Nous remercions le Dr Yule Liu de l’Université Tsinghua d’avoir fourni le vecteur PVX-LIC. Ce travail a été soutenu par un fonds de démarrage du Texas A & M AgriLife Research et le projet Hatch TEX0-1-9675 de l’USDA National Institute of Food and Agriculture à JS.

1. Cultivez des plants de pommes de terre.
<ol><li>Propager des plants de pommes de terre in vitro dans des tubes de culture (25 x 150 mm) avec des milieux Murashige et Skoog (MS) plus la vitamine de Gamborg (mélange de sel basal MS, vitamine gamborg, 30 g/L de saccharose, 3,5 g/L de gélose, pH = 5,7). Placez les tubes dans la salle de croissance sous 20–22 °C, 16 h de photopériode claire/8 h sombre et intensité lumineuse 120 μmol/m2∙s1. REMARQUE: De nouvelles pousses et racines se développent normalement en 1 à 2 semaines à partir des plantes. Propager les plantes avec des milieux vitaminiques frais de MS / Gamborg tous les mois.</li>
	<li>Quatre semaines plus tard, transplantez des plantes in vitro dans le sol et cultivez-les dans une serre sous 20–22 °C, 16 h de photopériode claire/8 h sombre et intensité lumineuse 120 μmol/m2∙s1. REMARQUE: Les plantes avec des racines et des feuilles nouvellement développées conviennent à la transplantation. Maintenez l’humidité pour les plantes fraîchement transplantées pendant les 3 à 4 premiers jours.</li>
</ol>2. Construisez les vecteurs VbMS.
<ol><li>Concevoir et cloner les molécules TM en tandem court (STTM, Figure 1)22,53 pour les miARN d’intérêt. REMARQUE: Acquérir des séquences de miARN basées sur des données expérimentales ou à partir de la base de données miRbase54,55,56,57,58,59. La séquence miR166 utilisée dans cette étude a été décrite précédemment60.<ol>
<li>Concevez le module TM en insérant une séquence d’inadéquation, normalement 5'-CTA-3', dans la séquence du complément inverse des miARN au site correspondant aux 10e à 11e nucléotides du miARN. REMARQUE: Par exemple, la séquence Stu-miR160 est 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, où les 10e à 11e nucléotides sont en gras. La séquence inverse du complément (dans les désoxynucléotides) est 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' et le site d’insertion du renflement de discordance est indiqué en gras. La séquence moléculaire TM (désoxynucléotide) doit être 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.</li>
		<li>Concevoir des amorces pour le clonage du fragment STTM (Figure 1). Utilisez des oligonucléotides d’ADN avec la séquence d’espacement 48-nt comme modèle pour le clonage par PCR. L’amorce avant se compose d’un liant LIC1 (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), de la séquence avant de ce qui précède conçue pour la molécule TM et de la séquence partielle 5' de l’espaceur 48-nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). L’amorce inverse se compose d’un liant LIC2 (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), de la séquence du complément inverse de la molécule TM et d’un complément inverse partiel à la séquence 3' de l’espaceur 48-nt (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3'). REMARQUE: La séquence d’espacement 48-nt est 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAGAAT-3'. Par exemple, pour STTM-miR160, l’amorce avant doit être 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTATGGT-3'; l’amorce inverse doit être 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' (Figure 1).</li>
		<li>Amplifiez le fragment STTM dans un volume de 50 μL par PCR en utilisant l’espaceur universel 48-nt synthétisé comme modèle et une ADN polymérase haute fidélité.<ol>
<li>Configurez la réaction de PCR en mélangeant 0,5 μL de chaque amorce (40 μM), 0,5 μL d’oligo d’espacement 48-nt (40 μM), 5 μL de tampon PCR 10x, 1 μL de mélange dNTP (10 mM chacun), 0,1 μL d’ADN polymérase haute fidélité (10 U/μL) et 43 μL de ddH2O pour un volume total de 50 μL. Effectuez l’amplification PCR standard comme suit : 94 °C pendant 3 min, 32 cycles de 94 °C pendant 45 s, 60 °C pendant 45 s et 72 °C pendant 60 s.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Purifier le fragment STTM par précipitation d’éthanol. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol et 1/10 volume d’acétate de sodium 3 M (pH = 4,0) aux produits PCR. Mélanger vigoureusement et centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant et rincez la pastille avec 1 mL d’éthanol à 70 %. Sécher la pastille et la dissoudre dans 20 μL de ddH2O. REMARQUE: Utilisez l’électrophorèse de l’ADN pour vérifier l’amplification des produits de PCR STTM.</li>
