Nous remercions le Fonds pour l&#39;Institut Wistar animale, laboratoire de microscopie, Facilité Histotechnologie et Supply Center de recherche. Cette étude a été financée en partie par des subventions du National Institutes of Health CA 076674, 098101 CA, CA 025874 et CA 10815.

1. La peau Three-Dimensional Human Reconstruire Modèle: <ol><li> Préparation de la couche acellulaire: Mélanger les réactifs suivants dans un tube de 50 ml sur glace: 0,59 ml EMEM 10X, 50 pl 200 mM L-glutamine, 0,6 ml de FBS, 120 bicarbonate de sodium ul de 7,5% et 4,6 mL collagène bovin I. Ajouter 1 mL de le mélange dans chaque insert de plateaux de culture de tissus. Incuber pendant 30 min à température ambiante et permettre au gel de se solidifier. Couleur du mélange doit être de couleur jaune paille au rose. </li><li> Trypsiniser fibroblastes humains à partir des flacons de culture avec 0,25% de trypsine / EDTA, ajouter DMEM contenant 10% de FBS à neutraliser. Recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre 0,45 x 10 6 cellules dans 1,5 ml de DMEM avec 10% de FBS. Pour les cellules souches dermiques, de collecter 6600 sphères dermique (lorsque les cellules souches dermiques croître en moyenne de cellules souches, ils forment des sphères d&#39;une manière similaire à neurosphères) en tapant flacon pour détacher les sphères, la centrifugation. </li><li> Préparation de la couche cellulaire: Mélanger les éléments suivants dans un tube de 50 ml sur glace: 1,65 ml EMEM 10X, 150 pl 200 mM L-glutamine, 1,85 ml de FBS, 350 bicarbonate de sodium ul de 7,5%, 14 ml collagène I bovin et 1,5 mL de suspension de fibroblastes partir de l&#39;étape 2 (alternativement, utilisez la combinaison de 0,45 x 10 6 fibroblastes dermiques et 6600 sphères dans 1,5 ml de la peau de reconstituer milieu I sur les cellules souches dermiques reconstruit), bien mélanger. Ajouter 3 ml du mélange à chaque couche de revêtement acellulaire insérer. Incuber pendant 45 min à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur de culture tissulaire. Couleur du mélange doit être du jaune paille au rose. Après le gel se solidifie, ajoutez DMEM contenant 10% de FBS (2 à l&#39;intérieur ml et 10 ml de l&#39;extérieur de l&#39;insérer dans chaque puits de la peau de reconstituer les plateaux). Incuber pendant 4 jours et faire en sorte que les contrats de gel. </li><li> Aspirer moyennes de l&#39;intérieur et l&#39;extérieur de chaque insert. Ajouter milieu de lavage (HBSS avec 1% de FBS dialysé) 2 mL à l&#39;intérieur et 10 ml à l&#39;extérieur de l&#39;insert afin de laver le sérum normal. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Préparation de la peau de reconstituer moyennes: <ol><li> Pour des cellules souches normales mélanocytes et cutanée reconstruit: Pour rendre milieu basique (500 ml), mélanger les réactifs suivants: 490 ml kératinocytes milieu sans sérum, 1,8 ml d&#39;extrait hypophyse bovine, 10 mL dialysées sérum fœtal bovin, 500 pi de 10 ug / mL EFC, 562,5 ul de 4 pg / ml de bFGF et 500 ul de 264 pg / ml HE-3. Milieu I: Ajouter 10 ul d&#39;EGF 100 pg / mL à 100 mL de milieu de base. Milieu II: Ajouter 2 EGF ul à 100 mL de milieu de base. Medium III: Ajouter 720 ul de CaCl 2 1 M à 300 ml de milieu de base. </li><li> Pour la peau sans mélanome reconstruire: Pour faire Milieu I (100 ml), mélanger les réactifs suivants: 72,5 ml de DMEM, 24 ml de F12 (HAM), 2 ml de L-glutamine de 200 mm, 200 hydrocortisone ul de 269 g / mL, 200 ITES ul de 500X, 200 pl O-phosphorylethanolamine de 0,05 m, 200 adénine ul de 90 mm, 200 progestérone ul de 2 nM, 240 ul de CaCl 2 1 M, 200 Triiodothyronine ul de 10 nM et 100 pl de sérum de veau nouveau-né chelexed (dissoudre 3 g de Chelex 100 dans 100 ml de sérum, mélanger 1,5 heures à 4 ° C, stériliser par filtration). Pour faire Milieu II (100 ml), mélanger les réactifs suivants: 72,5 ml de DMEM, 24 ml de F12 (HAM), 2 ml de L-glutamine de 200 mm, 200 hydrocortisone ul de 269 g / mL, 200 ITES ul de 500X, 200 pi O-phosphorylethanolamine de 0,05 m, 200 adénine ul de 90 mm, 200 progestérone ul de 2 nM, 240 ul de CaCl2 de 1 M, 200 Triiodothyronine ul de 10 nM et 100 ul de sérum de veau nouveau-né. Pour faire Medium III (300 ml), mélanger les réactifs suivants: 142,5 ml de DMEM, 142,5 ml de F12 (HAM), 6 ml de L-glutamine de 200 mm, 600 hydrocortisone ul de 269 g / mL, 600 ITES ul de 500X , 600 O-ul phosphorylethanolamine de 0,05 M, 600 adénine ul de 90 mm, 600 progestérone ul de 2 nM, 720 ul de CaCl 2 1 M, 600 Triiodothyronine ul de 10 nM et 6 ml de sérum de veau nouveau-né. </li></ol></li><li> Trypsiniser kératinocytes humains des flacons de culture avec 0,05% de trypsine / EDTA, neutraliser la trypsine de soja avec des inhibiteurs de la trypsine (250 mg / L en 1x tampon phosphate salin), ralentit, resuspendre un culot cellulaire à 4,17 x10 6 cellules / ml dans la peau de reconstituer moyennes I. </li><li> Trypsiniser mélanocytes humains ou des cellules de mélanome de flacons de culture avec 0,05% de trypsine / EDTA, neutraliser la trypsine de soja avec inhibiteur de la trypsine, ralentit, resuspendre un culot cellulaire à 0,83 x10 6 cellules / ml dans la peau de reconstituer moyennes I. </li><li> Retirer milieu de lavage de l&#39;intérieur et l&#39;extérieur de chaque insert. </li><li> Ajouter la peau de reconstituer milieu I (1,5 ml à l&#39;intérieur et 10 ml à l&#39;extérieur de chaque insert). </li><li> Prenez 600 ul suspension cellulaire des kératinocytes et 600 l de suspension cellulaire mélanocytes ou cellules de mélanome, bien mélanger. Distribuer 200 ul goutte mélangée suspension cellulaire à goutte à l&#39;intérieur de chaque insert. Pour reconstruire les cellules souches dermiques, utiliser 100 pl de suspension de kératinocytes seulement. Incuber pendant 2 jours à 37 ° C. </li><li> Aspirer la peau de reconstituer milieu Ià la fois de l&#39;intérieur et l&#39;extérieur de chaque insert. Ajouter la peau de reconstituer milieu II (2 ml à l&#39;intérieur et 10 mL à l&#39;extérieur). Incuber pendant 2 jours à 37 ° C. </li><li> Aspirer la peau de reconstituer milieu II de l&#39;intérieur et l&#39;extérieur de chaque insert, ajouter 7,5 ml de reconstruire la peau moyennes III que l&#39;extérieur. De ce point, la surface des reconstruit commence à être exposé à l&#39;air. Changer milieu III tous les autres jours jusqu&#39;au jour 18. </li><li> Récolte de peau reconstruire à jour 18: <ol><li> Aspirer des médias de l&#39;intérieur et l&#39;extérieur des inserts. </li><li> Retirer insère à partir du bac avec une pince. </li><li> Découpez la reconstruction (y compris le filtre en polycarbonate), en traçant un cercle de proches du bord avec une lame de bistouri. </li><li> Couper le reconstruire et le filtre dans la moitié sur une surface dure. </li></ol></li><li> Pour les sections de paraffine: placer une moitié de la reconstruire dans une cassette d&#39;histologie entre 2 papiers noir biopsie du SCT et laisser tremper toute la cassette dans le formol à 10% pendant plus de 4 heures. Ensuite, placez la cassette dans l&#39;éthanol à 70% et le stocker à 4 ° C jusqu&#39;à ce que vous êtes prêt à traiter les reconstituer pour inclusion dans la paraffine. </li><li> Pour les sections congelées: <ol><li> Placez l&#39;autre moitié de reconstruire 50% de saccharose à 4 ° C pendant 1-2 heures, puis changer le saccharose à 2M et le stocker à 4 ° C pour un autre 1-2 heures. </li><li> Distribuer optimale de coupe des médias température de congélation (PTOM) dans un moule de base jetables afin qu&#39;il remplisse d&#39;environ 50% du bateau. Eviter les bulles dans les PTOM. </li><li> Prenez le bord de la reconstruire avec une pince et retirer le reconstruire à partir du saccharose. Placez-le sur Kimwipes jusqu&#39;à la Kimwipes absorber le saccharose. </li><li> Transférer la reconstruire dans le moule de base au-dessus de l&#39;OPO, l&#39;aide de pinces et une spatule. Couvrez le haut de la reconstruire avec plusieurs PTOM jusqu&#39;à ce que le moule de base est complètement plein. Assurez-vous que vous n&#39;avez pas toutes les bulles dans les PTOM qui fera de coupe difficile. </li><li> Placez le moule de base uniformément sur la glace sèche broyé, et de permettre aux PTOM de geler complètement. </li><li> Envelopper le moule de base dans une feuille d&#39;étain et le stocker à -70 ° C jusqu&#39;à ce que vous êtes prêt à le couper avec un cryostat. </li></ol></li><li> Greffer une peau de reconstruire sur une souris: <ol><li> Préparer un tube Falcon de 50 ml avec 5 ml de DMEM (pour la congélation et la décongélation peau de souris). </li><li> Utilisez une femelle consanguine SCID souris sans poils autour de 6 semaines. </li><li> La souris est anesthésiée avec (système d&#39;anesthésie EZ) isoflurane: l&#39;anesthésie initiale est effectuée dans la chambre de l&#39;induction de l&#39;anesthésie 4% d&#39;isoflurane (avant la souris est déplacé vers le lit chirurgical) et à maintenir grâce à une pause pendant la procédure de coiffe (isoflurane: 1,5-2% ). Le soutien de chaleur par un coussin chauffant pour prévenir l&#39;hypothermie et lubrifiant ophtalmique stérile appliquée pour prévenir les blessures oculaires lors d&#39;une anesthésie. </li><li> Mettez 600 ml d&#39;eau dans un bécher et laisser sur le dessus d&#39;une plaque chauffante pour