Cette étude a été soutenue par le NCI (R01-R01-94160 et 155086), IU Simon Cancer Center et Wells Center for Pediatric Research.

Cette étude a été approuvée par le comité IACUC à l&#39;Indiana University School of Medicine. 1. Générer des souris avec des génotypes corrects <ol><li> Établir un modèle murin de la BCC. Compagnon K14-CREER souris (Jackson laboratoire stock numéro 005107) avec R26-SmoM2 YFP souris (Jackson laboratoire stock numéro 005130) (18) pour générer K14-CREER + et R26-SmoM2 YFP + souris. </li><li> Effectuer le génotypage. Spécimens queue Immerger (0,5 cm de long) dans une solution de lyse queue directPCR avec 1 mg / ml de protéinase K à 55 ° C pendant la nuit avec agitation. Le lendemain, retirer les débris de tissu par centrifugation à la vitesse supérieure dans une micro-centrifugeuse (pour garder le surnageant pour le génotypage). Utilisez 1 pl du surnageant pour chaque réaction PCR avec des amorces et des conditions recommandées par le fournisseur. Sélectionnez les souris avec les bons génotypes (à l&#39;âge de 3-6 semaines, la buprénorphine à 0,05-0,1 mg / kg sera appliqué par chaque SQ 8-12 h pendant 2-3 jours après queue snip) for l&#39;étape 2. </li></ol> 2. Induire l&#39;expression de SmoM2 dans les kératinocytes de la peau Provoquer SmoM2 expression dans les kératinocytes par l&#39;administration orale de tamoxifène (5 mg / kg de poids corporel dans 50 ml d&#39;huile végétale dans chaque repas) pendant 5 jours consécutifs par gavage oral avec une aiguille d&#39;alimentation (courbe de calibre 20). 3. La préparation des échantillons de peau En général, les phénotypes sont plus sévères sur l&#39;oreille et la queue dans K14creER/R26SmoM2 GFP souris. Pour se préparer à des analyses cellulaires, nous récoltons premier la peau de la souris après le sacrifice des animaux avec une procédure approuvée institutionnel (CO 2 plus dislocation cervicale). 4. Isoler épiderme <ol><li> Après souris de sacrifice avec une procédure approuvée (voir l&#39;étape 3), enlever la fourrure à l&#39;aide d&#39;une tondeuse. Échantillons de peau plonger dans une solution dispase (5 mg / ml dans du DMEM avec 10% de FBS) à 37 ° C pendant 1-2 heures (1 heure pour les souris âgés de moins de 8 semaines et 2 heurespour les souris âgées de 8 semaines). </li><li> Après le traitement de dispase, épiderme séparé du derme par forceps. </li></ol> 5. Générer des cellules individuelles <ol><li> Pour obtenir seule population cellulaire, émincer l&#39;épiderme par des ciseaux et puis plonger dans la solution de collagénase IV (1 mg / ml dans du DMEM avec 10% de FBS) pendant 1-2 heures à 37 ° C dans un tube de 50 ml. Essayez de mélanger doucement les tubes toutes les 20 minutes pour aider dissociation cellulaire. </li><li> Inspectez dissociation cellulaire au microscope. Lorsque des cellules individuelles peuvent être détectés dans le milieu de la collagénase, incuber l&#39;échantillon pendant 30 minutes supplémentaires pour augmenter le rendement des cellules. En général, l&#39;épiderme d&#39;une souris peut produire jusqu&#39;à 10 7 cellules. </li><li> Filtrer le mélange de tissu à travers tamis cellulaire (taille des pores 70 um), les cellules de spin bas à 1500 rpm via paillasse centrifugation, et laver une fois de temps avec PBS. </li></ol> 6. Les cellules d&#39;étiquetage et d&#39;effectuer des analyses de cytométrie en flux <ol><li> Reprendre les cellules dans 10% de FBSdans du PBS à 2,5 x 10 6 cellules / ml pour bloquer la liaison non spécifique (sur de la glace pendant 30 minutes) </li><li> Prélever des cellules à chacun des microtubes de 1,5 ml pour l&#39;étiquetage des anticorps spécifiques. Ajouter anticorps différents à chaque tube à une concentration finale de 2 mg / ml. Mélanger anticorps avec les cellules par l&#39;intermédiaire d&#39;un sommet doux pendant quelques secondes et laisser sur la glace pendant 30 min, puis laver avec 1 ml de PBS. Pour les échantillons BCC, nous avons utilisé les anticorps de biomarqueurs suivants: CD11b-PE, plus Gr1-APC (cellules myéloïdes ou des cellules myéloïdes suppressives dérivées); vimentine-FITC (fibroblastes) (voir réactifs pour plus de détails). </li><li> Pour la coloration intracellulaire, nous utilisons un kit et suivre le manuel de l&#39;éditeur (voir Réactifs pour plus de détails). Nous utilisons des cellules fraîches pour analyser les marqueurs de surface cellulaire. Après coloration des marqueurs de surface, laver les cellules, et les remettre en suspension dans PBS. Ajouter DAPI pour le mélange de cellules à une concentration finale de 1 ng / ml. DAPI se colorer les cellules mortes qui sera fermée à partir des analyses plus poussées. </li><li> Analyser les données avec spécifilogiciel c. Nous sélectionnons d&#39;abord des cellules individuelles sur la base du FSC vs SSC complot, et utilisons DAPI population négatif (cellules vivantes) pour une analyse plus approfondie. </li></ol>