		<li>Mettre en place la réaction de l’ADN polymérase T4 sur la glace en mélangeant 2,5 μL de produit STTM PCR purifié, 0,5 μL de tampon d’ADN polymérase T4, 0,05 μL de 1 M de dithiothréitol (DTT), 0,25 μL de 100 mM dATP, 0,1 μL d’ADN polymérase T4 (3 U/μL) et 1,6 μL de ddH2O pour un volume total de 5 μL. Incuber le mélange à 37 °C pendant 15 min, et traiter les produits à 75 °C pendant 20 min pour inactiver l’ADN polymérase T4.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez la construction VbMS basée sur PVX.<ol>
<li>Digérer 5 μg de plasmide PVX-LIC38 avec 2,5 μL de SmaI (20 U/μL) dans un volume de 100 μL.</li>
		<li>Ajouter un volume égal de phénol:chloroforme:isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8,0) aux produits PVX-LIC digérés et mélanger vigoureusement. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse. Ajouter un volume égal de chloroforme:isopropanol (24:1) et vortex vigoureusement. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min. REMARQUE: Le vecteur PVX-LIC héberge la cassette LIC pour le clonage. La cassette LIC du vecteur PVX-LIC contient un gène ccdB et un gène résistant au chloramphénicol et doit être maintenue/propagée dans la souche DB3.1 d’E. coli à l’aide d’un milieu LB contenant de la kanamycine (50 μg/L) et du chloramphénicol (15 μg/L).</li>
		<li>Transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol et 1/10 volume d’acétate de sodium 3 M (pH = 4,0) et mélanger vigoureusement. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et retirer le surnageant.</li>
		<li>Rincez vigoureusement la pastille avec 1 mL d’éthanol à 70 % et vortexez vigoureusement. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et retirer le surnageant. Sécher la pastille et dissoudre le plasmide PVX-LIC digéré avec 100 μL de ddH2O.</li>
		<li>Mettre en place la réaction de l’ADN polymérase T4 sur la glace en mélangeant 2,5 μL d’ADN vecteur PVX-LIC digéré, 0,5 μL de tampon d’ADN polymérase T4, 0,05 μL de 1 M DTT, 0,25 μL de 100 mM dTTP et 0,1 μL d’ADN polymérase T4 (3 U/μL) dans un volume total de 5 μL. Incuber le mélange à 37 °C pendant 15 min et traiter les produits à 75 °C pendant 20 min à inactiver l’ADN polymérase T4.</li>
	</ol></li>
	<li>Clonez la séquence STTM dans le vecteur PVX-LIC à l’aide d’une réaction LIC. Mélanger les produits DE PCR STTM traités à l’ADN polymérase T4 (5 μL) et les plasmides PVX-LIC traités à l’ADN polymérase T4 (5 μL). Incuber à 70 °C pendant 5 min, refroidir à 22 °C à une rampe de 0,1 °C/s et maintenir à 22 °C pendant 30 min à l’aide d’une machine PCR. REMARQUE: Prolongez le temps d’incubation jusqu’à la nuit à 4 ° C pour obtenir une plus grande efficacité du clonage LIC.</li>
	<li>Transformer 5 μL des produits de réaction LIC en E. coli DH5α et croître sur une plaque LB contenant 50 μg/mL de kanamycine62,63. Choisissez et vérifiez les colonies positives par PCR avec les amorces de clonage et l’amorce universelle pour le vecteur PVX-LIC suivi du séquençage.<ol>
<li>Effectuer la PCR de colonie avec l’amorce avant pour PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') en combinaison avec l’amorce inverse pour le clonage STTM afin d’identifier les clones positifs. La taille de la bande PCR doit être d’environ 300 pb. REMARQUE : Vérifiez les séquences de fragments STTM par séquençage du cycle de terminaison64,65.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolez les plasmides PVX-STTM des clones validés et transformez-les en souches Agrobacterium GV3101, GV2260 ou EHA10562,63. Vérifier les colonies d’Agrobacterium par PCR. REMARQUE: Confirmer les colonies d’Agrobacterium par PCR en utilisant l’amorce avant pour PVX-LIC et l’amorce inverse pour le clonage STTM.</li>
</ol>3. Effectuer un test VbMS à base de PVX dans les plants de pommes de terre.
<ol><li>Transplantez des plants de pommes de terre in vitro de 4 semaines dans le sol. Les plantes transplantées seront soumises au test VbMS 3 à 4 jours plus tard.</li>
