Ce travail a été soutenu par le Fonds autrichien pour la science (FWF, P20619 P22988 et à BZ).

Préparation de l&#39;échantillon à micro-ondes assistée <ol><li> Avant le début de la préparation des échantillons doit programmer le processeur micro-ondes automatique des tissus pour la microscopie électronique (EM AMW Leica, Leica Microsystems, Vienne, Autriche) avec les protocoles suivants (tableau 1) pour la préparation d&#39;échantillons pour le TEM micro-ondes assistée: <img src="/files/ftp_upload/2950/2950table1.jpg" alt="Tableau 1" /> Tableau 1. Protocole de préparation de l&#39;échantillon en utilisant un rayonnement micro-ondes. Les différentes colonnes indiquent (de gauche à droite): <ol><li> Nombre flacon (nr Vial.) Représente l&#39;ordre dans lequel le flacon est chargé dans le carrousel du processeur. </li><li> Étape du processus réel. </li><li> Réactifs dans les flacons. </li><li> Durée de l&#39;étape actuelle. </li><li> La température maximale qui est atteinte dans le flacon avant l&#39;irradiation micro-ondes est mis hors tension. </li><li> Réglage irradiation micro-ondes: Continu = incrément rapide de la températurease, maintien de la température de consigne; Pente = augmentation de la température douce, la température finale atteinte à la fin; pulsé = augmentation rapide de la température, il s&#39;est éteint jusqu&#39;à ce que la température baisse de 5 ° C, la puissance repris pour atteindre la température. </li><li> Puissance maximale de l&#39;irradiation micro-ondes. </li></ol></li><li> Fraîchement préparer les solutions pour les différentes étapes décrites dans le protocole de préparation d&#39;échantillon (pour résine époxy Agar 100 voir 1.7), les remplir dans les flacons désignés selon le protocole programmé (tableau 1), charger les flacons sur le carrousel, puis insérez le carrousel dans le traitement des tissus à micro-ondes, et finalement charger le premier flacon dans la chambre de mono-mode. </li><li> Découpez de petites sections de feuilles (1mm 2) de Nicotiana tabacum infectée par le virus de la mosaïque du tabac (TMV) avec une lame de rasoir sur une plaque de cire à modeler dans une goutte de glutaraldéhyde à 3% (Agar Scientific Ltd, Stansted, Angleterre) dans 60 mM Sørensen tampon phosphate (pH 7,2) à la température ambiantetérature. </li><li> Transférer les sections fines avec des pincettes tout de suite dans les paniers désignés avec une largeur de maille d&#39;environ 200 um. Empiler les paniers les uns sur les autres et de les insérer dans la chambre de mono-mode. Il faut veiller à ce que les échantillons sont constamment couvertes de la solution de fixation pendant le chargement et l&#39;empilage des paniers afin qu&#39;ils ne se dessèchent pas. </li><li> Démarrer le micro-ondes préalablement programmé assistée protocole de préparation des échantillons pour la fixation, la déshydratation et l&#39;infiltration. </li><li> Alors que la préparation des échantillons est effectuée automatiquement par le processeur tissu micro-ondes continuer avec coloration négative avec la matière végétale restante comme décrit dans la section 3 (coloration négative). </li><li> Fraîchement préparer résine époxy Agar 100 en mélangeant les composants suivants comme décrit: remplissage 24g Agar 100, 16g d&#39;anhydride succinique dodécényle, et 10 g d&#39;anhydride méthyl nadique (pour toutes les composantes voir Agar Scientific Ltd, Stansted, Angleterre) dans un gobelet en plastique, chaleur elle à40 ° C et bien mélanger. Ajouter 1,2 g de benzyldiméthylamine et bien mélanger. Remplir de résine époxy Agar 100 dans la polymérisation désigné se forme juste avant le protocole de préparation de l&#39;échantillon arrive à son terme (par exemple, lors de l&#39;étape 22 dans le tableau 1). </li><li> Une fois le protocole terminé (après l&#39;étape 22 dans le tableau 1) libérer les paniers empilés contenant les échantillons infiltrés à partir de la chambre de mono-mode dans