters. 96, 118104 (2006).</li><li>Deng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+slow+dynamics+of+the+cytoskeleton.">Fast and slow dynamics of the cytoskeleton.</a> Nature Materials. 5, 636-640 (2006).</li><li>Oh, M. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+Aspiration+of+Substrate-attached+Cells+to+Estimate+Cell+Stiffness.">Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness.</a> J. Vis. Exp. (67), e3886 (2012).</li><li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+aspiration+of+living+cells.">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of Biomechanics. 33, 15-22 (2000).</li><li>Levental, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+indentation+device+for+measuring+micrometer-scale+tissue+stiffness.">A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness.</a> J. Phys-Condens. Mat. 22, (2010).</li><li>Mahaffy, R. E., Park, S., Gerde, E., Kas, J., Shih, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+viscoelastic+properties+of+thin+regions+of+fibroblasts+using+atomic+force+microscopy.">Quantitative analysis of the viscoelastic properties of thin regions of fibroblasts using atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 86, 1777-1793 (2004).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+elastic+properties+of+biological+samples+with+the+AFM.">Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine: The Quarterly Magazine of the Engineering in Medicine &amp; Biology Society. 16, 47-57 (1997).</li><li>Crocker, J. C., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-particle+tracking+and+two-point+microrheology+in+cells.">Multiple-particle tracking and two-point microrheology in cells.</a> Methods in Cell Biology. 83, 141-178 (2007).</li><li>Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-mechanical+characterization+of+lung+tissue+using+atomic+force+microscopy.">Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (54), e2911 (2011).</li><li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates.">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophysical Journal. 93, 4453-4461 (2007).</li><li>Wu, H. W., Kuhn, T., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+l929+cells+measured+by+atomic+force+microscopy:+Effects+of+anticytoskeletal+drugs+and+membrane+crosslinking.">Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking.</a> Scanning. 20, 389-397 (1998).</li><li>Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+viscoelastic+properties+of+human+platelets+with+the+atomic+force+microscope.">Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 70, 556-567 (1996).</li><li>Levy, R., Maaloum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+spring+constant+of+atomic+force+microscope+cantilevers:+thermal+fluctuations+and+other+methods.">Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods.</a> Nanotechnology. 13, 33-37 (2002).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129, 430-440 (2007).</li><li>Davis, J. T., Wen, Q., Janmey, P. A., Otteson, D. C., Foster, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muller+cell+expression+of+genes+implicated+in+proliferative+vitreoretinopathy+is+influenced+by+substrate+elastic+modulus.">Muller cell expression of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by substrate elastic modulus.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, 3014-3019 (2012).</li><li>Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+elasticity:+Measurements+by+atomic+force+microscopy+and+its+influence+on+cell+differentiation.">Microtissue elasticity: Measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation.</a> Method Cell Biol. 83, 521-545 (2007).</li><li>Lele, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+cell+mechanics+and+mechanotransduction.">Tools to study cell mechanics and mechanotransduction.</a> Methods in Cell Biology. 83 (07), 443-472 (2007).</li><li>A-Hassan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+microelastic+mapping+of+living+cells+by+atomic+force+microscopy.">Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 74, 1564-1578 (1998).</li><li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Hertzian+approach+to+analyzing+mechanical+properties+of+endothelial+cells+probed+by+atomic+force+microscopy.">Non-Hertzian approach to analyzing mechanical properties of endothelial cells probed by atomic force microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128, 176-184 (2006).</li><li>Xiong, Y., Lee, A. C., Suter, D. M., Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+and+nanomechanics+of+live+neuronal+growth+cones+analyzed+by+atomic+force+microscopy.">Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 96, 5060-5072 (2009).</li><li>Byfield, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+filamin+A+prevents+cells+from+responding+to+stiffness+gradients+on+gels+coated+with+collagen+but+not+fibronectin.">Absence of filamin A prevents cells from responding to stiffness gradients on gels coated with collagen but not fibronectin.</a> Biophysical Journal. 96, 5095-5102 (2009).</li><li>Cross, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+analysis+of+human+metastatic+cancer+cells.">AFM-based analysis of human metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 19, 384003 (2008).</li><li>Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+elasticity+in+biological+gels.">Nonlinear elasticity in biological gels.</a> Nature. 435, 191-194 (2005).</li><li>Wen, Q., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+physics+of+the+cytoskeleton.">Polymer physics of the cytoskeleton.</a> Current Opinion in Solid State &amp; Materials Science. 15, 177-182 (2011).</li><li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope.">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).</li><li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+response+to+mechanical+stimulation+studied+by+integrated+optical+and+atomic+force+microscopy.">Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (44), e2072 (2010).</li><li>Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode d&#39;indentation AFM a des avantages pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules vivantes. Quoique moins sensible que la cytométrie de torsion magnétique et pinces optiques, qui peuvent mesurer des forces sur le plan piconewton 32, l&#39;AFM permet de détecter la force de résistance à partir d&#39;échantillons allant de quelques dizaines de pico-Newton à des centaines de nano-Newton, comparables à aller de force peut être appliqué à des cellules à l&#39;aide d&#39;une...