	<li>Inoculer les plants de pommes de terre avec Agrobacterium contenant les plasmides PVX-STTM. REMARQUE: Pour le test VbMS dans la pomme de terre, l’infiltration médiée par Agrobacterium et l’inoculation de grattage de cure-dents sont effectuées simultanément.<ol>
<li>Prélever et inoculer des transformants positifs contenant des vecteurs PVX-STTM en 50 mL de LB liquide contenant 50 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL de rifampicine. Cultiver dans un incubateur à 28 °C à 220 tr/min pendant 16 h jusqu’à OD600 = 1,0.</li>
		<li>Dans le même temps, strier les colonies positives d’Agrobacterium sur au moins deux nouvelles plaques LB contenant 50 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL de rifampicine et croître à 28 °C pendant 1 jour. Inclure le vecteur PVX-LIC38,66 comme témoin et le PVX-GFP67,68 pour surveiller la propagation du virus.</li>
		<li>Recueillir la culture liquide d’Agrobacterium par centrifugation à 3 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Remettre en suspension les cellules d’Agrobacterium avec un volume égal de tampon d’infiltration (10 mM MgCl2, 10 mM MES et 200 μM acétosyringone, pH = 5,6) et ajuster à OD600 = 1,0. Incuber à température ambiante pendant 6 h.</li>
		<li>Infiltrer la culture d’Agrobacterium dans la face abaxiale des feuilles complètement dilatées avec une seringue sans aiguille de 1 mL.<ol>
<li>Retournez et tenez une feuille d’une main, puis utilisez un doigt pour soutenir la lame de la feuille du côté adaxial sur le site d’infiltration. Gardez la seringue verticale à la surface de la feuille avec l’autre main et infiltrez la culture d’Agrobacterium dans le côté abaxial de la lame.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Grattez la culture d’Agrobacterium des plaques LB et grattez la surface de la tige des deux premiers entre-nœuds des plants de pommes de terre infiltrés avec un cure-dent. Grattez doucement l’épiderme de la tige. Évitez de percer la tige, ce qui peut causer de graves dommages aux plantes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultivez les plantes infiltrées à 22 °C avec une photopériode sombre de 16 h/8 h et une intensité lumineuse de 120 μmol/m2∙ s1 dans une serre. REMARQUE: Les phénotypes causés par le silençage du miARN apparaissent généralement dans les 2 à 4 semaines suivant la post-ininoculation (Figure 2, Figure 3). Il faut généralement 10 à 20 jours pour que le phénotype VbMS apparaisse après l’infiltration. Le phénotype VbMS dépend des propriétés des miARN spécifiques et des gènes cibles, des conditions de croissance et des variétés de pommes de terre.</li>
</ol>4. Effectuer une analyse d’expression.
<ol><li>Lorsque les phénotypes apparaissent à 2 à 4 semaines après la post-vaccination, collectez des tissus tels que des pousses, des feuilles, des fleurs ou des racines avec des phénotypes des plantes VbMS et des tissus des plantes témoins avec des ciseaux. Isoler les ARN totaux des tissus prélevés.</li>
	<li>Vérifiez la qualité de l’ARN par électrophorèse62,63 et quantifiez la concentration d’ARN en mesurant l’absorbance OD260 avec un spectrophotomètre.</li>
	<li>Utilisez la PCR à transcription inverse en temps réel en boucle tige (RT-PCR) pour analyser l’expression des miARN.<ol>
<li>Pour des miARN spécifiques, concevez une amorce de transcription inverse tige-boucle. Les amorces RT à boucle tige contiennent une colonne vertébrale universelle de 5' et une extension de 3' 6-nt d’un miARN spécifique. Concevoir une dorsale universelle de 5' (5'- GTCTCCTCTGGGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') qui forme une structure tige-boucle. (La majuscule correspond à une séquence répétée inversement et la minuscule à la région de boucle).</li>
		<li>Une partie de la séquence dorsale 5' qui forme une boucle sert d’amorce inverse pour l’amplification PCR ultérieure (séquence gras-italique dans la séquence dorsale). Ajoutez une séquence d’extension 6-nt qui est inversement complémentaire à l’extrémité 3' du miARN d’intérêt à l’amorce de boucle tige pour fournir une spécificité pour la transcription inverse (Figure supplémentaire 1A). REMARQUE: Concevoir l’amorce de transcription inverse tige-boucle telle que décrite par Chen et al.69 et Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Par exemple, l’amorce de transcription inverse en boucle tige pour Stu-miR160 est conçue comme 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'. L’amorce de transcription inverse tige-boucle pour la famille miR165/166 de pomme de terre est conçue comme 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3'. (Les séquences majuscules en gras fournissent la spécificité de la transcription inverse pour des miARN spécifiques).</li>