le dernier flacon du carrousel. Retirez le carrousel de l&#39;appareil à micro-ondes, dépiler les paniers et les charger à l&#39;aide de pinces fines dans les formes polymérisation désignés. Il faut veiller à ce que les échantillons sont toujours recouverts de résine époxy Agar 100 au cours de dépilage et le chargement de sorte qu&#39;ils ne se dessèchent pas. </li><li> Empiler les formulaires de polymérisation au-dessus de l&#39;autre. Il faut veiller à ce que les échantillons sont toujours recouverts de résine époxy Agar 100 lors de l&#39;empilage et de chargement afin qu&#39;ils ne se dessèchent pas. </li><li> Retirer les flacons utilisés précédemment dans le carrousel de la micro-onde tissue processeur, chargez-le avec les paniers empilés et insérez le carrousel dans le traitement des tissus à micro-ondes. </li><li> Démarrez le protocole de polymérisation précédemment programmé (tableau 1). </li><li> Alors que la polymérisation est effectuée automatiquement par le processeur tissu micro-ondes, d&#39;examiner les grilles colorées négativement avec un microscope électronique à transmission [par exemple Philips CM10 TEM, FEI (anciennement Philips), Eindhoven, Pays-Bas] et effectuez l&#39;analyse d&#39;image comme décrit dans la section 3 et 4 ( coloration négative et analyse d&#39;image). </li><li> Après le protocole est terminée, retirez les formes de polymérisation de la chambre de mono-mode, dépiler les formes de polymérisation et enlever les blocs polymérisés contenant les échantillons. Ils sont maintenant prêts à être sectionné avec un microtome. </li></ol> 2. Découper et de sectionnement <ol><li> Insérez un ou plusieurs blocs dans des porte-échantillons distincts pour la coupe ultra fin avec l&#39;échantillon sur le collage supérieure d&#39;environ 1 cm de la porte. </li><li>Coupez le bloc avec une tondeuse échantillon pour TEM (par exemple Leica Reichert Ultratrim; Leica Microsystems) de sorte qu&#39;une face du bloc de max. 1 mm de longueur et 200 um de largeur, qui contient du matériel foliaire autant que possible est atteint (la taille du bloc visage pourrait être nécessaire d&#39;ajuster à la taille du couteau de diamant). </li><li> Section du bloc avec un ultramicrotome (par exemple Reichert Leica Ultracut S; Leica Microsystems) à l&#39;aide d&#39;un couteau de diamant à un angle de 45 ° couteau (p. ex Diatome Ultra 45, Gröpl, Tulln, Autriche). L&#39;épaisseur de coupe doit être réglé à environ 70 à 90 nm et la vitesse de coupe doit être d&#39;environ 1 mm / s. Procurez-vous plusieurs sections avec un formvar (Agar Scientific Ltd) recouvert de cuivre ou de nickel 200 grille à mailles carrées. </li><li> Post-tacher les sections sur la grille avec du citrate de plomb (Agar Scientific Ltd; citrate de plomb dissous dans 42ml 1.1g eau bidistillée et 8ml NaOH 1N) pendant 5 minutes dans une boîte de Pétri partiellement remplis avec du NaOH pour créer une émission de CO 2 l&#39;environnement et pour 15 kmnutes avec de l&#39;acétate d&#39;uranyle 1% (Agar Scientific Ltd) dissous dans de l&#39;eau distillée à température ambiante. Laver les grilles avec de l&#39;eau distillée pendant 1 minute entre chaque étape de post-coloration. Sécher à l&#39;air les grilles dans une maille. </li><li> Examiner les sections avec un microscope électronique à transmission (TEM par exemple Philips CM10, FEI, Eindhoven, Pays-Bas). </li></ol> 3. Coloration négative <ol><li> Récolte environ 100 mg de TMV-infecté des feuilles et préparer sève brute en homogénéisant le matériel pendant 2 minutes avec une lame de rasoir sur une lame de microscope dans 100 ul de 60 mM de tampon phosphate Søfrensen (pH 7,2). </li><li> Transfert 20 pi de l&#39;homogénat obtenu sur le premier puits d&#39;une lame de microscope enduite de téflon avec 4 ou plusieurs puits (en variante, il est également possible de transférer le broyat sur un morceau de parafilm). </li><li> Placer une grille formvar revêtu sur le dessus