Le PDX a révolutionné les études précliniques expérimentales sur le cancer. Nous pouvons maintenant imiter, en laboratoire, ce qui se passe chez les patients. Et maintenant, nous pouvons travailler sur la façon de surmonter la résistance et comment, à long terme, nous pouvons augmenter la survie des patients.
La démonstration de la procédure sera Min Xiao. Pour commencer, transférez le tissu précédemment recueilli de mélanome à une boîte stérile de Petri. En travaillant avec des ciseaux chirurgicaux, la lame de scalpel, et des forceps, d’abord enlever le tissu normal du tissu normal autant que possible.
Et puis enlever le tissu nécrotique identifié par le tissu blanc pâle-ish situé centralement dans la tumeur. Ensuite, utilisez un scalpel pour subdiviser un morceau initial de tumeur en morceaux à peu près égaux pour l’implantation chirurgicale de souris. Si le tissu tumoral est trop dur pour la dissociation mécanique, utilisez un scalpel pour émincer les morceaux de tumeur aussi finement que possible pour former une boue.
Transférer le lisier dans un tube de 50 millilitres avec la solution de sel équilibré de Hank froid sans ions calcium et magnésium. Centrifugeuse à 220 fois g pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir enlevé le supernatant, re-suspendre le lisier en 10 millilitres de réchauffer, les médias de digestion fraîche par gramme de tissu tumoral.
Placez le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 20 minutes et mélangez vigoureusement toutes les cinq minutes avec une pipette jetable. Laver le lisier à l’aide de jusqu’à 50 millilitres de HBSS, centrifugeuse à 220 fois g pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius, puis enlever le supernatant. Ajouter cinq millilitres de tampon TEG préchauffé par gramme de tissu tumoral, secouer pour suspendre doucement, et placer le tube à 37 degrés Celsius pendant deux minutes, sans mélanger.
Pour étancher la trypsine, ajouter au moins un volume égal de supports de coloration à froid et de centrifugeuse à 220 fois g pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir enlevé le supernatant, ajouter 10 millilitres de colorant par gramme de tissu tumoral, et re-suspendre la pastille par pipetting de haut en bas. Filtrez-le à travers une passoire à cellules de 40 micromètres pour obtenir une suspension à cellule unique pour l’injection de souris.
Pour implanter l’excision chirurgicale ou le tissu chirurgical de biopsie, rasez d’abord les cheveux du bas du dos des souris anesthésiées de six à huit semaines de NSG, laissant une zone d’environ 1,5 centimètres à trois centimètres sans cheveux. Préparez des morceaux de tumeur, et divisez le lisier de tumeur dans un Petri en monticules individuels pour l’implantation chirurgicale. À l’aide d’une lame de scalpel, faire une incision d’environ cinq millimètres de long au centre de l’arrière de la souris.
Avec une paire de forceps, la vie jusqu’à la peau sur le côté de l’incision en face de l’opérateur. Avec des ciseaux dans l’autre main, séparer la peau de la couche musculaire en coupant doucement la membrane fasciale avec de petites coupures de ciseaux, créant ainsi une poche pour le tissu tumoral. Utilisez une lame de scalpel pour ramasser un mandrin tumoral, ainsi qu’un monticule individuel de tissu de boue tumorale, et placez doucement le tissu dans la poche créée.
Ajoutez ensuite 100 microlitres de matrice extracellulaire artificielle sur le monticule de tissu tumoral dans la poche. À l’aide de deux paires de forceps, tirez vers le haut de l’incision sur les deux extrémités de sorte que les bords de la plaie s’approchent l’un de l’autre. Appliquez ensuite un ou deux clips de plaie pour fermer la plaie.
Injecter subcutanément un à cinq milligrammes par kilogramme d’analgésique. Lorsque la guérison est complètement, après environ sept jours, enlever les clips de la plaie. Surveillez les souris une fois par semaine pour vérifier s’il y a des tumeurs palpables.
Une fois que les tumeurs atteignent un volume désiré, utilisez des forceps chirurgicaux pour soulever la peau adjacente à la tumeur de la souris euthanasiée et faire une coupe horizontale à l’aide de ciseaux incurvés. Utilisez une technique de séparation émoussée pour mobiliser la peau des deux côtés de la tumeur et sur la tumeur, exposant la tumeur. Utilisez des ciseaux et une lame de scalpel pour séparer la tumeur du fascia.
Découpez la tumeur et transférez-la dans une boîte de Pétri stérile. Couper la tumeur en petits morceaux et enlever le tissu nécrotique de la tumeur. Pour banquer le tissu tumoral pour l’implantation future, prenez deux à trois petits morceaux de tumeur et hachez-les en morceaux plus petits qu’un par un millimètre.
Transférer tous les tissus hachés dans une vile cryogénique de deux millilitres. Ajouter un millilitre de congélation des médias et bien mélanger. Placer les flacons dans un contenant de congélation cellulaire pré-refroidi à base d’isopropanol sur de la glace sèche, conserver le contenant dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant la nuit, puis transférer les flacons dans un entrepôt d’azote liquide.
Pour casser le tissu de gel pour des analyses en aval, placez les morceaux de tissu de tumeur dans un flacon cryogénique, mettez la vile cryogénique dans l’azote liquide immédiatement, et stockez les flacons dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius. Quand trois méthodes différentes de tissu de tumeur croissant ont été comparées, la suspension simple de cellules de tumeur avec l’utilisation de la digestion enzymatique était la plus réussie. En plus de permettre une croissance tumorale plus rapide, il était également suffisant pour une tumeur initiale d’être étendue à 10 à 20 souris, tandis que le mandrin tumoral et la méthode du lisier ne peuvent être étendus qu’en cinq à 10 souris.
Les modèles de xénogreffe patients-dérivés du mélanome reflètent souvent la sensibilité de drogue que le patient a montrée en thérapie. Une xénogreffe dérivée du patient de mélanome qui a au commencement répondu à un inhibiteur de BRAF, mais finalement rechuté, a également montré la sensibilité initiale à l’inhibition de protéine de BRAF, plus l’inhibiteur de kinase de MEK, mais les tumeurs ont finalement rechuté. Il est essentiel de prendre soin lors de la préparation des tissus PDX pour les opérations bancaires, car cela assurera le succès dans les futures expansions PDX, essais thérapeutique, ainsi que la caractérisation.
Avec le matériel de PDX, le séquençage d’ARN simple de cellules, le séquençage exome entier, et la caractérisation protéomique, sont parmi les nombreuses méthodes que notre laboratoire tire parti pour disséquer la résistance de thérapie. La technique PDX permet aux chercheurs d’étudier la résistance à la thérapie à l’aide de cellules tumorales qui récapitulent mieux la biologie tumorale chez un patient humain par rapport aux modèles de cancer traditionnels cultivés sur du plastique. Cet avantage permet des idées plus prédictives.
Les chercheurs devraient toujours prendre soin et utiliser le niveau de biosécurité deux précautions lors de la manipulation des tissus tumoraux dérivés d’un patient humain.