		<li>Mettre en place la réaction de transcription inverse en mélangeant 50 à 200 ng d’ARN total, 1 μL de l’amorce de transcription inverse tige-boucle (100 μM), 2 μL de tampon 10x, 0,2 μL d’inhibiteur de RNase (40 U/μL), 0,25 μL de dNTPs (10 mM chacun) et 1 μL de transcriptase inverse (200 U/μL) sur glace. Ajouter le ddH2O sans nucléase à un volume total de 20 μL.</li>
		<li>Effectuez une transcription inverse à l’aide de la procédure de transcription inverse pulsée. Incuber le mélange réactionnel de transcription inverse à 16 °C pendant 30 min, effectuer un cycle de température de 30 °C pendant 30 s, 42 °C pendant 30 s et 50 °C pendant 1 s, pour un total de 60 cycles, et inactiver la transcriptase inverse par incubation à 85 °C pendant 5 min.</li>
		<li>Pour l’analyse PCR en temps réel de l’expression des miARN, concevez l’amorce avant en fonction de la séquence de miARN, mais n’incluez pas les séquences qui chevauchent l’amorce de transcription inverse de la boucle de tige conçue ci-dessus. Ajoutez une extension de 3 à 7 pouces aux 5' de l’amorce avant pour optimiser la longueur, la température de fusion et la teneur en GC (figure supplémentaire 1). REMARQUE: L’amorce inverse universelle est 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Par exemple, l’amorce de transcription inverse tige-boucle pour Stu-miR160 est conçue comme 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. L’amorce de transcription inverse tige-boucle pour la famille miR165/166 est 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Les séquences en gras servent d’extensions 5' pour l’optimisation de l’amorce. Les amorces de transcription inverse en boucle de tige et les amorces de PCR en temps réel pour le miARN peuvent être conçues à l’aide de l’outil de conception d’amorces miRNA73.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthétiser les ADNc des ARNm cibles par PCR à transcription inverse standard (RT-PCR). Incuber le mélange réactionnel de transcription inverse à 37 °C pendant 60 min et inactiver la transcriptase inverse en chauffant à 85 °C pendant 5 min. REMARQUE : (1) Prédire les ARNm cibles à l’aide du programme psRNATarget74 si les ARNm cibles ne sont pas connus. (2) L’amorce universelle de transcription inverse pour l’ARNm est une amorce ancrée 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT</li>
	<li>Configurez la réaction pcR en temps réel pour les miARN d’intérêt et les ARNm cibles. Mélanger 0,5 μL d’ADNc modèle, 5 μL de 2x tampon PCR en temps réel avec du vert SYBR, 0,05 μL de chaque amorce avant et arrière (40 μM) et 4,4 μL de ddH2O dans un volume total de 5 μL sur glace.</li>
	<li>Incuber à 95 °C pendant 3 min, 40 cycles de 95 °C pendant 3 s et 60 °C pendant 30 s. Effectuer une analyse ultérieure de la courbe de fusion comme suit : Incuber à 95 °C pendant 15 s, refroidir à 60 °C à une rampe de 20 °C/s, maintenir à 60 °C pendant 60 s, chauffer à 95 °C à une rampe de 0,2 °C/s et maintenir à 95 °C pendant 15 s. Analysez les valeurs Ct à l’aide des méthodes ΔΔCt76,77 et tracez les moyennes avec des erreurs-types. REMARQUE: (1) Les amorces de PCR en temps réel pour les ARNm cibles peuvent être conçues comme décrit75. (2) Le gène de la polyubiquitine 10 de la pomme de terre peut servir de contrôle interne pour la normalisation dans la pomme de terre. L’amorce avant pour le gène de la polyubiquitine 10 de la pomme de terre est 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' et l’amorce inverse 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Pour l’analyse PCR en temps réel, la contamination et la formation d’amorces-dimères peuvent générer des résultats faussement positifs. Pour surveiller l’amplification non spécifique et augmenter la responsabilité de l’analyse PCR en temps réel, il est recommandé d’inclure des contrôles sans modèle et une transcriptase inverse pour les tests PCR en temps réel.</li>
</ol>