Propriétés mécaniques, notamment la raideur, des cellules individuelles et leurs matrices extracellulaires environnantes (ECM) sont essentielles pour de nombreux processus biologiques, y compris la croissance cellulaire, la motilité, la division, la différenciation et l&#39;homéostasie tissulaire. 1 Il a été démontré que les cellules rigidité mécanique est principalement déterminée par le cytosquelette, en particulier les réseaux de filaments d&#39;actine et intermédiaires et d&#39;autres protéines associées. 2 Les résultats des essais mécaniques sur des réseaux in vitro des filaments d&#39;actine et intermédiaires suggèrent que les mécanismes cellulaires est largement dépendante de la structure du cytosquelette et la précontrainte dans le cytosquelette. 3-5 Rigidité de cellules vivantes est alors considéré comme un indice pour évaluer la structure du cytosquelette 6, l&#39;activité myosine 7 et de nombreux autres processus cellulaires. Plus important encore, les changements dans les propriétés mécaniques cellulaires sont également souvent considérés comme étroitement associésATED avec diverses maladies telles que la formation de tumeurs et des métastases 8-10 Contrôle de la rigidité mécanique des cellules vivantes peut donc fournir un nouveau moyen de contrôler la physiologie cellulaire;. pour détecter et diagnostiquer les maladies 8;. et d&#39;évaluer l&#39;efficacité des traitements médicamenteux 11 , 12 Plusieurs méthodes, y compris microrheologie de traces de particules, 13-16 cytométrie de torsion magnétique, 17 micropipette aspiration 18,19 et microindentation 20-22 ont été développés pour mesurer l&#39;élasticité des cellules. microrheologie de suivi des particules retrace les vibrations thermiques soit des particules fluorescentes submicroniques injectés dans des cellules ou des marqueurs fiduciaires à l&#39;intérieur du cytosquelette de la cellule. 23 propriétés élastiques et visqueuses de cellules sont calculés à partir des déplacements des particules mesurées en utilisant le théorème de fluctuation-dissipation. 14,23 Cette méthode permet mesures simultanées de locauxpropriétés mécaniques à haute résolution spatiale à différents endroits dans une cellule. Cependant, l&#39;injection de particules fluorescentes dans les cellules peut entraîner des changements dans la fonction cellulaire, la structure du cytosquelette, et donc les mécaniciens cellulaires. Procédé d&#39;aspiration par micropipette applique une pression négative dans la micropipette de diamètre allant de 1 à 5 um d&#39;aspirer un petit morceau de membrane de la cellule dans la pipette. la rigidité de la cellule est calculée à partir de la pression négative appliquée et de la déformation de la membrane cellulaire. 18 Cette méthode, cependant, ne peut pas détecter la distribution hétérogène de la rigidité à travers la cellule. La cytométrie en torsion magnétique (MTC) s&#39;applique champ magnétique pour générer un couple sur des billes paramagnétiques super-attachés à la membrane cellulaire. 17 raideur cellulaire est dérivée de cette méthode à partir de la relation entre le couple appliqué et de la déformation de torsion de la membrane cellulaire. Il est difficile de contrôler l&#39;emplacement des billes magnétiques dans la méthode MTC, et il est également challenging pour caractériser la déformation en torsion avec une grande résolution. Microindentation applique une indentation avec une géométrie bien définie de punch dans la cellule. La force de pénétration et le retrait résultant dans des cellules suivent souvent la prédiction du modèle Hertz. Des modules de Young de cellules peut être calculée à partir des courbes force-indentation en les équipant le modèle Hertz. Cette méthode a été largement appliquée pour tester les propriétés mécaniques des tissus et des cellules en dépit de ses limitations telles que l&#39;incertitude dans la détermination du point de contact, l&#39;applicabilité du modèle Hertz, et le potentiel d&#39;endommager physiquement les cellules. Parmi les nombreux dispositifs pour microindentaion 20, le microscope à force atomique (AFM) est disponible dans le commerce et a été largement appliquée pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules et des tissus vivants 21,24-27. Cet article démontre la procédure d&#39;utilisation d&#39;un asile MFP3D-Bio AFM pour caractériser les mécanismes cellulaires. AFM pas surment fournit une topographie à haute résolution de cellules, mais aussi a été largement appliquée pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules des tissus. Le principe de l&#39;AFM indentation est illustrée à la figure 1. Le cantilever AFM se rapproche de la cellule à partir de quelques micromètres ci-dessus; entre en contact avec la cellule; tirets la cellule de sorte que la déviation en porte à faux atteigne une valeur de consigne présélectionnée, et se détache de la cellule. Au cours de ce processus, la déviation du cantilever est enregistrée en fonction de sa position comme indiqué sur la figure 1. Avant de prendre contact avec la cellule, la console se déplace dans le milieu sans aucune déviation apparente. Lorsque l&#39;indentation sur la cellule, les coudes en porte à faux et le signal déviation augmente. Les leviers sont modélisés comme des poutres élastiques de telle sorte que leur déviation est proportionnelle à la force appliquée à la cellule. En réglant la déformation maximale en porte à faux, l&#39;amplitude maximale de la force appliquée à l&#39;échantillon est limitée pour éviter dAmage aux cellules. La portion de la courbe de force du point B au point C de la figure 1, où les tirets de pointe dans la cellule, n&#39;est pas propre au modèle hertz pour extraire la rigidité de la cellule. <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="Figure 1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> Figure 1. Illustration de l&#39;AFM microindentation et l&#39;interprétation de la courbe de force. Le panneau supérieur montre le mouvement de l&#39;AFM cantilever entraîné par le scanner piezo. La position verticale Z du cantilever et la déviation en porte à faux signal D est enregistrée au cours du processus. Le porte à faux commence à partir du point A, de quelques microns au dessus de la cellule. En se rapprochant de la cellule, l&#39;échantillon indentation δ reste nulle jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne le point B, où la pointe est en contact avec la cellule. Les coordonnées du point B dans le complot sont des valeurs critiquespour l&#39;analyse de données, notée (z 0, n 0&gt;). De B ​​à C, les tirets en porte à faux dans la cellule jusqu&#39;à ce que la déflection du cantilever atteint un point de consigne, qui est défini comme le rapport entre la force de pénétration maximale ciblée et la constante de ressort cantilever. Une fois le signal de déviation atteint la valeur maximale prédéterminée, le cantilever est alors retiré de la cellule à un point d, où elle souvent être tiré vers le bas en raison de pointe-échantillon adhésion, se détache de la cellule et revient à sa position initiale à e. Le panneau de droite illustre la relation entre le retrait et le z enregistrée et le signal d. Dans la partie inférieure gauche est un tracé d&#39;une courbe représentative de la force, l&#39;indentation maximum d&#39;un porte à faux, dont la constante de ressort est mesurée comme étant de 0.07N / m, est réglé pour être 17 nm de telle sorte que la force maximale indentation appliquée à l&#39;échantillon est de 1,2 nn. Les endroits clés au cours de l&#39;indentation sont marquées.

<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Atomic Force Microscope </td>
<td>Asylum Research</td>
<td>MFP3D-BIO</td>
</tr>
</tbody>
</table>

measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy

Les propriétés mécaniques des cellules et la matrice extracellulaire (MEC) jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, y compris la différenciation des cellules souches, la formation de tumeurs, et la cicatrisation des plaies. Les changements de raideur des cellules et ECM sont souvent des signes de changements dans la physiologie ou de maladies dans les tissus cellulaires. Par conséquent, la rigidité de la cellule est un indice pour évaluer l&#39;état de cultures de cellules. Parmi la multitude de méthodes utilisées pour mesurer la rigidité des tissus et cellules, micro-indentation en utilisant un microscope à force atomique (AFM) fournit un moyen de mesurer de façon fiable la rigidité des cellules vivantes. Cette méthode a été largement appliquée pour caractériser la rigidité micro-échelle pour une variété de matériaux allant des surfaces métalliques dans les tissus et les cellules biologiques mous. Le principe de base de cette méthode est de mettre en retrait une cellule avec une pointe AFM de la géométrie sélectionnée et mesurer la force appliquée à partir de la flexion du cantilever AFM. Montage de la courbe force-indentation sur le mode Hertzl pour la géométrie de la pointe correspondante peut donner des mesures quantitatives de la rigidité du matériau. Cet article démontre la procédure pour caractériser la rigidité des cellules vivantes à l&#39;aide de l&#39;AFM. Les étapes clés, y compris le processus de calibration AFM, l&#39;acquisition de force courbe, et l&#39;analyse de données en utilisant une routine MATLAB sont démontrés. Les limites de cette méthode sont également discutés.

Figure 2a montre trois courbes de force représentatifs prélevés à partir de fibroblastes 3T3 cultivées sur une surface en plastique, gel de polyacrylamide des modules 3000 Pa de Young et 17.000 Pa, respectivement. Après identifiant soigneusement les points de contact dans les courbes, la force de pénétration en fonction de la déformation de la cellule est représentée sur la figure 2b. Sous une force de magnitude inférieure à 0,3 nN, une pyramide pleine forme, alinéas 3 mic...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Cet article démontre un protocole pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules vivantes au moyen de microindentation aide d&#39;un microscope à force atomique (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

measuring-mechanical-properties-living-cells-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

39.6K vues.  Worcester Polytechnic Institute. Cet article démontre un protocole pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules vivantes au moyen de microindentation aide d'un microscope à force atomique (AFM).

Vidéo: Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilisation bactérienne pour l&#39;imagerie par microscopie à force atomique

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Recherche

Bio-ingénierie

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Une nouvelle méthode pour localiser rapporteur fluorescent Perles près de la surface de culture cellulaire pour Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Surface de mesure potentielle de bactéries utilisant Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

En cartographie in situ des propriétés mécaniques des biofilms par Microrhéologie de particules de suivi

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Utilisation de la biologie synthétique à l&#39;ingénieur cellules vivantes Interface avec les matériaux programmables

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Un système de test en flexion millimètre pour mesurer les propriétés mécaniques des Spicules d’éponges marines

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Mesure de la dynamique des protéines sensibles à la Force dans les cellules vivantes à l’aide d’une combinaison de Techniques Fluorescent

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...