de l&#39;homogénat avec la formvar (Agar Scientific Ltd) côté enduit tournée vers la goutte et incuil bate de 5 minutes. </li><li> Laver la grille 2 fois pendant 2 minutes chacun en plaçant la grille au-dessus de deux gouttes de 200 pl 60 mM Sørensen tampon phosphate (pH 7,2). </li><li> Incuber la grille pendant 1 minute avec un acide phosphotungstique fraîchement préparée de 2% (Agar Scientific Ltd) en solution dans 60 mM Sørensen tampon phosphate (pH 6,5). </li><li> Retirez la grille et le laisser sécher à l&#39;air dans une maille. </li><li> Examinez la grille avec un microscope électronique à transmission (par exemple Philips CM10 TEM; FEI, Eindhoven, Pays-Bas). Prendre au moins 10 images de virions choisis au hasard coloration négative (au moins 10 ou plus virions doit être visible sur chaque image) avec le microscope électronique à transmission à un grossissement primaire de 21000X ou plus. Il faut veiller à ce que toutes les images ont le même grossissement. </li></ol> 4. L&#39;analyse d&#39;image <ol><li> Mesurer la longueur et la largeur d&#39;au moins 100 particules de virus choisis au hasard simples sur les micrographies réalisées à partir deles échantillons colorées négativement à l&#39;aide de n&#39;importe quel logiciel d&#39;analyse d&#39;images [Cell par exemple D (Olympus, Vie et Sciences des Matériaux Europe GmbH, Hamburg, Allemagne) avec l&#39;outil d&#39;analyse de particules ou Optimas 6.5.1-(Media Cybernetics Inc, Bethesda, Maryland, USA)]. </li><li> Calculer les moyennes et les écarts types pour atteindre une longueur moyenne et la largeur des particules virales visualisés par coloration négative méthodes et TEM. </li><li> Comparer la longueur et des caractéristiques ultrastructurales (obtenu en 2.5) avec des tailles de virus et des altérations ultrastructurales induites par les maladies virales connues dans la littérature afin d&#39;identifier clairement les maladies virales. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Après avoir assisté à micro-ondes de préparation des échantillons typiques TMV-induites modifications ultrastructurales tels que grandes surfaces contenant des virions alignés sous forme parallèle a pu être observée au microscope électronique à transmission dans le cytosol des personnes infectées Nicotianquelques cellules tabacum (figure 1A). En outre, dans la sève brute de TMV-infecté laisse particules TMV a pu être observé que flexueux, en forme de bâtonnets structures après coloration négative (figure 1B). Analyse de l&#39;image de 100 particules virales ont révélé une taille moyenne de 280 nm pour TMV en longueur et en largeur 17Nm (figure 2). L&#39;ultrastructure de cellules infectées par le TMV et la taille des virions observés dans cette étude ont été jugés en conformité avec TMV propriétés induites par le tabac et ultrastructurales dans la gamme de taille de particules TMV précédemment rapportés dans la littérature 9-15. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Micrographies électroniques à transmission de cellules infectées par le TMV feuilles et des virions. A) L&#39;image montre l&#39;ultrastructure des cellules infectées par le TMV feuilles mésophylle de Nicotiana tabacum après-ondes usine de préparation d&#39;échantillons assistée. Notez la grande région de virions parallèles alignés qui se sont accumulés dans le cytosol.C = chloroplastique avec de l&#39;amidon (St), M = mitochondrie, N = noyau, V = vacuole, Bar = 2 pm. B) L&#39;image montre des virions qui ont été détectées par coloration négative dans la sève des feuilles infectées. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Taille relative des virions. Distribution relative de la longueur et la largeur de TMV-particules après coloration négative la sève des feuilles infectées telles qu&#39;elles figuraient dans le microscope électronique. Les valeurs moyennes (moyenne longueur / largeur ± écart-type) ont été calculés à partir de 100 virions.

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	<li>Bozzola, J. J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy. , (1999).</li><li>Kuo, J., Kuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+plant+tissues+for+ultrastructural+study.">Processing plant tissues for ultrastructural study.</a> Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. 369, 47-65 (2007).</li><li>Schroeder, J. A., Gelderblom, H. 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Microsc. 233, 258-268 (2009).</li><li>Ler&#237;a, F., Marco, R., Medina, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+antigenic+preservation+of+plant+samples+by+microwave-enhanced+fixation,+using+dedicated+hardware,+minimizing+heat-related+effects.">Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects.</a> Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).</li><li>Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+and+digital+imaging+technology+reduce+turnaround+times+for+diagnostic+electron+microscopy.">Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy.</a> Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).</li><li>Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+polymerisation+with+microwave+irradiation+for+transmission+electron+microscopy.">Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy.</a> Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).</li><li>Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectric+spectroscopy+of+tobacco+mosaic+virus.">Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus.</a> Biochim. Biophys. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+tobacco+mosaic+virus+strains+on+the+ultrastructure+of+tobacco+leaf+parenchymal+cells.">Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells.</a> Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).</li><li>Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., F&#228;ndrich, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens:+a+fresh+look+at+tobacco+mosaic+virus.">High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus.</a> J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).</li><li>Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+tobacco+mosaic+virus+particles+as+scaffolds+for+display+of+protein+antigens+for+vaccine+applications.">Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications.</a> Virology. 348, 475-488 (2006).</li><li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+TEM+diagnosis+of+plant+virus+diseases.">Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases.</a> J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).</li><li>Giberson, R. T., Demaree, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+processing+techniques+for+electron+microscopy:+a+four-hour+protocol.">Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol.</a> Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Micro-ondes préparation assistée échantillon de plante pour le TEM a été prouvé à fournir des données rapide et fiable ultrastructurales dans les quelques heures 3,4,16. La préservation structurale fine des organites et membranes obtenus avec la méthode utilisée dans cette étude était similaire aux échantillons conventionnels et cryofixed 5,15 avec l&#39;avantage d&#39;une réduction massive de la fixation de l&#39;échantillon et l&#39;incorporation de temps de 3 jours ou plus pour environ 2 heures. Cela représente le protocole le plus rapide de préparation des échantillons pour le TEM actuellement disponibles dans la littérature. La méthode décrite dans cette étude a combiné micro-ondes préparation assistée échantillon de plante pour le TEM aux méthodes de coloration négative qui a permis une identification claire et rapide de TMV-induites modifications ultrastructurales et l&#39;agent viral lui-même. TMV modifications ultrastructurales induites pourraient être étudiés après la coupe, de sectionnement et de post-marquage pendant environ 4 heures après le début de la fixation de la transmission électron microscope. Utilisation de la manière entièrement automatique en mode de préparation des échantillons libéré le chercheur pour mener coloration négative dans l&#39;intervalle afin de déterminer la taille et la largeur de l&#39;agent viral. Ainsi, nous pouvons conclure que cette méthode permet un diagnostic clair et rapide des maladies à virus des plantes en une demi-journée qui est d&#39;une grande importance pour une utilisation future dans des expériences agricoles et scientifiques des plantes phytopathologie. Comme cette méthode pourrait également être utilisée pour le diagnostic rapide des maladies animales et humaines qu&#39;il a un grand potentiel pour des applications futures dans le domaine médical et de pathologie vétérinaire.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif / équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Glutaraldéhyde </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1312 </td><td></td></tr><tr><td> Tétroxyde d&#39;osmium </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1022 </td><td></td></tr><tr><td> 100 agar résine </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1043 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;anhydride dodécénylsuccinique </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1051 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;anhydride méthyl nadique </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1081 </td><td></td></tr><tr><td> Benzyldiméthylamine </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1060 </td><td></td></tr><tr><td> Citrate de plomb </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1210 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acétate d&#39;uranyle </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1260A </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide phosphotungstique </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1213 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1202 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Leica EM AMW </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leica (Reichert) Ultratrim </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Modèle plus récent est disponible </td></tr><tr><td> Leica (Reichert) Ultracut S </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Modèle plus récent est disponible </td></tr><tr><td> Diatome Ultra 45 </td><td> Gröpl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Philips CM10 TEM </td><td> FEI (anciennement Philips) </td><td> &lt;/ Td&gt; <td> Modèle plus récent est disponible </td></tr><tr><td> La cellule D </td><td> Olympus Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Optima 6.5.1 </td><td> Media Cybernetics Inc </td><td></td><td> Une version plus récente est disponible </td></tr></tbody></table>

microwave assisted rapid diagnosis of plant virus diseases by transmission electron microscopy

Les enquêtes sur les modifications ultrastructurales induites par les virus sont souvent nécessaires pour identifier clairement les maladies virales chez les plantes. Avec une préparation d&#39;échantillon conventionnel pour microscopie électronique à transmission (MET) de telles enquêtes peut prendre plusieurs jours 1,2 et ne sont donc pas adapté pour un diagnostic rapide des maladies à virus des plantes. Fixation à micro-ondes peut être utilisé pour réduire considérablement le temps de préparation d&#39;échantillons pour les enquêtes TEM avec des résultats similaires à ceux observés ultrastructurales après préparation des échantillons conventionnelle 3-5. Beaucoup de différents dispositifs sur mesure à micro-ondes faites sont actuellement disponibles qui peuvent être utilisés pour la fixation réussie et l&#39;intégration des échantillons biologiques pour les enquêtes TEM 5-8. Dans cette étude, nous montrons sur le virus de la mosaïque du tabac (TMV) infecté plantes de Nicotiana tabacum qu&#39;il est possible de diagnostiquer des altérations ultrastructurales dans les feuilles en une demi-journée à l&#39;aide de la préparation des échantillons à micro-ondes assistée pour TEM. Nous avons choisi de réaliser cette étude avec un appareil à micro-ondes disponible dans le commerce car il effectue la préparation des échantillons presque entièrement automatiquement 5 à la différence des autres appareils disponibles, où de nombreuses étapes doivent encore être effectuées manuellement 6-8 et sont donc plus de temps et beaucoup de travail. En préparation de l&#39;échantillon est effectuée de manière entièrement automatique coloration négative de particules virales dans la sève des autres TMV feuilles infectées et l&#39;examen suivant de l&#39;ultrastructure et la taille peut être effectuée lors de la fixation et l&#39;inclusion.

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Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Cette étude décrit une méthode qui permet le diagnostic rapide et claire des maladies à virus des plantes en une demi-journée à l&#39;aide d&#39;une combinaison de micro-ondes usine de préparation d&#39;échantillons assistée par microscopie électronique à transmission et les méthodes de coloration négative.

Micro-ondes assistée diagnostic rapide des maladies virales des plantes par microscopie électronique à transmission

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

microwave-assisted-rapid-diagnosis-plant-virus-diseases-transmission

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K vues.  University of Graz. Cette étude décrit une méthode qui permet le diagnostic rapide et claire des maladies à virus des plantes en une demi-journée à l'aide d'une combinaison de micro-ondes usine de préparation d'échantillons assistée par microscopie électronique à transmission et les méthodes de coloration négative.

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Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

Diagnostic rapide du virus de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages: L&#39;utilisation d&#39;un portable RT-PCR et lyophilisés réactifs dans le domaine

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Recherche

Immunologie et infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein complexes and assemblies. In fact, single particle electron microscopy1 and two-dimensional (2D) electron crystallography2 have become relatively routine methodologies and a large number of structures have been solved using these methods. At the same time, image processing and three-dimensional (3D) reconstruction of helical objects has rapidly developed, especially, the iterative helical real-space reconstruction (IHRSR) method3, which uses single particle analysis tools in conjunction with helical symmetry. Many biological entities function in filamentous or helical forms, including actin filaments4, microtubules5, amyloid fibers6, tobacco mosaic viruses7, and bacteria flagella8, and, because a 3D density map of a helical entity can be attained from a single projection image, compared to the many images required for 3D reconstruction of a non-helical object, with the IHRSR method, structural analysis of such flexible and disordered helical assemblies is now attainable.
In this video article, we provide detailed protocols for obtaining a 3D density map of a helical protein assembly (HIV-1 capsid9 is our example), including protocols for cryo-EM specimen preparation, low dose data collection by cryo-EM, indexing of helical diffraction patterns, and image processing and 3D reconstruction using IHRSR. Compared to other techniques, cryo-EM offers optimal specimen preservation under near native conditions. Samples are embedded in a thin layer of vitreous ice, by rapid freezing, and imaged in electron microscopes at liquid nitrogen temperature, under low dose conditions to minimize the radiation damage. Sample images are obtained under near native conditions at the expense of low signal and low contrast in the recorded micrographs. Fortunately, the process of helical reconstruction has largely been automated, with the exception of indexing the helical diffraction pattern. Here, we describe an approach to index helical structure and determine helical symmetries (helical parameters) from digitized micrographs, an essential step for 3D helical reconstruction. Briefly, we obtain an initial 3D density map by applying the IHRSR method. This initial map is then iteratively refined by introducing constraints for the alignment parameters of each segment, thus controlling their degrees of freedom. Further improvement is achieved by correcting for the contrast transfer function (CTF) of the electron microscope (amplitude and phase correction) and by optimizing the helical symmetry of the assembly.

This article describes a method to obtain a three-dimensional (3D) structure of helically assembled molecules using cryo-electron microscopy. In this protocol, we use HIV-1 capsid assemblies to illustrate the detailed 3D reconstruction procedure for achieving a density map by the iterative helical real-space reconstruction method.

Structure du VIH-1 Assemblées capside par cryo-microscopie électronique et reconstruction itérative hélicoïdal espace réel

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

L&#39;analyse de l&#39;accessibilité au solvant des résidus de cystéine sur<em&gt; Cueilleur rayado fino virus</em&gt; Virus-like particles produits dans<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plantes et réticulation des peptides à VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Haute résolution microscopie électronique de la<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag sécrétion de type IV Système Pili Produit dans différentes conditions de Fer Disponibilité

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Modélisation du cycle de vie du virus Ebola Sous biosécurité de niveau 2 Conditions de particules de type viral contenant Tetracistronic minigénomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Méthodologies pour l&#39;étude<em&gt; B. subtilis</em&gt; biofilms comme un modèle pour Caractériser Inhibiteurs biofilm petites molécules

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Protocoles pour étudier l&#39;hôte d&#39;un tissu de distribution, en mode de transmission, et l&#39;effet sur la remise en forme de l&#39;hôte d&#39;un Densovirus dans le coton Heliothis

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

Synergie antimicrobienne essais par le jet d’encre imprimante-assisted damier automatisé Array et la méthode de temps-détruisent manuelle

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...