Nous présentons un système de silencieux miARN à base de PVX pour caractériser la fonction des miARN endogènes dans la pomme de terre en intégrant la conception STTM dans le vecteur PVX. Le système VbMS s’est avéré efficace pour faire taire les miARN165/166 dans la pomme de terre, une famille de miARN hautement conservée parmi les espèces végétales.
L’approche DE MT a été développée pour interférer avec l’expression des miARN sur la base d’une imitation artificielle d...

Les microARN végétaux (miARN) sont caractérisés comme des ARN régulateurs codés nucléairement de 20 à 24 nucléotidiques1 et jouent un rôle fondamental dans presque tous les aspects des processus biologiques des plantes, y compris la croissance et le développement2,3, la photosynthèse et le métabolisme4,5,6,7, la synthèse et la signalisation hormonales8,9, les réponses biotiques et abiotiques10, 11,12,13, et la régulation des nutriments et de l’énergie14,15. Les rôles régulateurs des miARN végétaux sont bien programmés et remplis généralement aux niveaux post-transcriptionnels en clivant ou en réprimant par translation les ARNm cibles.
D’énormes progrès ont été réalisés en ce qui concerne l’identification, le profilage transcriptionnel et la prédiction des miARN dans la pomme de terre16,17,18,19,20,21. Cependant, la caractérisation fonctionnelle des miARN dans les plantes, y compris la pomme de terre, a pris du retard par rapport à d’autres organismes en raison du manque d’approches génétiques efficaces et à haut débit. Il est difficile d’effectuer une analyse fonctionnelle des miARN individuels par analyse standard de perte de fonction, car la plupart des miARN appartiennent à des familles présentant une redondance génétique considérable22. De plus, un seul miARN peut contrôler plusieurs gènes cibles23 et plusieurs miARN différents peuvent moduler la même voie moléculaire de manière collaborative24,25. Ces propriétés rendent difficile la caractérisation de la fonction d’un miARN spécifique ou d’une famille de miARN.
Une grande partie de l’analyse fonctionnelle des miARN s’est fortement appuyée sur des approches de gain de fonction qui ont des limites évidentes. La méthode des miARN artificiels (amiRNA) exploite les transcriptions primaires endogènes (pri-miARN) pour produire des miARN à un niveau élevé, conduisant à l’inhibition de l’expression du gène cible26,27,28,29. Cependant, le marquage d’activation et la surexpression de miARN à l’aide d’un puissant promoteur constitutif de 35S conduisent souvent à une expression accrue de miARN qui ne sont pas représentatifs des conditions in vivo et peuvent donc ne pas refléter la fonction endogène des miARN30. Une autre approche a été développée impliquant l’expression de formes résistantes aux miARN de gènes cibles contenant des mutations indésirables dans les sites de liaison et/ou de clivage31,32,33. Mais cette approche peut également potentiellement entraîner une mauvaise interprétation du phénotype dérivé du transgène cible résistant aux miARN en raison d’artefacts transgéniques. Par conséquent, les conclusions de ces études sur le gain de fonction doivent être tirées avec prudence34. Une autre limitation majeure des approches décrites ci-dessus est qu’elles nécessitent une transformation, ce qui nécessite beaucoup de travail et de temps. De plus, les approches dépendantes du transgène ne sont guère applicables aux espèces végétales transformatrices-récalcitrantes. Par conséquent, il est essentiel de développer une approche rapide et efficace de perte de fonction pour démêler la fonction des miARN.
Pour contourner la condition préalable de la procédure de transformation, le silençage des microARN à base de virus (VbMS) a été établi en combinant les stratégies d’imitation de cible (TM) avec des vecteurs dérivés du virus. Dans le système VbMS, les molécules de MT conçues artificiellement sont exprimées transitoirement à partir d’une colonne vertébrale virale, offrant un outil puissant, à haut débit et permettant de gagner du temps pour disséquer la fonction des miARN endogènes végétaux35,36. VbMS a été initialement développé chez N. benthamiana et la tomate avec le virus du hochet du tabac (TRV)35,36,37 et a été étendu à Arabidopsis, coton, blé et maïs en utilisant divers autres systèmes d’expression du virus, y compris le virus de la pomme de terre X (PVX)38, le virus de la déformation des feuilles de coton (ClCrV)39, le virus de la mosaïque du concombre (CMV)40,41,42, le virus de la mosaïque du blé chinois (CWMV)43 et le virus de la mosaïque des bandes d’orge (BSMV)44,45.
La pomme de terre (Solanum tuberosum) est la quatrième culture vivrière la plus importante et la culture non céréale la plus cultivée au monde, principalement en raison de sa valeur nutritionnelle élevée, de sa production d’énergie élevée et de ses besoins en intrants relativement faibles46. Plusieurs caractéristiques de la pomme de terre en font une plante modèle dicotylédone attrayante. Il s’agit d’une culture polyploïde à multiplication végétative avec un taux de croisement élevé, une hétérozygotie et une diversité génétique élevée. Cependant, à ce jour, il n’existe aucun rapport caractérisant la fonction des miARN dans la pomme de terre utilisant VbMS. Nous présentons ici une approche VbMS de pomme de terre basée sur le PVX de pomme de terre adaptée au clonage indépendant de la ligature (LIC) pour évaluer la fonction des miARN dans les plants de pommes de terre38. Nous avons choisi la famille miR165/166 pour illustrer le test VbMS parce que la famille miR165/166 et leurs ARNm cibles et les facteurs de transcription homéodomaine/fermeture à glissière Leu de classe III (HD-ZIP III) ont été largement caractérisés22,47,48. Les gènes HD-ZIP III sont des régulateurs clés du développement du méristème et de la polarité des organes, et la suppression de la fonction miR165/166 conduit à une expression accrue des gènes HD-ZIP III, entraînant des défauts de développement pléotropes tels qu’une dominance apicale réduite et des modèles aberrants de polarité des feuilles22,35,38,41 . Les phénotypes de développement facilement enregistrables corrélés avec le silence des miRNA165/166 permettent une évaluation précise de l’efficacité du test VbMS à base de PVX.