<ol>
	<li>Rogers, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+estimate+of+nonmelanoma+skin+cancer+in+the+United+States.">Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States.</a> Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).</li><li>Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas:+attack+of+the+hedgehog.">Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog.</a> Nat. Rev. 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Chem. 271, 12125-12128 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+human+homolog+of+Drosophila+patched+in+the+nevoid+basal+cell+carcinoma+syndrome.">Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome.</a> Cell. 85, 841-851 (1996).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+Smoothened+mutations+in+sporadic+basal-cell+carcinoma.">Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma.</a> Nature. 391, 90-92 (1998).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+SMOH+in+sporadic+basal+cell+carcinomas+of+the+skin+and+primitive+neuroectodermal+tumors+of+the+central+nervous+system.">Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system.</a> Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).</li><li>Lam, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+frequent+activated+smoothened+mutation+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas.</a> Oncogene. 18, 833-836 (1999).</li><li>Nilsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+basal+cell+carcinomas+and+trichoepitheliomas+in+mice+overexpressing+GLI-1.">Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).</li><li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+oncogenic+potential+of+Gli2:+deletion+of+an+NH(2)-terminal+fragment+alters+skin+tumor+phenotype.">Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype.</a> Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+the+PTCH,+SMOH,+SUFUH+and+TP53+genes+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas.</a> Br. J. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+the+hedgehog+pathway+in+patients+with+the+basal-cell+nevus+syndrome.">Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).</li><li>Aszterbaum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+and+ionizing+radiation+enhance+the+growth+of+BCCs+and+trichoblastomas+in+patched+heterozygous+knockout+mice.">Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice.</a> Nat. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoothened+mutation+confers+resistance+to+a+Hedgehog+pathway+inhibitor+in+medulloblastoma.">Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.</a> Science. 326, 572-574 (2009).</li><li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma.">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).</li><li>Dijkgraaf, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+GDC-0449+refractory+smoothened+mutants+and+downstream+mechanisms+of+drug+resistance.">Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance.</a> Cancer Res. 71, 435-444 (2011).</li><li>Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+epithelial+stem+cells+from+human+skin.">Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin.</a> J. Vis. Exp. 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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous avons décrit une méthode d&#39;analyse de la population cellulaire dans les BCC. Les tissus tumoraux sont conformes de nombreux types de cellules, et chaque type de cellule se comporte différemment à un moment donné de la cancérogenèse, qui est très difficile à retrouver même dans les meilleures conditions in vitro. En utilisant ce protocole, nous avons montré que le développement du carcinome basocellulaire est accompagné par l&#39;expansion des cellules souches de