KG a été soutenu par la Fondation RA Welch subvention P-1760, TCU Institut Andrews de mathématiques et de sciences de l&#39;éducation (à KG), TCU recherche et la créativité Activité Grant (à KG) et TCU SERC Grant (à JHS).

1. Synthèse de biotine-Fc-cystéine (1) <ol><li> Des procédés en phase solide pour produire une résine liée. <ol><li> Placez biotine résine chargée (250 mg, 0,145 mmol) dans une seringue fritte et gonfler la résine par l&#39;élaboration de diméthylformamide (5 ml) et en secouant la seringue sur un agitateur de laboratoire pendant 20 min. Expulser la solution et répéter diméthylformamide gonflement une fois de plus. </li><li> Éliminer le groupe protecteur Fmoc en ajoutant 6/4 ml de pipéridine à 20% dans du diméthylformamide à la seringue 10 à 15 min suivi par des secousses. Répétez le processus de déprotection avec un autre 4-6 ml de pipéridine. Laver la résine avec une séquence de 3 x diméthylformamide, 3x diméthylformamide: methanol (1: 1), du methanol 3x: dichlorométhane (1: 1), 3x dichlorométhane, ~ 5 ml chacune. Faites un test à la ninhydrine (+) sur un petit échantillon (~ 10) des perles pour confirmer déprotection succès par la présence de bleu lors du chauffage. </li><li> Mélanger une solution contenant de l&#39;acide Fmoc-1&#39;-amino-ferrocène-1-carboxylique(203,3 mg, 0,4350 mmol), de 1-hydroxybenzotriazole hydraté (58,8 mg, 0,413 mmol), de diisopropylcarbodiimide (0,0673 ml, 0,435 mmol), diisopropyl éthyl amine (0,0757 ml, 0,435 mmol) et un mélange 4: 1 de dichlorométhane et diméthylformamide. Dessiner cette fritté dans la seringue et agiter doucement sur un agitateur de laboratoire pendant 6 heures. Ensuite, expulser la solution de la seringue et laver comme décrit précédemment. </li><li> Effectuer le test ninhydrine (-) tel que décrit ci-dessus pour confirmer accouplement. Le test à la ninhydrine peut encore être utile pour confirmer couplage malgré la couleur orange de la bille provenant de la fixation de la fraction contenant le fer. </li><li> Ensuite éliminer le groupe Fmoc par l&#39;addition de 20% de pipéridine dans du diméthylformamide et on l&#39;a lavé comme décrit ci-dessus. Le test à la ninhydrine (de +) doit être utilisé pour confirmer la suppression Fmoc. </li><li> Préparer une solution composée de Fmoc-Cys (Trt) -OH (254,8 mg, 0,4350 mmol), 1-hydroxybenzotriazole hydraté (58,8 mg, 0,4125 mmol), diisopropylcarbodiimide (0,0673 ml, 0,4350mmol), la diisopropylamine d&#39;éthyle (0,0757 ml, 0,4350 mmol) et un mélange 4: 1 de dichlorométhane et le diméthylformamide. Ajouter ce couplage de cystéine cocktail la seringue fritte et secouez doucement pendant 6 heures. Laver en utilisant le protocole décrit précédemment. </li><li> Confirmation du couplage à l&#39;aide du test à la ninhydrine (-), suivi par l&#39;élimination du composant Fmoc avec 20% de pipéridine et de lavage. Vérifiez la borne libre amine utilisant le test à la ninhydrine (+). </li></ol></li><li> Le clivage de la résine à partir de 1. <ol><li> Faire une solution de TFA (9,45 ml), l&#39;eau (0,25 ml), le 1,2-éthanedithiol (0,25 ml), et