Dans cette étude, nous démontrons que le système VbMS basé sur PVX peut bloquer efficacement la fonction des miARN dans la pomme de terre. Étant donné que le système de silençage génique induit par le virus (VIGS) à base de PVX a été établi dans un certain nombre de variétés de pommes de terre49,50,51,52, cette approche VbMS basée sur PVX peut probablement être appliquée à un large éventail d’espèces de pommes de terre diploïdes et tétraploïdes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">100 &#181;M dATP and 100 &#181;M dTTP</td>
			<td style="width:188px;">Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td>
			<td style="width:120px;">TQAC136</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">3 M Sodium acetate, pH 4.0.</td>
			<td style="width:188px;">Teknova, Hollister, CA 95023, USA</td>
			<td style="width:120px;">#S0297</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:188px;">TCI America, Portland, OR 97203, USA</td>
			<td style="width:120px;">D2666-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chloroform</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0757-950ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:188px;">TCI America, Portland, OR 97203, USA</td>
			<td style="width:120px;">D0798-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DTT</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0281-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">E. coli DB3.1</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">E. coli DH5&#945;</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>for the destination constructs generated by LIC cloning</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td>
			<td style="width:120px;">G99260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs</td>
			<td style="width:188px;">Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, 
			Wilmington, MA, USA</td>
			<td>7958960001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0944-1L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Koptec Pure Ethanol &#8211; 200 Proof</td>
			<td style="width:188px;">Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA</td>
			<td style="width:120px;">V1005M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MES</td>
			<td style="width:188px;">TCI America, Portland, OR 97203, USA</td>
			<td style="width:120px;">M0606-250G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MgCl2</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td>
			<td style="width:120px;">MFCD00149781</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td style="width:120px;">M0253L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;">Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td>
			<td style="width:120px;">ND-ONEC-W</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System</td>
			<td style="width:188px;">Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA</td>
			<td style="width:120px;">170-9703</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro</td>
			<td style="width:188px;">Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA</td>
			<td style="width:120px;">950030010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">pH meter</td>
			<td style="width:188px;">Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA</td>
			<td style="width:120px;">Benchtop pH / mV Meter - 860031</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0.</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0883-400ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phytagel: Gellan Gum</td>
			<td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA</td>
			<td style="width:120px;">J63423-A1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PVX VIGS vector: PVX-LIC</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:167px;">Zhao et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td>
			<td style="width:120px;">4485697</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Real-time PCR reagent: KAPA SYBR&#174; FAST qPCR Master Mix (2x) Kit</td>
			<td style="width:188px;">Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, 
			Wilmington, MA 01887, USA</td>
			<td style="width:120px;">7959389001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Restriction enzyme: SmaI</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td>R0141S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix</td>
			<td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA</td>
			<td style="width:120px;">95107-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit</td>
			<td style="width:188px;">Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td>
			<td style="width:120px;">SKU: D3485-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">RNase Inhibitor Murine</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td style="width:120px;">M0314L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">RNAzol RT</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td>
			<td style="width:120px;">R4533</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Soil: Metro-Mix 360</td>
			<td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td>
			<td style="width:120px;">Metro-Mix 360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">T4 DNA polymerase and buffer</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td style="width:120px;">M0203S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