maintenir la température de l&#39;eau entre 40 - 60 ° C. </li><li> Nettoyer la peau des souris avec de la teinture de benjoin composé et tampons à l&#39;alcool. </li><li> Tracez une ligne sur le dessus du dos de la souris pour garder la même position pour les points de suture plus tard. </li><li> Couper un lit enroulé autour d&#39;environ 1,2 cm de diamètre sur le dos de souris supérieure en utilisant des ciseaux et des pinces à Iris. Couvrir le lit de la plaie avec des compresses de gaze stérile. Mettez la peau de souris rond dans 5 ml de DMEM, puis laisser dans un récipient d&#39;azote liquide jusqu&#39;à ce qu&#39;elle totalement gelé. Décongelez le tube dans l&#39;eau chaude sur le dessus d&#39;une plaque chaude jusqu&#39;à totalement dégelé. Répétez 3 fois. </li><li> Détachez la peau de reconstituer à l&#39;aide de la transwell lame chirurgicale et retirer la membrane très soigneusement, le transfert de reconstruire la peau (l&#39;épiderme jusqu&#39;à côté) sur le dessus du lit de la plaie. </li><li> Placez la peau de souris (côté épiderme vers le haut) sur le dessus de la peau reconstruire. </li><li> Faire la première suture sur le marqueur préalablement marquées, la seconde sur le fond, puis deux points de suture plus sur les côtés pour fixer la peau de souris. </li><li> Nettoyer la peau de souris après la greffe. Retirez et gardez la souris coiffe sur le pavé chauffé jusqu&#39;à éveillé et ambulatoires. </li><li> Placez la souris dans une nouvelle cage. </li><li> Analgésie post-opératoire: meloxicam (1 mg / kg) par injection sous-cutanée immédiatement après la chirurgie, 24 heures et 48 heures après la chirurgie. </li></ol></li></ol> 2. Les résultats représentatifs: Peau reconstruit avec des mélanocytes normaux et les cellules souches dermiques La peau reconstitue sont cultivées dans un numéro spécial de 6 puits plateau avec inserts. Le compartiment dermique est cultivé dans DMEM avec du FBS à 10% pour les quatre premiers jours (Fig. 1A). La peau de reconstruire milieu I est utilisé lorsque les kératinocytes sont ensemencés avec des mélanocytes ou cellules de mélanome (Fig. 1B). L&#39;épiderme est exposé à l&#39;air au jour 9 et cela permet de différencier les kératinocytes (figure 1C). Au jour 18, l&#39;épiderme de la peau reconstitue est composé de couches stratifiées kératinocytes. La couche basale et indifférencié couches séquentielle différenciés sont orientés verticalement (Fig. 1D). TacheING la section des reconstruit avec le S100 mélanocytaires marqueurs montre que les mélanocytes sont alignées dans la couche basale de l&#39;épiderme et de communiquer avec les kératinocytes par des extensions multiples dendrites (figure 1E). Le compartiment dermique contient des fibroblastes incorporé dans un collagène de type I de la matrice. Déposé le collagène IV indique la membrane basale, qui sépare l&#39;épiderme du derme (Fig. 1F). Lorsque les cellules souches dermiques (étiqueté avec la GFP lentiviraux vecteur) sont intégrés avec des fibroblastes dans une matrice de collagène de type I, ils migrent vers l&#39;épiderme et se différencient en mélanocytes (1), (fig. 2). Plusieurs couches de kératinocytes de l&#39;épiderme sont développés. Peau reconstruit des tumeurs de mélanome Des études indiquent que des progrès clinicopathologiques mélanomes de manière progressive: ordinaires acquises naevus, naevus dysplasique, RGP (phase de croissance radiale) mélanomes, VGP (phase de croissance verticale) mélanomes métastatiques et les mélanomes (7). Différentes étapes de lignées cellulaires du mélanome sont morphologiquement semblables les uns aux autres en 2-D de la culture (Fig. 3A-D), mais quand ils sont incorporés dans la peau reconstitue, le comportement des cellules reflète leurs caractéristiques en vivo. L&#39;emplacement et le taux de croissance des mélanocytes normaux sont étroitement contrôlés dans la peau reconstitue (Fig. 3E). RGP primaires mélanomes WM35 prolifèrent principalement dans l&#39;épiderme (figure 3F), alors que les mélanomes VGP WM793 croissance invasive dans le derme (Fig. 3G). Métastatique des mélanomes 1205Lu agressivement envahissent profondément dans le derme (Fig. 3H). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig1.jpg" /> Figure 1. Peau reconstruit avec des mélanocytes normaux. L&#39;apparition massive de la peau reconstitue est montré dans AC. A. Les fibroblastes mélangé avec du collagène sont cultivées dans du DMEM contenant 10% de FBS et la forme du compartiment dermique. Les kératinocytes et les mélanocytes B. sont ensemencées sur le dessus du derme et de grandir dans la peau de reconstituer à moyen terme. C. L&#39;épiderme est exposé à l&#39;air au jour 9. D. H &amp; E-taché la peau de reconstituer l&#39;épiderme présente compose verticalement, orientées couche basale, et séquentiellement couches de cellules différenciées stratifié. Le derme contient des fibroblastes incorporé dans un collagène de type I de la matrice. E. S100-positifs mélanocytes (flèches noires) sont alignés à la membrane basale et communiquer avec des kératinocytes multiples. F. Le collagène IV-coloration indique la membrane basale, qui sépare l&#39;épiderme du derme. Toutes les colorations dans DF ont été effectués sur le formol et inclus en paraffine sections. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig2.jpg" /> Figure 2. Les cellules souches cutanée dans la peau reconstitue de migrer vers l&#39;épiderme et se différencient en mélanocytes. A 5 jours après l&#39;ensemencement de kératinocytes, cellules GFP-positives unique (verte) de commencer à migrer hors des sphères. L&#39;épiderme est toujours composée d&#39;une seule couche. Au jour 8, quelques cellules atteindre l&#39;interface épiderme-derme. En 10 jours, la GFP de cellules positives sont étroitement alignés sur la position membrane basale. La GFP-positives ont migré des cellules dans le marqueur épiderme expresse mélanocytaires HMB45 (rouge, comme indiqué par les flèches blanches). Les noyaux sont colorés au DAPI (bleu). L&#39;épiderme est développé sous forme de couches multiples. La membrane basale est indiqué par des lignes blanches en pointillé. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig3.jpg" /> Figure 3. Peau reconstruit des différentes étapes de mélanomes: AD. Mélanocytes normaux et les cellules de mélanome cultivées en cultures 2D. Les mélanocytes A. prépuce. B. RGP WM35 cellules. C. VGP WM793 cellules. D. cellules métastatiques 1205Lu mélanome. Mélanocytes normaux E. sont situés à la membrane basale. F. RGP mélanomes WM35 cellules se développent comme des grappes de cellules de l&#39;épiderme. G. VGP mélanomes WM793 cellules envahissent le derme grâce à la membrane basale. H. atteints de mélanome métastatique des cellules 1205Lu agressivement envahissent profondément dans le derme. Dépannage <table border="1"><tbody><tr><td> Problème </td><td> Dépannage </td></tr><tr><td> Mélange de collagène ne se solidifie pas </td><td> Couleurs mélange de collagène doit être jaune paille au rose, sinon le pH est mauvais et le collagène ne peut gel. Si la couleur est jaune vif, le bicarbonate de sodium plus devraient être ajoutés goutte à goutte. </td></tr><tr><td> Le collagène précipite prématurément dans la mixuture </td><td> Conservez tous les composants sur la glace jusqu&#39;à ce que le mélange de collagène est placée sur l&#39;insert </td></tr><tr><td> Collagène contractée n&#39;est même pas (un côté est plus épais que l&#39;autre côté) </td><td> Calibrer le plateau de l&#39;incubateur </td></tr><tr><td> L&#39;épiderme est formé avec au moins trois couches de kératinocytes. </td><td> Utilisez kératinocytes indifférenciés à moindre passages </td></tr></tbody></table>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons décrit générer la peau en 3D reconstitue avec des mélanocytes humains normaux, les cellules souches et de cellules de mélanome cutané. Lorsqu&#39;il est cultivé en culture monocouche, les cellules mélanocytaires présentent une morphologie semblable (aplati, broche ou plusieurs dendritiques en forme), indépendamment de leur origine de la scène clinique. En revanche, la peau en 3D reconstitue Récapitulons stade de propriétés spécifiques des cellules de mélanome. Les mélanocytes humains normaux résider à la membrane basale de l&#39;épiderme et entre les les couches dermiques comme des cellules simples. Cellules RGP mélanome primaire poussent comme des grappes de petites le long de la membrane basale alors plus agressif cellules de mélanome VGP poussent comme des grappes de grandes percer la membrane basale dans le derme. Cellules de mélanome métastatique croître dans toutes les directions et envahissent profondément dans le derme de cellules simples ou clusters. Les analyses quantitatives peuvent être effectuées sur ce modèle en mesurant la profondeur de l&#39;invasion et de l&#39;étendue de la prolifération. En plus de la caractérisation des cellules normales et malignes mélanocytaires, en utilisant le modèle on peut directement induire la différenciation de cellules souches dermiques dans les mélanocytes mûri, qui abrite la couche basale de l&#39;épiderme et d&#39;établir la communication de bonne foi avec des kératinocytes par surexpression de E-cadhérine ( 6). En utilisant des vecteurs viraux, nous