triisopropyl silane (0,1 ml), ajouter à la seringue et agiter doucement pendant 4 heures. </li><li> Recueillir la solution rouge-brun résultant dans un tube Eppendorf et évaporer le TFA lentement en utilisant un courant d&#39;air. </li><li> Ajouter de l&#39;éther diéthylique froid (~ 15 ml) au tube Eppendorf pour précipiter 1, qui formera une agitation douce. Isoler le produit par centrifugation (1 g, 5 min). Tcycles de répétition de poule de lavages à l&#39;éther de diéthyle (~ 60 ml au total) et la centrifugeuse afin d&#39;obtenir une forme d&#39;un solide rouge / brun. </li></ol></li></ol> 2. Caractérisation et analyse des 1 <ol><li> Se assurer que l&#39;identité correspond à la connectivité et la composition représentée sur la figure 2 en utilisant 1 H (16 scans) et 13C-RMN (512 scans) dans du methanol deutéré (300 ul) et l&#39;analyse par ESI-MS. Attendez les résultats suivants: Spectre RMN 1 H (CD 3 OD) δ / ppm: 1,407 à 1,684 (m, 6H), 2,245 (t, 2H), 2,665 à 3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4,104 (d, 2H ), 4,274 (q, 1H), 4,426 (d, 2H), 4,479 (q, 1H), 4,595 (t, 1H) et le spectre 13 C-RMN (CD 3 OD) δ / ppm: 24,644 (CH2), 25,472 (CH 2), 28,051 (CH 2), 28.300 (CH 2), 35,474 (CH 2), 38.698 (CH 2), 39,241 (CH 2), 39,717 (CH 2), 55,340 / 55,538 (Cp-ring), 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Cp-ring), 66,038 / 66,170 (Cp-ring), 69,153 / 69,328 (Cp-ring), 71,468 / 71,593 (Cp-ring), 76,466 (CH), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O). ESI-MS (m / z): Trouvé: 639,00 [1 + Na] +, théorique: 639,1 [1 + Na] + et HR-MS (m / z): trouvé: 617,2049 [1 + H] +, théorique: 617.1622 [1 + H] +. </li><li> Effectuer HPLC, analyse élémentaire pour confirmer la composition de isolée 1. Effectuer des chromatogrammes HPLC en utilisant une colonne C8 à phase inversée avec 100% de MeOH à un débit de 0,5 ml / min. Remarque: temps de rétention de HPLC étaient: 3,198 à 4,674 min. </li></ol> 3. Immobilisation de 1 sur une surface d&#39;or <ol><li> polymère Cut soutenu diapositives or en carrés de ~ 0,25 en deux. </li><li> Remplir un bécher de 50 ml avec une solution d&#39;eau DI de 1 (~ 1 mM). </li><li> Ajouter la lame d&#39;or dans le bécher et couvrir avec un verre de montre. Tousow la lame de verre à incuber O / N à température ambiante sans agitation. </li><li> Retirez la lame d&#39;or de la solution et permettre sécher à l&#39;air. </li><li> Obtenir la numérisation d&#39;images de microscopie électronique en utilisant un microscope électronique à balayage (ou équivalent) pour observer une immobilisé. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La synthèse des dérivés de ferrocene asymétriques est difficile en solution. Par exemple, les tentatives pour produire une solution dans abouti à de faibles rendements en le produit désiré (moins de 20%). De même, les réactions utilisant 1&#39;-amino-ferrocene carboxylique (sans résine Fmoc) et la biotine lié conduit à un produit insoluble accord avec le produit polymérisé rapportée par Baristic et al. et le produit minime. 47 Ce est encore compliquée par le ...

Biocapteurs sont de petits appareils qui utilisent la technologie de reconnaissance biomoléculaire comme plate-forme pour l&#39;analyse sélective et sont utilisés pour leur spécificité, la vitesse et à faible coût. Biocapteurs électrochimiques pour la détection de biomolécules sont à la pointe de ce domaine en raison de leur simplicité, de l&#39;efficacité des coûts, et une sensibilité élevée. 1,3 L&#39;anatomie générale de ces capteurs est une électrode équipé d&#39;une molécule de reconnaissance spécifique pour le marqueur biologique d&#39;intérêt . La liaison du marqueur biologique par la molécule de reconnaissance se traduit par un changement local de potentiel ou de courant qui peut être détecté par une simple mesure. Jusqu&#39;à présent, le fragment de reconnaissance peut varier de enzymes, anticorps 4-8, 9-12, 13-16 cellules entières récepteurs, 17-20 21-23 peptides et d&#39;ADN 24 et ont largement porté sur grosses molécules biologiques. 25-28 de recherche efforts dans ce domaine se sont concentrés principalement sur immunocapteurs WHere une immunoglobuline est immobilisée avec un noyau actif redox (tel que le ferrocène) et utilisé pour détecter un anticorps d&#39;intérêt. Ces études ont été exclus des applications cliniques en raison d&#39;une mauvaise précision et la consommation de temps découlant des complications découlant de l&#39;utilisation de l&#39;antigène / anticorps. 1,3 Une attention croissante a mis l&#39;accent sur ​​la détection de petites molécules (moins de 1 kg / mol) de la recherche biomédicale , de la nourriture et de l&#39;intérêt de l&#39;environnement, en plus de la sécurité nationale. 29 Les exemples les plus connus de dispositifs de biocapteurs sont auto-test moniteurs de glucose, qui ont sérigraphiées électrodes enzymatiques couplés à un mètre ampérométrique poche. Ces systèmes utilisent généralement une méthode coulométrique où la quantité totale de charge générée par la réaction d&#39;oxydation du glucose est mesurée sur une période de temps. Dispositifs de placement doivent être portable, robuste et de la main-lieu de faire usage facile pour la population en général. Balises d&#39;oxydoréduction telles que ferrocène sont nécesry de fournir la détection électrochimique de biomarqueurs ou de petites molécules en solution comme la plupart des biomarqueurs ne sont pas intrinsèquement électrochimiquement active. 30-38 Ferrocene est une molécule organométallique qui est une norme d&#39;or pour l&#39;électrochimie, ce qui en fait un excellent choix pour l&#39;intégration dans des biocapteurs électrochimiques. espèces actives redox à base de ferrocène-ont déjà attiré l&#39;attention considérable en raison de leur petite taille, une bonne stabilité, un accès synthétique pratique, modification chimique facile, lipophilie relative, et la facilité de réglage redox. 3,30-42 petites molécules basé sur le noyau de ferrocène ont été largement utilisés comme détecteurs d&#39;ions métalliques et de petites molécules. 32-38,43 systèmes de ciblage tels que les espèces plus grandes biomolécules ont utilisé la fixation d&#39;anticorps ou d&#39;immunoglobulines grandes aux dérivés du ferrocene qui ont été intégrés sur une surface électrochimique. 1,3,39 , 44 Dans chaque cas, l&#39;intensification potentielle et actuelleté du couple redox Fe III / Fe II a été modifié lors du couplage moléculaire, produisant ainsi une nouvelle poignée spectroscopique indiquant la présence de la molécule d&#39;analyte. Cette variation résulte de l&#39;étendue de chevauchement qui se produit entre le système pi-des noyaux cyclopentadiényle et les orbitales d de fer. Si le système de PI est modifiée, ce est à dire, dérivé ou réagi, puis l&#39;interaction orbitale, à son tour, le changement. Ceci affectera le noyau Fe et peut être observé comme un changement dans le potentiel du couple Fe III / Fe II. 40,45,46 Ces propriétés rendent un tel système attractif pour une utilisation en tant qu&#39;agent de quantification dans un dosage immunologique ou électrochimique biocapteur. Afin de produire des systèmes de ferrocène contenant spécifiques pour les capacités de biocapteurs il est optimal pour modifier une bague de Cp avec le bio-récepteur spécifique pour une molécule cible et d&#39;utiliser l&#39;autre anneau Cp comme une attache moléculaire pour la lecture électrochimique ou electrode (Figure 1). La synthèse de ces dérivés de ferrocene asymétriques est contestée par des réactions secondaires et la formation d&#39;espèces dimères et polymères formés par réticulation intermoléculaire. 47 Toutefois, le couplage chimie produisant une liaison amide est la route la plus directe pour fournir des dérivés simples de ferrocène impliquant composants biologiques tels que des peptides et de leurs métabolites. Par conséquent, les techniques de première phase solide développés dans les années 1950 par Merrifield pour la synthèse peptidique peuvent être appliquées à des composés organométalliques contenant du ferrocène. Grâce à l&#39;utilisation de la molécule d&#39;acide 1&#39;-Fmoc-amino-ferrocène-1-carboxylique orthogonalement substitué, un système de ferrocène qui peut contenir un fragment de récepteur (biotine), lecture électrochimique (ferrocène) et le composant de blocage de segment de liaison (cysteine) présente été construit et détaillé ici. La synthèse de ce bio-conjugué est traité ainsi que des preuves pour l&#39;immobilisation sur une surface d&#39;or. Ce représen de travailts la première présentation d&#39;un système composé de biotine, ferrocène et un acide aminé pour l&#39;immobilisation sur une surface d&#39;or.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin Novatag Resin</td>
			<td>NovaBiochem</td>
			<td>8550510001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TORVIQ 10ML LUER LOCK FRITTED SYRINGE</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9299151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperdine</td>
			<td>Acros</td>
			<td>P/3520/PB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ninhydrin test</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60017-1ea</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#8217;-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid</td>
			<td>Omm Scientific</td>
			<td>Special Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-&#8203;Hydroxybenzotriazole hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157260-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D125407-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-&#8203;Diisopropylethylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>496219-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>8520080025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-ethanedithiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triisopropyl silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>233781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes (20 mL)</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td>dry with molecular sieves prior to use &#38; store in 100 mL media bottle for easy usage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichloromethane</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td>dry with molecular sieves prior to use &#38; store in 100 mL media bottle for easy usage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylformamide</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td>dry with molecular sieves prior to use &#38; store in 100 mL media bottle for easy usage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>any source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic methodology for asymmetric ferrocene derived bio-conjugate systems via solid phase resin-based methodology

Une détection précoce est la clé de la réussite du traitement de la plupart des maladies, et il est particulièrement indispensable pour le diagnostic et le traitement de nombreux types de cancer. Les techniques les plus courantes sont utilisées modalités d&#39;imagerie telles que imagerie par résonance magnétique (IRM), par émission de positrons Topographie (PET), et calculé Topographie (CT) et sont optimales pour la compréhension de la structure physique de la maladie, mais ne peuvent être effectués une fois tous les quatre à six semaines en raison de l&#39;utilisation d&#39;agents d&#39;imagerie et le coût global. Dans cet esprit, le développement de «point de service» techniques, telles que biocapteurs, qui évaluent le stade de la maladie et / ou l&#39;efficacité du traitement dans le bureau du clinicien et le faire d&#39;une manière opportune, allait révolutionner les protocoles de traitement. 1 Comme un moyen d&#39;exploration de base de ferrocène biocapteurs pour la détection de molécules d&#39;intérêt biologique 2, des méthodes ont été développées pour produire des bio-conjugués du ferrocène-biotine décrits ici. Ce rapport mettra l&#39;accent sur un système biotine-ferrocène-cystéine qui peut être immobilisé sur une surface d&#39;or.

La forme liée de résine de 1 est représenté sur la Figure 2. La fixation covalente du composant de ferrocène donne lieu à une teinte orange sur les perles de résine qui est persistante avec lavage en continu et indicatif d&#39;un fer immobilisé contenant le complexe plutôt que l&#39;absorption du fer par le composant PEG de la perle de résine. La forme d&#39;une sans résine est identique en couleur pour les billes de résine. Après l&#39;élimination du comp...

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Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Méthodologie synthétique pour asymétrique Ferrocene dérivés Systems Bio-conjugués via solide méthodologie à base de résine de phase

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

synthetic-methodology-for-asymmetric-ferrocene-derived-bio-conjugate

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.6K vues.  Texas Christian University. The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

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High-pressure Sapphire Cell for Phase Equilibria Measurements of CO2/Organic/Water Systems

The high pressure sapphire cell apparatus was constructed to visually determine the composition of multiphase systems without physical sampling. Specifically, the sapphire cell enables visual data collection from multiple loadings to solve a set of material balances to precisely determine phase composition. Ternary phase diagrams can then be established to determine the proportion of each component in each phase at a given condition. In principle, any ternary system can be studied although ternary systems (gas-liquid-liquid) are the specific examples discussed herein. For instance, the ternary THF-Water-CO2 system was studied at 25 and 40&#160;&#176;C and is described herein. Of key importance, this technique does not require sampling. Circumventing the possible disturbance of the system equilibrium upon sampling, inherent measurement errors, and technical difficulties of physically sampling under pressure is a significant benefit of this technique. Perhaps as important, the sapphire cell also enables the direct visual observation of the phase behavior. In fact, as the CO2 pressure is increased, the homogeneous THF-Water solution phase splits at about 2 MPa. With this technique, it was possible to easily and clearly observe the cloud point and determine the composition of the newly formed phases as a function of pressure.
The data acquired with the sapphire cell technique can be used for many applications. In our case, we measured swelling and composition for tunable solvents, like gas-expanded liquids, gas-expanded ionic liquids and Organic Aqueous Tunable Systems (OATS)1-4. For the latest system, OATS, the high-pressure sapphire cell enabled the study of (1) phase behavior as a function of pressure and temperature, (2) composition of each phase (gas-liquid-liquid) as a function of pressure and temperature and (3) catalyst partitioning in the two liquid phases as a function of pressure and composition. Finally, the sapphire cell is an especially effective tool to gather accurate and reproducible measurements in a timely fashion.

High-pressure Sapphire Cell for Phase Equilibria Measurements of CO2/Organic/Water Systems

The high pressure sapphire cell apparatus is a unique tool to study, without sampling, phase behavior under a wide range of pressures. Using a cathetometer, very precise volume measurements can be recorded to measure liquid expansion and phase composition. Thus, this synthetic method enables the study of (1) phase equilibria of multi-component mixtures and (2) the partition behavior of catalyst or model compounds as a function of pressure.

Haute pression portable Sapphire pour les mesures de phase équilibres de CO<sub&gt; 2</sub&gt; / / Water Systems organiques

The high pressure sapphire cell apparatus was constructed to visually determine the composition of multiphase systems without physical sampling. ...

Recherche

Chimie

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.

This article will focus on developing polymer coated surfaces for long-term, stable culture of stem cell derived human hepatocytes.

Stabiliser hépatocellulaire phénotype en utilisant des surfaces synthétiques optimisés

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

X-ray Powder Diffraction en science de la conservation: Vers Routine structure cristalline Détermination des produits de corrosion sur l&#39;art du patrimoine Objets

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

A protocol for the direct measurement of particle size distribution in concentrated solutions using dynamic light scattering microscopy is presented.

Mesure de la distribution granulométrique en turbides Solutions par Dynamic Light Scattering Microscopie

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide variety of pathological conditions. However, existing methods lack the sufficient sensitivity and/or specificity necessary to measure the low endogenous level of 3-NT reliably and are too cumbersome for clinical applications. Hence, analytical improvement is urgently needed to accurately quantify the levels of 3-NT and verify the role of 3-NT in pathological conditions. This protocol presents the development of a novel liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) detection combined with a miniaturized solid phase extraction (SPE) for the rapid and accurate measurement of 3-NT in human urine as a non-invasive biomarker for oxidative stress. SPE using a 96-well plate markedly simplified the process by combining sample cleanup and analyte enrichment without tedious derivatization and evaporation steps, reducing solvent consumption, waste disposal, risk of contamination and overall processing time. The employment of 25 mM ammonium acetate (NH4OAc) at pH 9 as the SPE elution solution substantially enhanced the selectivity. Mass spectrometry signal response was improved through adjustment of the multiple reaction monitoring (MRM) transitions. Use of 0.01% HCOOH as additive on a pentafluorophenyl (PFP) column (150 mm x 2.1 mm, 3 &#181;m) improved signal response another 2.5-fold and shortened the overall run time to 7 min. A lower limit of quantitation (LLOQ) of 10 pg/mL (0.044 nM) was achieved, representing a significant sensitivity improvement over the reported assays. This simplified, rapid, selective and sensitive method allows two plates of urine samples (n = 192) to be processed in a 24 h time-period. Considering the markedly improved analytical performance, and non-invasive and inexpensive urine sampling, the proposed assay is beneficial for pre-clinical and clinical studies.

A selective and sensitive liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method coupled with an efficient solid phase extraction on a mixed-mode cation-exchange (MCX) 96-well microplate was developed for the measurement of free 3-nitrotyrosine (3-NT) in human urine with high throughput, which is suitable for clinical applications.

Intégration de l&#39;extraction de phase solide miniaturisée et détection de la LC-MS / MS de la 3-nitrotyrosine dans l&#39;urine humaine pour les applications cliniques

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the average content of fluorinated drugs in their formulated drug product forms: tablets or capsules. This method is specific to fluorinated drugs because it detects only the content of fluorine, avoiding interference from the excipients that lack fluorine. The advantages of measuring the active content of fluorinated drugs using low-field 19F TD-NMR versus high-field 19F solid-state (SS) NMR are the simplicity of the method; the low cost; and the non-destructive nature of the technique, with all samples recoverable in intact forms (e.g., powders, tablets, and capsules), making this technique affordable for any laboratory.
We have tested the method with three fluorinated drug products available on the market - cinacalcet, lansoprazole, and ciprofloxacin - with doses ranging from 15 to 500 mg. The results of the analyses, measured by low-field 19F TD-NMR, supported the reported label claims for the average drug content.
Based on the simplicity and reproducibility of the analysis, we envision this methodology being implemented in any laboratory, including manufacturing plants, as a process analytical technology (PAT) tool in the pharmaceutical industry.

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

A simple and non-destructive technique that measures the average content of drug substances in formulated drug products containing fluorine using low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) is presented here. The technique can be applied to the development and manufacturing of drugs in the pharmaceutical industry.

Application et la méthodologie de la Technique de RMN Non destructifs 19F domaine temporel pour mesurer le contenu dans les produits contenant du fluor

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the ...

Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

Phase-separated giant unilamellar vesicles (GUVs) exhibiting coexisting liquid-ordered and liquid-disordered domains are a common biophysical tool to investigate the lipid raft hypothesis. Numerous studies, however, neglect the impact of physiological solution conditions. On that account, the current work presents the effect of high-salinity buffer and trans-membrane solution asymmetry on liquid-liquid phase separation in charged GUVs grown from dioleylphosphatidylglycerol, egg sphingomyelin, and cholesterol. The effects were studied under isothermal and varying temperature conditions.
We describe equipment and experimental strategies applicable for monitoring the stability of coexisting liquid domains in charged vesicles under symmetric and asymmetric high-salinity solution conditions. This includes an approach to prepare charged multicomponent GUVs in high-salinity buffer at high temperatures. The protocol entails the option to perform a partial exchange of the external solution by a simple dilution step while minimizing the vesicle dilution. An alternative approach is presented utilizing a microfluidic device that allows for a complete external solution exchange. The solution effects on phase separation were also studied under varying temperatures. To this end, we present the basic design and utility of an in-house built temperature control chamber. Furthermore, we reflect on the assessment of the GUV phase state, pitfalls associated with it and how to circumvent them.

Experiments on phase separated giant unilamellar vesicles (GUVs) frequently neglect physiological solution conditions. This work presents approaches to study the effect of high-salinity buffer on liquid-liquid phase separation in charged multicomponent GUVs as a function of trans-membrane solution asymmetry and temperature.

Comportement de phase des vésicules chargées dans des Conditions de Solution symétrique et asymétrique suivies avec la microscopie en Fluorescence

Phase-separated giant unilamellar vesicles (GUVs) exhibiting coexisting liquid-ordered and liquid-disordered domains are a common biophysical tool to ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2&#039;-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

Protocole pour la synthèse en phase solide d&#39;oligomères d&#39;ARN contenant un 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophénylméthyle Modification et caractérisation via le dichlorisme circulaire

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group analysis as matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). This tutorial demonstrates methods for optimization of the sample preparation, spectral acquisition, and data analysis of synthetic polymers using MALDI-TOF MS. Critical parameters during sample preparation include the selection of the matrix, identification of an appropriate cationization salt, and tuning the relative proportions of the matrix, cation, and analyte. The acquisition parameters, such as mode (linear or reflector), polarization (positive or negative), acceleration voltage, and delay time, are also important. Given some knowledge of the chemistry involved to synthesize the polymer and optimizing both the data acquisition parameters and the sample preparation conditions, spectra should be obtained with sufficient resolution and mass accuracy to enable the unambiguous determination of the end groups of most homopolymers (masses below 10,000) in addition to the repeat unit mass and the overall molecular weight distribution. Though demonstrated on a limited set of polymers, these general techniques are applicable to a much wider range of synthetic polymers for determining mass distributions, though end group determination is only possible for homopolymers with narrow dispersity.

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

A protocol for the matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) characterization of synthetic polymers is described including the optimization of sample preparation, spectral acquisition, and data analysis.

Caractérisation des polymères synthétiques via Matrix Assisted Laser Desorption ionisation temps de spectrométrie de masse (MALDI-TOF) de vol

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Solid-phase Synthesis of [4.4] Spirocyclic Oximes

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of solid-phase synthesis, regenerating Michael (REM) linker strategies, and 1,3-dipolar cycloaddition, a library of structurally similar heterocycles, both with and without a spirocyclic center, can be constructed. The main advantages of the solid-support synthesis are as follows: first, each reaction step can be driven to completion using a large excess of reagents resulting in high yields; next, the use of commercially available starting materials and reagents keep the costs low; finally, the reaction steps are easy to purify via simple filtration. The REM linker strategy is attractive because of its recyclability and traceless nature. Once a reaction scheme is completed, the linker can be reused multiple times. In a typical solid-phase synthesis, the product contains either a part of or the whole linker, which can prove undesirable. The REM linker is &#34;traceless&#34; and the point of attachment between the product and the polymer is indistinguishable. The high diastereoselectivity of the intramolecular 1,3-dipolar cycloaddition is well documented. Limited by the insolubility of the solid support, the reaction progression can only be monitored by a change in the functional groups (if any) via infrared (IR) spectroscopy. Thus, the structural identification of intermediates cannot be characterized by conventional nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Other limitations to this method stem from the compatibilities of the polymer/linker to the desired chemical reaction scheme. Herein we report a protocol that allows for the convenient production of spirocyclic heterocycles that, with simple modifications, can be automated with high-throughput techniques.

Here we present a protocol to demonstrate an efficient method for the synthesis of spirocyclic heterocycles. The five-step process utilizes solid-phase synthesis and regenerating Michael linker strategies. Generally difficult to synthesize, we present a customizable method for the synthesis of spirocyclic molecules otherwise inaccessible to other modern approaches.

Synthèse en phase solide de [4,4] Spirocyclique Oximes

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of ...