potato virus x-based microrna silencing (vbms) in potato.

Le silençage des microARN à base de virus (VbMS) est un outil rapide et efficace pour la caractérisation fonctionnelle des microARN (miARN) dans les plantes. Le système VbMS a été développé et appliqué pour diverses espèces végétales, notamment Nicotiana benthamiana, la tomate, l’Arabidopsis, le coton et les plantes monocotylédones telles que le blé et le maïs. Ici, nous décrivons un protocole détaillé utilisant des vecteurs VbMS basés sur PVX pour faire taire les miARN endogènes dans la pomme de terre. Pour éliminer l’expression d’un miARN spécifique, des molécules d’imitation cible (TM) de miARN d’intérêt sont conçues, intégrées dans des vecteurs de virus végétaux et exprimées dans la pomme de terre par infiltration d’Agrobacterium pour se lier directement au miARN endogène d’intérêt et bloquer sa fonction.

La figure 2 montre les plants de pommes de terre PVX-STTM165/166 (Katahdin) avec une croissance ectopique des tissus foliaires du côté abaxial de la lame des feuilles le long des veines. Des phénotypes plus sévères tels que la formation de feuilles en forme de trompette ont également été observés. En revanche, aucune anomalie phénotypique n’a été observée dans les usines témoins pvx. Ces résultats montrent que le système VbMS était efficace pour supprimer la fonction endog...