sommes capables d&#39;activer ou inactiver la fonction des gènes pour une meilleure compréhension de la dynamique et l&#39;importance fonctionnelle des gènes exprimés par chaque type de cellule dans la peau reconstitue, ce qui promet d&#39;être un modèle efficace pour étudier les mécanismes de transformation non seulement des mélanocytes , mais aussi la progression du mélanome (8). Observation à long terme des phénotypes cellulaires est devenu possible grâce à la greffe de peau reconstitue à des animaux immunodéficients. Une telle peau humaine à la souris chimère est une excellent outil de recherche pour étudier melanomagenesis et des métastases du mélanome. Peau reconstruit peut aussi être une plateforme utile pour l&#39;évaluation des médicaments. De nombreux médicaments dont l&#39;éradication de cellules cancéreuses dans des conditions de culture 2D ont souvent peu d&#39;effet dans les applications expérimentales et cliniques. Comme vu dans la dans la tumeur in vivo, les cellules du mélanome dans les cultures en 3D sont souvent résistantes aux médicaments dont les cellules dans les cultures en 2D répondre, ce qui suggère que le microenvironnement module les voies de signalisation dans le mélanome. Pour la découverte de médicaments avec succès, la peau de reconstituer en 3D le modèle est un outil idéal précliniques pour prévoir les effets des composés in vivo (9,10). En résumé, la peau de reconstruire des modèles de combler le fossé entre données in vitro et in vivo. Elles conduiront à une meilleure compréhension des gènes qui sont impliqués dans la transformation et la façon dont les cellules souches de contribuer à cette transformation.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> EMEM 10x </td><td> Bio Whittaker </td><td> 12-684F </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Hyclone </td><td> SH-30071.02 </td></tr><tr><td> Bovine Tendon acide extraite du collagène </td><td> Organogenèse </td><td> 200/50 </td></tr><tr><td> Tissue Culture de 6 puits Plateaux avec inserts </td><td> Organogenèse </td><td> 9285 </td></tr><tr><td> Kératinocytes milieu sans sérum </td><td> Gibco </td><td> 17005042 </td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal dialysé </td><td> Hyclone </td><td> SH-30079.03 </td></tr><tr><td> recombinante du facteur de cellules souches humaines </td><td> Industries Fitzgerald </td><td> RDI-307-255X </td></tr><tr><td> FGF basique </td><td> Industries Fitzgerald </td><td> 30R-AF015 </td></tr><tr><td> L&#39;endothéline-3, humains </td><td> Américaine Peptide Co. </td><td> 88-5-10 </td></tr><tr><td> Chlorure de calcium </td><td> Sigma </td><td> C-7902 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> JRH Biosciences </td><td> 56430-10L </td></tr><tr><td> F12 (HAM) </td><td> Gibco </td><td> 11765-54 </td></tr><tr><td> Hydrocortisone </td><td> Sigma </td><td> H-0888 </td></tr><tr><td> Insuline, la transferrine, l&#39;éthanolamine, Sélénium (ITES) </td><td> BioWhittaker </td><td> 17839Z </td></tr><tr><td> O-Phosphorylethanolamine </td><td> Sigma </td><td> P0503 </td></tr><tr><td> Adénine </td><td> Sigma </td><td> A9795 </td></tr><tr><td> La progestérone </td><td> Sigma </td><td> P-8783 </td></tr><tr><td> Triiodothyronine </td><td> Sigma </td><td> T-5516 </td></tr><tr><td> Sérum de veau nouveau-né </td><td> Hyclone </td><td> SH3011802 </td></tr><tr><td> Tampon de 10% de formol </td><td> Surgipath </td><td> 00600 </td></tr><tr><td> Optimal des médias de coupe température de congélation (PTOM) </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Cassettes multi </td><td> Surgipath </td><td> 02293-BX </td></tr><tr><td> SCT biopsie papiers </td><td> Triangle des sciences biomédicales </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> SCT biopsie papiers </td><td> Triangle des sciences biomédicales </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> Moules jetables </td><td> Fisher </td><td> 15 à 182-501C </td></tr><tr><td> Teinture de benjoin composé </td><td> Jetables professionnels, Inc, </td><td> S42450 </td></tr><tr><td> Alcool Prep écouvillons </td><td> Pharmacie CVS </td><td></td></tr><tr><td> Black Silk tressé 5-0 </td><td> Ethicon </td><td> 682G </td></tr><tr><td> Compresses de gaze (stérile) </td><td> Pharmacie CVS </td><td></td></tr><tr><td> Forceps </td><td> Roboz </td><td> RS5070 </td></tr><tr><td> Ciseaux Iris </td><td> Roboz </td><td> RS5913 </td></tr><tr><td> Lames chirurgicales </td><td> Plume </td><td> 2976 </td></tr><tr><td> L&#39;anesthésie EZ </td><td> Euthanex Corp </td><td></td></tr><tr><td> SCID souris sans poils consanguine </td><td> Charles River </td><td></td></tr></tbody></table>

the three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal  skin and melanoma progression

La plupart des études in vitro en biologie cutanée expérimentales ont été effectuées dans les monocultures de deux dimensions (2D), alors que les preuves s&#39;accumulent suggèrent que les cellules se comportent différemment quand ils sont cultivés dans un 3D matrice extra-cellulaire et aussi interagir avec d&#39;autres cellules (1-5) . Des modèles de souris ont été largement utilisées pour étudier la morphogenèse des tissus in vivo. Cependant la souris et la peau humaine ont des différences significatives dans l&#39;architecture cellulaire et physiologie, ce qui rend difficile d&#39;extrapoler les études de la souris pour les humains. Depuis mélanocytes dans la peau de souris sont principalement localisées dans les follicules pileux, ils ont des propriétés biologiques distinctes de celles des humains, qui situent principalement à la couche basale de l&#39;épiderme. Le développement récent de la peau humaine en 3D de reconstruire des modèles a permis le terrain pour enquêter cellule-matrice et cellule-cellule interactions entre différents types cellulaires. La reconstruit se composent d&#39;un «derme» avec des fibroblastes incorporé dans un collagène de type I matrice, une &quot;épiderme&quot;, qui est composé de stratifié, les kératinocytes différenciés et une membrane basale fonctionnelle, qui sépare l&#39;épiderme du derme. Le collagène fournit un échafaudage, la livraison des nutriments, et le potentiel de la cellule à cellule d&#39;interaction. Les modèles de peau 3D intégrant des cellules mélanocytaires récapitulent les caractéristiques naturelles de l&#39;homéostasie mélanocytaire et la progression du mélanome de la peau humaine. Comme in vivo, les mélanocytes de la peau reconstruite sont localisés à la membrane basale entrecoupées de kératinocytes couche basale. Les cellules de mélanomes présentent les mêmes caractéristiques reflétant le stade de la tumeur originale (RGP, VGP et les cellules de mélanome métastatique) in vivo. Récemment, des cellules souches cutanées ont été identifiés dans le derme humain (6). Ces cellules souches multipotentes peuvent migrer vers l&#39;épiderme et se différencient pour les mélanocytes.

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Dans ce rapport, nous décrivons la peau en trois dimensions de reconstruire le modèle qui imite la peau humaine dans l&#39;architecture et la composition. La physiologie des mélanocytes, la progression du mélanome et le destin des cellules souches dermiques ont été étudiés en utilisant la peau de reconstruire le modèle. Le modèle est également utile comme outil pour l&#39;évaluation préclinique de médicaments.

La peau Three-Dimensional Human Reconstruire Modèle: un outil pour étudier la peau normale et la progression du mélanome

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

49.2K vues.  The Wistar Institute. Dans ce rapport, nous décrivons la peau en trois dimensions de reconstruire le modèle qui imite la peau humaine dans l'architecture et la composition. La physiologie des mélanocytes, la progression du mélanome et le destin des cellules souches dermiques ont été étudiés en utilisant la peau de reconstruire le modèle. Le modèle est également utile comme outil pour l'évaluation préclinique de médicaments.

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Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Impression Planar et en trois dimensions des encres conductrices

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Recherche

Bio-ingénierie

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Un procédé amélioré pour la préparation de collagène de type I de la peau

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Étude de la séparation d’écoulement tridimensionnelle induite par un polype de pli vocal modèle

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Fabrication de tissus de cartilage humain en utilisant trois dimensions jet d&#39;encre Technologie d&#39;impression

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Une peau pleine de défauts modèle pour évaluer la vascularisation des biomatériaux<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Génération d&#39;une épaisseur en trois dimensions équivalent de peau et automatisé Blessant

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Développement d&#39;un modèle organotypique multicellulaire en trois dimensions de la muqueuse intestinale humaine Grown Sous microgravité

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Cultiver un épiderme humain reconstruit tridimensionnel à grande échelle

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Génération d’équivalents de peau humaine vascularisée auto-assemblés

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...