l&#39;épiderme ainsi que le recrutement des cellules myéloïdes. En comparaison avec l&#39;immunohistochimie ou immunofluorescence analyses, les analyses de la population de cellules donnent une évaluation plus quantitative de l&#39;évolution de la population de cellules depuis des anticorps spécifiques à une variété de types de cellules sont maintenant disponibles. Pour ce protocole, à 10 semaines sont nécessaires pour terminer l&#39;étude parce que le changement phénotypique de l&#39;induction du gène nécessite du temps. Il est donc important de planifier l&#39;expérience à l&#39;avance. Pour l&#39;isolement et l&#39;analyse cellulaire, deux jours entiers peuvent être nécessaires. Parce que les cellules vivantes sont utilisés pour analyses, il est important de réserver une FACSCalibur avance. Nous avons également énuméré les problèmes communs lorsque l&#39;on travaille avec ce protocole (voir ci-dessous). Dans notre expérience, ci-dessous sont des problèmes communs que nous avons rencontrés: <ol><li> Mauvais séparation de l&#39;épiderme: Cela peut être causé par un traitement incomplet dispase (Veuillez augmenter le temps de traitement diapase) ou une solution de dispase insuffisante (La peau a besoin d&#39;être totalement immergé dans une solution dispase). Nous utilisons au moins 5 ml de solution dispase pour une souris. Le volume peut varier en fonction de la taille de la peau. </li><li> Faible rendement du nombre de cellules: Cette mai en raison de la digestion incomplète par la collagénase IV. S&#39;il vous plaît premier concentration de la collagénase de chèque ou de la date d&#39;expiration. Cela peut aussi être causée par une quantité insuffisante de l&#39;épiderme utilisé. En outre, la digestion enzymatique doit être effectuée à 37 ° C avec agitation (s&#39;il vous plaît ajuster la température avant de réaliser la digestion). </li><li> amas de cellules: Ceci est très fréquent pour les cellules de la peau (cellules pipettequelques fois après avoir traversé la crépine (avant centrifugation), ou l&#39;existence de Mg 2 + et Ca 2 + dans la solution (s&#39;il vous plaît utiliser Mg 2 + et Ca 2 + sans PBS pour le lavage de la cellule). </li><li> Trop de cellules mortes: Cela peut être le résultat de tissus dégradés (s&#39;il vous plaît utiliser les tissus frais), ou sur-digestion (éviter incubation prolongée avec dispase et de la collagénase IV). </li></ol> Ce protocole peut être combinée à une transplantation de moelle osseuse ou une transplantation de tissu à examiner à l&#39;origine de la cellule. Par exemple, la transplantation de cellules exprimant la GFP de la moelle osseuse des souris mortellement irradiées va nous permettre d&#39;examiner la contribution des cellules de la moelle osseuse à des fibroblastes associés aux tumeurs et des cellules myéloïdes. De même, des tumeurs de la peau peuvent être transplantées dans un nouvel hôte de la souris pour examiner les interactions tumeur-hôte. En plus d&#39;examiner l&#39;évolution de la population de cellules au cours de la cancérogenèse, ce protocole permettra également aux chercheurs d&#39;examinereffets des traitements médicamenteux pour les cellules dans l&#39;environnement tumoral. Bien que ce protocole est conçu pour utiliser des analyses de la population de cellules au cours de la carcinogenèse cutanée, de légères modifications peuvent être apportées à d&#39;autres types de cancer. En résumé, les analyses de la population de cellules dans des modèles murins de cancer de la peau peuvent nous donner les changements dynamiques cellulaires au cours de la cancérogenèse, conduisant à une meilleure compréhension de la biologie cellulaire dans la transformation néoplasique et différents événements cellulaires dans le processus de transformation.

Comme le type le plus commun de cancer chez l&#39;homme, le carcinome basocellulaire (BCC) affecte environ 2 millions d&#39;Américains par an 1. Les preuves accumulées indiquent que l&#39;activation anormale de hérisson (Hh) de signalisation est la force motrice qui sous-tend le développement BCC (Evalué à 2,3). Modifications de signalisation Hh dans BCC comprennent des mutations inactivant de PTCH1 4-6, les mutations gain de fonction de SMO 7-9, et l&#39;expression aberrante de Hh voie facteurs de transcription Gli1 10 et GLI2 11 ou inactivés mutations rares de Su régulateur négatif (Fu ) 12. A travers toutes ces études et d&#39;autres, la Federal Drug Administration (FDA) a récemment approuvé l&#39;utilisation de Hh signalisation inhibiteur Vismodegib pour traiter métastatique ou localement avancé BCC 13-15. Malgré toutes ces réalisations 16, nous ne comprenons pas encore les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels signalisation Hh drives CRACinogenesis. L&#39;établissement de modèles animaux en utilisant activation tissu-spécifique de la signalisation Hh est toujours important pour ces études et pour notre compréhension de la résistance aux médicaments. Chez les souris, les souris de type sauvage ne se développent pas BCC, même sous de fortes doses de rayonnement UV ou ionisants cancérigènes. En revanche, PTCH1 + / - souris sont sensibles au développement BCC 17,18. La pénétrance de développement BCC dans Ptch1 + / - souris est supérieure à 50%, bien que PTCH1 18,19 + / - souris développent rarement BCC atteint leur pleine croissance si elles sont conservées dans des conditions normales. En raison de la létalité embryonnaire de Ptch1 - / -, KO tissu-spécifique de PTCH1 est généralement utilisé pour l&#39;étude 20. En outre, expression conditionnelle peau spécifique de oncogénique SmoM2 YFP (Krt14-créer: R26-SmoM2 YFP ou Krt14-cre: R26-SmoM2 YFP) conduit à la formation de plusieurs BCC microscopiques à un âge très précoce, en fournissant un test génétique facile pour signalisation Hh fontwnstream de SMO 21. Il ya trois problèmes majeurs dans notre connaissance de la biologie BCC. Tout d&#39;abord, l&#39;origine cellulaire des carcinomes basocellulaires n&#39;est pas tout à fait clair. Alors que certaines études appuient le bouger de follicule pileux comme le site de cellules souches 22-24, Youssef et al. 25 localisé la cellule murin d&#39;origine cutanées des tumeurs Hh axées être dans la région de l&#39;épiderme inter-folliculaire, pas dans le follicule pileux , en utilisant Cre spécifique des cellules à activer l&#39;expression d&#39;un ROSA26 axée transgénique mutant SMO. Deuxièmement, les interactions cellulaires au cours du développement BCC ne sont pas bien comprises. Il est connu que les kératinocytes avec la signalisation Hh activé peut conduire à la formation de BCC, mais d&#39;autres changements cellulaires ne sont pas bien compris. En outre, le traitement de SMO antagonistes chez la souris peut conduire à la résistance aux médicaments 26-28. Ainsi, de nouvelles cibles pour BCC sont grandement nécessaires. La compréhension de ces trois questions, il faut des analyses des changements cellulaires chez la souris pendant cancérogènesenesis. Alors que plusieurs méthodes ont été publiés pour la culture des kératinocytes, la cytométrie en flux et l&#39;isolement des cellules souches de la peau 29-31, il n&#39;y a aucun procédures complètes pour des analyses cellulaires dans BCC de souris. En combinant des méthodes pour le modèle murin de BCC, la séparation de l&#39;épiderme, la production de cellules individuelles à partir d&#39;analyses cellulaires et des tissus, nous allons fournir aux lecteurs un ensemble de procédures pour étudier la signalisation cellulaire, cellulaires et les interactions moléculaires au cours du développement BCC. Nous pensons que ce protocole permettra aux lecteurs de voir comment chaque procédure est accomplie. En outre, nous avons fourni quelques données pour illustrer ce que les résultats devraient ressembler et le dépannage pour aider les lecteurs à surmonter les difficultés au cours de l&#39;exécution de ces procédures.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td> Company</td>
 <td> Cat#</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>directPCR lysis reagent (tail) </td>
 <td>Viagen Biotech </td>
 <td>102-T </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>proteinase K </td>
 <td> Sigma </td>
 <td>P2308 </td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ApliTag 360 taq polymerase </td>
 <td>Applied biosystems </td>
 <td>N8080155 </td>
 <td> store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tamoxifen </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T5648 </td>
 <td> store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feeding needle (20 gauge) </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>01-290-9B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase </td>
 <td>Roche Diagnostic </td>
 <td>04942078001</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase IV </td>
 <td>Worthington </td>
 <td>LS004189</td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell strainer </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>08-771-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-CD11b-PE </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 12-0112-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Gr1-APC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 17-5931-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-vimentin-FITC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>11-9897-80 </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

cell population analyses during skin carcinogenesis

le développement du cancer est un processus en plusieurs étapes impliquant des nombreux types cellulaires dont les cellules cancéreuses, les précurseurs des cellules immunitaires, les fibroblastes et les cellules endothéliales. Chaque type de cellules subit signalisation et fonctionnel changements au cours de la cancérogenèse. Le défi actuel pour de nombreux chercheurs sur le cancer est de disséquer ces changements dans chaque type de cellule pendant le processus à étapes multiples in vivo. Au cours des dernières années, les auteurs ont mis au point un ensemble de procédures pour isoler différentes populations de cellules au cours du développement du cancer de la peau à l&#39;aide K14creER/R26-SmoM2 souris YFP. La procédure est divisée en 6 parties: 1) la génération de souris appropriés pour l&#39;étude (K14creER et R26-SmoM2 YFP souris dans ce protocole) + +, 2) induisant SmoM2 YFP expression dans la peau de souris; 3) la préparation des biopsies de la peau de souris; 4) l&#39;isolement épiderme de la peau; 5) la préparation d&#39;épiderme à partir de cellules individuelles; 6) l&#39;étiquetage des populations de cellules uniques pour l&#39;analyse par cytométrie en flux.Génération d&#39;un nombre suffisant de souris avec le droit génotype est l&#39;étape limitante dans ce protocole, qui peut prendre jusqu&#39;à deux mois. Le reste des étapes de prendre quelques heures à quelques jours. Dans ce protocole, nous incluons également une section pour le dépannage. Bien que nous nous concentrons sur le cancer de la peau, ce protocole peut être modifiée pour s&#39;appliquer à d&#39;autres modèles animaux de maladies humaines.

Il est connu que les souris ne développent pas les carcinomes basocellulaires, sauf avec l&#39;activation de signalisation Hh. Figure 1 montre le phénotype de la peau suite à l&#39;expression induite de oncogénique lissée, SmoM2 YFP. Figure 2 montre l&#39;analyse des cellules myéloïdes chez des souris normales et porteur d&#39;une tumeur. CD11b + + cellules Gr1 sont dérivées de cellules myéloïdes, et certains d&#39;entre eux sont myéloïde cellules suppressives dérivées. En situation normale, le CD11b + Gr1 + population cellulaire est difficilement détectable, mais va augmenter en réponse à l&#39;inflammation ou le développement de tumeurs. Nous avons montré que l&#39;expression induite de SmoM2YFP dans les résultats de la peau par une augmentation de CD11b + Gr1 + cellules. Actuellement, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce changement de BCC ne sont pas claires. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig1.jpg" /> Figure 1. Morphological changements après induction SmoM2YFP dans la peau de souris. du haut montre un schéma de génotypes de souris. Le panneau du milieu: le K14creER + et R26-SmoM2 YFP + souris traitées par le tamoxifène a montré grossièrement anomalie dans la peau (à droite) ainsi que des tumeurs de la peau dans la section H &amp; E (à gauche). Le panneau du bas: la souris sans SmoM2YFP induction a montré une peau d&#39;apparence normale (à droite) et aucune morphologie anormale dans la section H &amp; E (à gauche). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig2.jpg" /> Figure 2. D&#39;analyse de flux de CD11b + + cellules Gr1. Afin d&#39;examiner le changement de CD11b + + cellules Gr1 pendant le développement du cancer de la peau, nous avons isolé les cellules simples et colorées avec des anticorps marqué par fluorescence à CD11b et Gr1. Après analyse avec FlowJo, nous avons remarqué une augmentation de cette population de cellules dans les tissus de la peau chez des souris traitées par le tamoxifène.

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Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Cancérogenèse est un processus impliquant des interactions entre les cellules cancéreuses et le micro de cancer. Pour disséquer les événements moléculaires, il faut isoler les différentes populations de cellules à différents stades au cours du développement du cancer. En utilisant un modèle de souris pour le carcinome basocellulaire, nous décrivons un protocole pour les analyses cellulaires au cours de la cancérogenèse.

Analyses de la population de cellules pendant la carcinogenèse cutanée

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.3K vues.  Indiana University. Cancérogenèse est un processus impliquant des interactions entre les cellules cancéreuses et le micro de cancer. Pour disséquer les événements moléculaires, il faut isoler les différentes populations de cellules à différents stades au cours du développement du cancer. En utilisant un modèle de souris pour le carcinome basocellulaire, nous décrivons un protocole pour les analyses cellulaires au cours de la cancérogenèse.

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Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

Mesure précise et simple de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β en utilisant un dosage de sang total Stimulation

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Recherche

Médecine

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

Rénale Capsule xénogreffe sous-cutanée et Pellet implantation pour l&#39;évaluation de la carcinogenèse prostatique et l&#39;hyperplasie prostatique bénigne

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

Séché Blood Spot Collection de biomarqueurs de santé pour maximiser la participation à des études de la population

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Séquentiel<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des cellules souches / progénitrices ostéogéniques lors de la réparation de la fracture

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murin endoscopie pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Guérison multimodale d&#39;imagerie de la cancérogenèse et de l&#39;évaluation de la plaie intestinale et l&#39;inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Un modèle de la peau de souris fœtale de Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

miRNA expression analyses en cancer de la prostate tissus cliniques

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

A Method of Trigonometric Modelling of Seasonal Variation Demonstrated with Multiple Sclerosis Relapse Data

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to 55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 clinical centers across 20 countries located in both hemispheres. Central to the success of this method was the strategic use of plot analysis to guide and corroborate the statistical regression modelling. Initial plot analysis was necessary for establishing realistic hypotheses regarding the presence and structural form of seasonal and latitudinal influences on relapse probability and then testing the performance of the resultant models. Trigonometric regression was then necessary to quantify these relationships, adjust for important confounders and provide a measure of certainty as to how plausible these associations were. Synchronization of graphing techniques with regression modelling permitted a systematic refinement of models until best-fit convergence was achieved, enabling novel inferences to be made regarding the independent influence of both season and latitude in predicting relapse onset timing in MS. These methods have the potential for application across other complex disease and epidemiological phenomena suspected or known to vary systematically with season and/or geographic location.

Combining plot analysis with trigonometric regression is a robust method for exploring complex, cyclical phenomena such as relapse onset timing in multiple sclerosis (MS). This method enabled unbiased characterisation of seasonal trends in relapse onset permitting novel inferences around the influence of seasonal variation, ultraviolet radiation (UVR) and latitude.

Une méthode de modélisation trigonométrique de variation saisonnière démontrée avec la sclérose en plaques Relapse données

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to  55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Cutaneous dénervation chirurgicale: une méthode pour tester l&#39;exigence de nerfs dans les modèles murins de la maladie de la peau

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Assessment of Child Anthropometry in a Large Epidemiologic Study

A high proportion of children have overweight and obesity in the United States and other countries. Accurate assessment of anthropometry is essential to understand health effects of child growth and adiposity. Gold standard methods of measuring adiposity, such as dual X-ray absorptiometry (DXA), may not be feasible in large field studies. Research staff can, however, complete anthropometric measurements, such as body circumferences and skinfold measurements, using inexpensive portable equipment. In this protocol we detail how to obtain manual anthropometric measurements from children, including standing and sitting height, weight, waist circumference, hip circumference, mid-upper arm circumference, triceps skinfold thickness, and subscapular skinfold thickness, and procedures to assess the quality of these measurements. To demonstrate accuracy of these measurements, among 1,110 school-aged children in the pre-birth cohort Project Viva we calculated Spearman correlation coefficients comparing manual anthropometric measurements with a gold standard measure of body fat, DXA fat mass1. To address reliability, we evaluate intra-rater technical error of measurement at a quality control session conducted on adult female volunteers.

In epidemiologic studies of children, well-trained research staff can accurately and precisely assess weight, height, sitting height, skinfold thicknesses, and body circumferences.

Évaluation de l&#39;anthropométrie des enfants dans une étude épidémiologique Grand

A high proportion of children have overweight and obesity in the United States and other countries. Accurate assessment of anthropometry is essential to ...