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Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

Nous présentons un protocole détaillé pour le système de silençage microARN (VbMS) à base du virus X de la pomme de terre (PVX) pour caractériser fonctionnellement les microARN endogènes (miARN) dans la pomme de terre. Les molécules d’imitation cible (TM) de miARN d’intérêt sont intégrées dans le vecteur PVX et exprimées transitoirement dans la pomme de terre pour faire taire la famille de miARN ou miARN cible.

MicroARN À base de virus de la pomme de terre X Silençage (VbMS) dans la pomme de terre.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

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Research

JoVE Journal

Environment

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

3.0K vues.  Texas A&M University System. Nous présentons un protocole détaillé pour le système de silençage microARN (VbMS) à base du virus X de la pomme de terre (PVX) pour caractériser fonctionnellement les microARN endogènes (miARN) dans la pomme de terre. Les molécules d’imitation cible (TM) de miARN d’intérêt sont intégrées dans le vecteur PVX et exprimées transitoirement dans la pomme de terre pour faire taire la famille de miARN ou miARN cible.

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Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Optimiser les réglages des gaz de combustion pour la promotion de la croissance des microalgues en photobioréacteurs via des simulations informatiques

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Recherche

Environnement

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

Méthode EPA 1615. Mesure de entérovirus et Norovirus présence dans l&#39;eau par Culture et RT-qPCR. I. Prélèvement des échantillons de virus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus Présence dans l&#39;eau par la culture et de RT-qPCR. II. Total des cultivable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus présence dans l&#39;eau par la culture et RT-qPCR. Partie III. Détection de virus par RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

Un Flexible Low Cost système hydroponique, évaluer les réactions des plantes à petites molécules dans des Conditions stériles

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Détection de Tilapia lac Virus à l’aide de RT-PCR classique et SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation des pommes de terre et de l’activité du promoteur d’un gène de subérine par GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

Des essais de feuilles détachées pour simplifier les études sur l'expression génique de la pomme de terre pendant l'infestation par l'insecte à mâcher Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Estimation de l'indice de la zone des feuilles à l'aide de trois méthodes distinctes dans les peuplements à feuilles caduques pures

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&ndash;Environment Interactions

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating a knowledge gap. To meet the challenge of improving crops to feed the growing global population, this gap must be bridged.
Physiological traits are considered key functional traits in the context of responsiveness or sensitivity to environmental conditions. Many recently introduced high-throughput (HTP) phenotyping techniques are based on remote sensing or imaging and are capable of directly measuring morphological traits, but measure physiological parameters mainly indirectly.
This paper describes a method for direct physiological phenotyping that has several advantages for the functional phenotyping of plant&#8211;environment interactions. It helps users overcome the many challenges encountered in the use of load-cell gravimetric systems and pot experiments. The suggested techniques will enable users to distinguish between soil weight, plant weight and soil water content, providing a method for the continuous and simultaneous measurement of dynamic soil, plant and atmosphere conditions, alongside the measurement of key physiological traits. This method allows researchers to closely mimic field stress scenarios while taking into consideration the environment&#8217;s effects on the plants&#8217; physiology. This method also minimizes pot effects, which are one of the major problems in pre-field phenotyping. It includes a feed-back fertigation system that enables a truly randomized experimental design at a field-like plant density. This system detects the soil-water-content limiting threshold (&#952;) and allows for the translation of data into knowledge through the use of a real-time analytic tool and an online statistical resource. This method for the rapid and direct measurement of the physiological responses of multiple plants to a dynamic environment has great potential for use in screening for beneficial traits associated with responses to abiotic stress, in the context of pre-field breeding and crop improvement.

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&#8211;Environment Interactions

This high-throughput, telemetric, whole-plant water relations gravimetric phenotyping method enables direct and simultaneous real-time measurements, as well as the analysis of multiple yield-related physiological traits involved in dynamic plant&#8211;environment interactions.

Une plate-forme télémétrique et gravimétrique pour le phénotypage physiologique en temps réel des interactions plante-environnement

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating ...