Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé Grant GM086822. Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Alec Pakhomov &amp; Paul Wallace (Univ. de l&#39;installation de Washington utilisateur nanotechnologie (NTUF)) et Andrea Slade (Bruker AXS) pour leur assistance technique d&#39;experts. L&#39;ADN a été effectué l&#39;imagerie AFM à l&#39;Univ. de Washington NTUF, un membre du Réseau National Nanotechnology Infrastructure. Le plasmide 2xGal4-2xGRE-luciferease a été aimablement fourni par le laboratoire du Dr Keith Yamamoto (Univ. de Californie, San Francisco).

1. Préparation des échantillons d&#39;ADN et de protéines à imager exempt de contaminants <ol><li> Isoler des biomolécules à imager et le placer dans un tampon aqueux adéquat. Protéines à imager peut être purifié en utilisant la chromatographie liquide 6, immunoadsorption suivie par l&#39;élimination des anticorps et des granulés 1,2, ou la purification Profinity exact et 7 tag retrait (figure 2A). Isoler les molécules d&#39;ADN à imager par purification miniprep (figure 2B). </li><li> Confirmer la composition et la pureté des échantillons de protéines pour être imagées par SDS-PAGE et Western blot. Pour l&#39;ADN, de confirmer la séquence et la pureté en remplissant une restriction et de digérer l&#39;électrophorèse sur gel d&#39;agarose. </li><li> Incuber les échantillons dans un tampon d&#39;adsorption AFM pour promouvoir l&#39;adhésion de l&#39;échantillon à mica. Pour les échantillons de protéines, 10 mM de tampon HEPES peuvent être utilisés. D&#39;autres sels de faible force ionique ou des cofacteurs d&#39;autres peuvent être ajoutés aussi bien. Pour des échantillons d&#39;ADN, notamment un cation divalent (par exemple Mg 2 + ou Ni 2 +) de promouvoir l&#39;adsorption sur le substrat de mica. Une Mg 2 + adaptée tampon contenant de l&#39;ADN est de 10 mM Tris, pH 7,5, NaCl 10 mM, MgCl2 2 mM 3. Une alternative Ni 2 + est de tampon HEPES 10 mM, pH 6,8, 10 mM de NiCl 2. </li><li> Diluer l&#39;échantillon à une concentration de 5 ug / ml dans le tampon d&#39;adsorption. Mélanger délicatement. Store sur la glace tandis que le microscope est en cours de préparation. </li></ol> 2. Montage de sonde AFM <ol><li> Placez le porte-cellule liquide sonde sur la station d&#39;accueil en porte à faux d&#39;installation correspondant. </li><li> Repérez la longue, épaisse en porte à faux (appelé cantilever &#39;B&#39;) du levier de nitrure de Sharp (SNL) sonde d&#39;être utilisés pour l&#39;imagerie. Soigneusement transfert au titulaire de la sonde cellule liquide, en s&#39;assurant que la pointe reste debout. Note technique: Un soin extrême doit être payé alors que la sonde est en transit, car il tomber de n&#39;importe quelle hauteur peut endommager ou détruire le cantilever ou à l&#39;extrémité. Un microlever SNL (MSNL) sonde peut être utilisée comme une alternative à la sonde de SNL. </li><li> Retirez le support de sonde à partir de la station d&#39;accueil et d&#39;examiner le cantilever sous un microscope à lumière pour s&#39;assurer qu&#39;il est intact et correctement dans le porte-sonde cellule liquide. </li><li> Retirez délicatement la tête AFM de l&#39;assemblage en queue d&#39;aronde instrument en serrant la vis à tête moletée pince. Note technique: Un soin extrême doit être payé tout en manipulant la tête AFM, comme il chutant de même sur une courte distance (par exemple si elle n&#39;est pas correctement installé dans l&#39;assemblage en queue d&#39;aronde) peut causer des dommages importants. </li><li> Inverser la tête de l&#39;AFM et poussez fermement le porte cellule liquide sonde sur les quatre broches à la base de la tête de l&#39;AFM. Soigneusement retourner la tête AFM dans l&#39;assemblage en queue d&#39;aronde instrument. Desserrer la vis moletée pince pour fixer la tête AFM dans l&#39;instrument. </li></ol> 3. Localisation de la pointe en porte à faux, en alignant au laser, et en ajustant photodétecteur <ol><li> Utilisation du logiciel de l&#39;instrument AFM, localiser l&#39;extrémité en porte à faux en déplaçant les boutons du microscope optique à bord. Régler l&#39;éclairage du microscope si nécessaire pour améliorer l&#39;identification pointe. Apportez la fin de la pointe en porte à faux dans la proximité de la ligne de mire affichée sur le logiciel de l&#39;instrument. </li><li> Apportez la pointe en porte à faux en lumière en ajustant les flèches haut et bas du contrôleur optique sur le logiciel. Utilisez lente (S) ou moyen (M) tout en ajustant la vitesse de l&#39;optique. </li><li> Aligner le laser à la pointe en porte à faux en utilisant les boutons de réglage laser. Déplacer les boutons de réglage jusqu&#39;à ce que le point rouge laser est à l&#39;intérieur du spot éclairage blanc. Trace le long du bras cantilever, avec un zig-zag jusqu&#39;au laser est positionné sur la pointe cantilever. Lorsqu&#39;il est correctement aligné, un endroit de réflexion forte apparaîtra dans la fenêtre avant de la tête de l&#39;AFM. </li><li> Centre du photodétecteur en ajustant les boutons photodétecteur sur la tête de l&#39;AFM. Ce sera d&#39;aligner le point laser dans le collimateur de l&#39;affichage photodétecteur du logiciel de l&#39;instrument. La somme du signal observée devrait être d&#39;environ 4-6. </li></ol> 4. Positionnement AFM tête et en porte à faux tuning <ol><li> Placez une feuille de mica fraîchement clivé attaché à un disque métallique spécimen de l&#39;AFM sur le porte-échantillon magnétisé au sommet de la plaque de support de l&#39;AFM. Cette configuration sera utilisée pour positionner la tête de l&#39;AFM avant d&#39;imagerie de l&#39;échantillon ADN ou de protéines préparés à l&#39;étape 1. <ol><li> Note technique: Le porte-échantillon aimanté et support de sonde de liquide de cellules sont plus épaisses que d&#39;autres échantillons de fixation des mécanismes et des détenteurs de la sonde. S&#39;il ya actuellement un jeu insuffisant entre l&#39;ensemble porte-échantillon de mica et de la tête AFM, déplacer la tête de l&#39;AFM en sélectionnant l&#39;icône de retirer le logiciel de l&#39;instrument à plusieurs reprises. </li></ol></li><li> Tournez la plaque porte-AFM de sorte que le disque de spécimen est positionné pour l&#39;imagerie initiale. S&#39;assurer que le substrat de mica est centrée sous la tête de l&#39;AFM. </li><li> Déplacez la tête vers le bas vers l&#39;AFMsurface du disque de mica-éprouvette en utilisant le contrôle de surface se concentrer sur le logiciel de bord. Sélectionnez le moyen (M) la vitesse du moteur Z, et continuer vers la surface jusqu&#39;à ce que la tête de l&#39;AFM est d&#39;environ 2 mm au dessus du mica. À ce moment, basculer vers l&#39;utilisation de la lente (S) Z moteur à vitesse afin d&#39;éviter le contact brutal entre la sonde et la surface (appelée s&#39;écraser la pointe). </li><li> Passez à déplacer la sonde près de la surface jusqu&#39;au substrat de mica caractéristiques distinctes sur la surface de mica ou de pointe de la réflexion sont au point. Basculer entre la surface et les avions de réflexion pointe de focale en utilisant le &quot;accent sur:« l&#39;icône du logiciel de l&#39;instrument. </li><li> Sélectionnez l&#39;icône du logiciel mélodie de l&#39;instrument et régler le cantilever. La fréquence de résonance de la BN recommandées et les sondes sont en porte à faux MSNL kHz 20-60. Sélectionnez un pic de 5% de décalage. Note technique: tuning cantilever adéquat est essentiel pour l&#39;imagerie d&#39;échantillon adéquate. </li></ol> 5. Surface de l&#39;échantillon de mica Imaging <ol><li> Engager la sonde sur la surface du mica. Définir la taille du scan initial à 10 um et le taux de balayage à 1 Hz. Gain intégral et gain proportionnel peut être initialement fixé à 0,2 et 0,4, respectivement. Ajustez les gains que nécessaire afin d&#39;avoir de trace et retrace à peu près scans se chevauchent. La diminution de la consigne d&#39;amplitude va augmenter l&#39;interaction entre la sonde et le mica et s&#39;assurer de l&#39;engagement. </li><li> Capture d&#39;images scan complet du champ 10 um. Diminuer la taille du scanner à 5, 1 et 0,5 um et de capturer des images complètes de chaque champ. Ajustez les gains et les taux de balayage nécessaire. Capturer des images de la surface du mica fournit une base de comparaison à l&#39;ADN et des protéines contenant des échantillons. </li><li> Dégagez la sonde avec un simple clic sur l&#39;icône se désengager sur le logiciel de bord. </li></ol> 6. Biomolécules d&#39;intérêt Imaging <ol><li> Mélanger délicatement l&#39;ADN ou des protéines de l&#39;échantillon préparé à l&#39;étape 1 et de préparer pour la charger sur la surface du mica imager. Mélanger 5 pl de l&#39;échantillon préparé avec 45 ul d&#39;adsorption tampon frais (concentration finale de l&#39;échantillon = 0,5 pg / ml). </li><li> Soigneusement ajouter 50 ul de l&#39;0,5 mg / ml solution contenant des biomolécules directement sur la surface du mica. Pour ce faire, sans bouger la sonde ou la tête AFM, et garantir la solution de l&#39;échantillon (mais pas de pipette) est en contact avec la sonde. </li><li> Pause 5 minutes pour permettre à des biomolécules dans l&#39;échantillon d&#39;adhérer à la surface du mica. </li><li> A l&#39;issue de 5 minutes, une pipette supplémentaires 50-100 ul de tampon d&#39;adsorption dans le support de sonde cellule liquide en faisant attention de ne pas toucher la sonde, la tête AFM, ou du mica avec la pipette. Cela formera un ménisque et de permettre l&#39;AFM en mode d&#39;imagerie tapant dans le liquide. La figure 3 montre l&#39;arrangement final de la cellule fluide, cantilever, des échantillons, porte-échantillon, et le ménisque. </li><li> Réajuster le photodétecteur et réaligner le laser pour le cantilever, si nécessaire. Note technique: la visualisation de l&#39;extrémité de la sonde et l&#39;alignement au laser est compliquée en raison de la diffraction causée par l&#39;ajout de tampon d&#39;échantillon dans le porte-sonde. Manuellement réaccorder l&#39;encorbellement, si nécessaire. </li><li> Réengager la sonde en utilisant le logiciel de l&#39;instrument. Réglez la déviation verticale, gain intégral, et le gain proportionnel, si nécessaire. Ceci lancera le processus de re-imagerie de la section de mica numérisés précédant immédiatement l&#39;échantillon d&#39;ajouter et de capturer des images. </li><li> Augmenter la taille de balayage (500 nm-10 um) pour identifier les régions d&#39;intérêt. Zoom-in et de réduire les taux de balayage à 0,5 Hz afin d&#39;améliorer la résolution d&#39;image </li><li> Une fois que l&#39;imagerie est terminée, la sonde se désengager en sélectionnant l&#39;icône de retirer le logiciel de l&#39;instrument à plusieurs reprises. Assurer un dégagement suffisant entre la tête de l&#39;AFM et le disque éprouvette avant le démontage de la cellule de liquide ou de platine. </li><li> Bien rincer le porte-cellule liquide sonde et le disque échantillon avec de l&#39;eau distillée pour éviter la formation de cristaux de sel que résiduelle s&#39;évapore tampon d&#39;adsorption. Sec à l&#39;air comprimé. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Exemples d&#39;images AFM sont présentées dans la figure 4. Substrat de mica (A) fournit une surface plane sur laquelle moléculairement ADN et les protéines peuvent adsorber. Imagerie de mica avant échantillons de biomolécules fournit un contrôle négatif et évaluation du bruit d&#39;imagerie. Il fournit également un niveau d&#39;assurance que le cantilever est bien réglé et l&#39;imagerie de l&#39;échantillon ultérieures seront couronnés de succès. Double brin d&#39;ADN plasmidique (B, D), par présomption superenroulé, est facilement identifiable par son aspect asymétrique et uniformes déposer sur le substrat de mica précédemment banale. Complexes protéiques de tailles de particules discrètes (C, E) sont aussi particulièrement distingués dans le substrat de mica. La taille des particules différences indiquent une hétérogénéité de l&#39;échantillon, et peut être utile de rapprocher stoechiométrie complexe protéique ou d&#39;une activité biochimique. La forme générale de diagonale et d&#39;orientation cohérente de la ProTEIN particules observées dans le Panneau de C est un artefact d&#39;imagerie, comme les protéines serait expectedly être orientée sur le substrat de mica de façon aléatoire. Les causes possibles de l&#39;artefact observée est une anomalie ou physiques pointe de l&#39;imagerie AFM à une trop rapide d&#39;une fréquence de balayage. Bien convolution de la pointe (illustré à la figure 1B) empêche absolue des calculs de mesure de longueur dans les axes x et y, mesure de la hauteur (axe Z) et x relative et les mesures y peut néanmoins être utile pour estimer les propriétés biophysiques des biomolécules imagée. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1: Représentation schématique du mode de microscopie à force tapant atomique (AFM). A, le microscope. A la fin du cantilever est une pointe acérée qui oscille de haut en bas comme il scanne la surface d&#39;un substrat de mica à laquelle biomoléculaire complexes adsorber. Comme le scanner se déplace dans les directions X et Y, un faisceau laser est réfléchi par l&#39;arrière du cantilever sur une position sensible à photodiode à cartographier la verticale (z) la distance de la pointe se déplace comme il passe sur les complexes biomoléculaires assis sur le mica. Distorsion B. de l&#39;image dans les directions x et y causée par convolution de la pointe. Le rayon nominal d&#39;une pointe de nitrure de silicium conventionnelles est plus grand que les particules à imager, et le bord de la pointe de contacts de l&#39;échantillon comme il traverse la surface. Résultats de convolution de la pointe dans les particules imagées apparaissant dans les grandes directions X et Y, mais pas la direction z. Cet effet peut être minimisé par l&#39;utilisation de pointes avec un rayon de pointe nominal inférieur. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2: Illustration de la protéine immunoadsorbed et préparation des échantillons d&#39;ADN. Un communiqué de GR immunoadsorbed • complexes protéine Hsp70 de l&#39;anticorps monoclonal (mAb)-protéine A-Sepharose (PAS) de granules. L&#39;incubation de la immunopellet avec un peptide contenant l&#39;épitope MAB faciliter la libération de la GR complexes protéine Hsp70 • à partir du culot, permettant au complexe pour être collectées à partir du surnageant et visualisée par l&#39;AFM. B, Préparation de l&#39;ADN pour l&#39;imagerie AFM nécessite l&#39;utilisation d&#39;un tampon d&#39;adsorption cations divalents. Le cation divalent augmente l&#39;affinité de l&#39;ADN pour le substrat de mica. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3: Disposition finale de la tête de l&#39;AFM, le liquide cellulaire porte-sonde, échantillon, porte-échantillon, et le ménisque tampon. Un soin, doivent être prises au moment du dépôt de l&#39;échantillon et de tampon supplémentaire sur le substrat de mica pour éviter tout contact physique entre l&#39;embout de la pipette et la tête AFM, appelez liquide, et le substrat de mica. B, agrandissement de A. Le ménisque tampon s&#39;étend de la platine au titulaire de sonde cellule liquide. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4: Micrographies à force atomique d&#39;un substrat de mica (A), 2xGal4-2xGRE-luciferease ADN plasmidique 8 (B, D), et GR • Les complexes protéine Hsp70 (C, E) dans une solution tamponnée. Mica sert comme une image de contrôle à comparer avec les visualisations de l&#39;ADN et de protéines. GR complexes • protéine Hsp70 ont été préparés par immunoadsorption du GR amorcée avec hsp70, puis libérés à partir du culot d&#39;anticorps-billes à l&#39;aide d&#39;un anticorps monoclonal concurrentes (illustré à la figure 2A). L&#39;ADN a été préparé par miniprep plasmide conventionnel. Panneaux A, B et C sont d&#39;un grossissement équivalent (barres d&#39;échelle = 200 nm), comme des panneaux D et E (barres d&#39;échelle = 40 nm).

<ol>
	<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&#149;hsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft.">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&#149;hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J Biol Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li><li>Harrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+glucocorticoid+receptor+transport+on+microtubules+by+dynein.">Evidence for glucocorticoid receptor transport on microtubules by dynein.</a> J Biol Chem. 279, 54647-54654 (2004).</li><li>Pastre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+mica+mediated+by+divalent+counterions:+a+theoretical+and+experimental+study.">Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study.</a> Biophys J. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>Guthold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+one-dimensional+diffusion+and+transcription+by+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">Direct observation of one-dimensional diffusion and transcription by Escherichia coli RNA polymerase.</a> Biophys J. 77, 2284-2294 (1999).</li><li>Petrucco, S., Volpi, G., Bolchi, A., Rivetti, C., Ottonello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nick-sensing+DNA+3'-repair+enzyme+from+Arabidopsis.">A nick-sensing DNA 3'-repair enzyme from Arabidopsis.</a> J Biol Chem. 277, 23675-23683 (2002).</li><li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation/deacetylation+of+the+chaperone.">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J Biol Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li><li>Ruan, B., Fisher, K. E., Alexander, P. A., Doroshko, V., Bryan, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+subtilisin+into+a+fluoride-triggered+processing+protease+useful+for+one-step+protein+purification.">Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification.</a> Biochemistry. 43, 14539-14546 (2004).</li><li>Meijsing, S. H., Elbi, C., Luecke, H. F., Hager, G. L., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ligand+binding+domain+controls+glucocorticoid+receptor+dynamics+independent+of+ligand+release.">The ligand binding domain controls glucocorticoid receptor dynamics independent of ligand release.</a> Mol Cell Biol. 27, 2442-2451 (2007).</li><li>Shen, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+sample+preparation+method+for+atomic+force+microscopy+visualization+of+individual+DNA+molecules+in+situ.">A simple and effective sample preparation method for atomic force microscopy visualization of individual DNA molecules in situ.</a> Mol Biol Rep. 38, 965-969 (2010).</li><li>Paulite, M., Fakhraai, Z., Akhremitchev, B. B., Mueller, K., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+tuning+and+use+of+an+apertureless+near+field+infrared+microscope+for+protein+imaging.">Assembly, tuning and use of an apertureless near field infrared microscope for protein imaging.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+effects+of+matrix+stiffness+on+cellular+function+using+acrylamide-based+hydrogels.">Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Brunger, A. T., Weninger, K., Bowen, M., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+the+neuronal+SNARE+fusion+machinery.">Single-molecule studies of the neuronal SNARE fusion machinery.</a> Annu Rev Biochem. 78, 903-928 (2009).</li></ol>

AFM offre une technique unique microscopiques capables d&#39;imagerie individuelles biomolécules non couchés en solution aqueuse et quasi-physiologiques des solutions tamponnées en temps réel. Cela permet la visualisation des protéines et des molécules individuels d&#39;ADN, ainsi que des complexes multiprotéiques et de complexes protéine-ADN. Particules macromoléculaires Imaging avec l&#39;AFM peut être utile pour évaluer l&#39;homogénéité des échantillons et d&#39;identifier la disposition physique des éléments constitutifs des particules observées. Cette approche de l&#39;observation des particules macromoléculaires individu peut être un complément utile aux techniques biochimiques classiques, tels que des essais d&#39;immunoprécipitation, électrophorèse sur gel de polyacrylamide, et chromatographie sur colonne d&#39;exclusion de taille, qui fournissent d&#39;importantes données sommatives représentant les 3 10 -10 11 complexes biomoléculaires individuelle d&#39;intérêts présents dans un échantillon. La recherche sur stoechiométrie multiprotéiques complexes, les interactions biomoléculaires, et les exigences de cofacteur peuvent tous être étudiés à l&#39;aide de l&#39;AFM. La méthode présentée ici peut être adapté pour accueillir des questions spécifiques d&#39;intérêt biophysiques. Par exemple, en utilisant un porte-cellule liquide sonde capable d&#39;échanger des tampons, il est possible d&#39;exigences cofacteur de dosage pour la formation des protéines complexes. ADN-protéines assemblées peut être formé et dissocié en quasi-temps réel et même en étant imagé. L&#39;ADN peut être généré avec des séquences spécifiques d&#39;intérêt (par exemple un des éléments de réponse ou présumée séquence de la protéine nouvelle liaison), mélangé avec la protéine liant l&#39;hypothèse, et imagé de fournir des preuves directes des interactions intermoléculaires. Tapping AFM en mode d&#39;imagerie est beaucoup moins compliquée si les échantillons secs sont utilisés plutôt que des échantillons dans des solutions aqueuses, et stands d&#39;ADN linéaire et plasmides d&#39;ADN fermé cercle ont tous deux été imagé de cette manière 3,9. La méthode présentée ici utilise des échantillons dans des solutions tamponnées afin de fournir un environnement d&#39;imagerie plus physiologique. D&#39;autres méthodes d&#39;imagerie remarquable de protéines doivent également être envisagées, y compris à proximité de microscopie en champ infrarouge 10. L&#39;utilisation complémentaire de immunoadsorption de consort avec l&#39;AFM fournit une occasion de préparer une myriade de complexes protéiques, en utilisant des techniques bien établies biochimiques, puis de les visualiser après la sortie de l&#39;immunoadsorbing anticorps perles granulés. Par exemple, GR immunoadsorbed a été testé pour son association avec la protéine chaperon moléculaire hsp70 1 ainsi que la protéine dynéine moteur 2 en utilisant cette approche afin d&#39;estimer la taille et la complexité stoechiométries. La taille des particules et des caractéristiques biophysiques (rigidité, par exemple) ont été utiles pour déterminer l&#39;identité des biomolécules observé dans les échantillons AFM imagé 11,12. Il est également possible de confirmer l&#39;identité de biomolécules par l&#39;ajout d&#39;une biomolécule interagir (par exemple un ligand ou un anticorps monoclonal), qui se lient à sa cible et provoquer une augmentation de la taille des particules, si la biomolécule cible est présente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Dimension 3100 </td><td> Bruker </td><td> Dimension 3100 </td></tr><tr><td> Cellule fluide dimension </td><td> Bruker </td><td> DTFML-JJ-SE </td></tr><tr><td> Levier de nitrure de Sharp (SNL) de nitrure de silicium AFM sonde </td><td> Bruker </td><td> BN-10 </td></tr><tr><td> Microlever nitrure forte levier (MSNL) de nitrure de silicium AFM sonde </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td></tr><tr><td> Logiciel de l&#39;instrument NanoScope AFM </td><td> Bruker </td><td> 004-132-000 </td></tr><tr><td> Disques métalliques éprouvette AFM </td><td> Ted Pella </td><td> 16208 </td></tr><tr><td> Niveau V1 disques Mica, 12 mm </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td></tr></tbody></table>

visualization of recombinant dna and protein complexes using atomic force microscopy

La microscopie à force atomique (AFM) permet de visualiser des protéines individuelles, les molécules d&#39;ADN, complexes protéine-protéine et complexes ADN-protéine. Sur la fin du cantilever le microscope est une sonde à l&#39;échelle nanométrique, qui traverse des zones d&#39;image allant du nanomètre au micromètre, mesurer l&#39;élévation de macromolécules reposant sur la surface du substrat en un point donné. Les forces électrostatiques provoquer des protéines, des lipides et acides nucléiques à vaguement se fixent au substrat dans des orientations aléatoires et permettent d&#39;imagerie. Les données générées ressembler à une carte topographique, où les macromolécules régler en trois dimensions des particules de tailles discrètes (Figure 1) 1,2. Exploiter le mode AFM implique l&#39;oscillation répétée du cantilever, qui permet l&#39;imagerie de biomatériaux relativement mous tels que l&#39;ADN et des protéines. Un des avantages notables de l&#39;AFM sur les autres techniques de microscopie nanométrique est son adaptabilité par rapport à visualiser des protéines individuelles et des complexes macromoléculaires dans des tampons aqueux, y compris la quasi physiologique conditions tamponnées, en temps réel, et sans coloration ou un revêtement de l&#39;échantillon à imager. La méthode présentée ici décrit l&#39;imagerie de l&#39;ADN et un facteur de transcription immunoadsorbed (c&#39;est à dire le récepteur des glucocorticoïdes, GR) en solution tamponnée (figure 2). Protéines et des complexes protéiques Immunoadsorbed peut être séparée de la immunoadsorbing anticorps perles pastilles par la concurrence avec l&#39;épitope d&#39;anticorps et ensuite imagé (figure 2A). Cela permet une manipulation biochimique des biomolécules d&#39;intérêt avant d&#39;imagerie. Une fois purifié, l&#39;ADN et les protéines peuvent être mélangés et le complexe de l&#39;interaction qui en résulte peut être imagée ainsi. La liaison de l&#39;ADN pour le mica exige un cation divalent 3, tel que Ni 2 + ou Mg 2 +, qui peuvent être ajoutés aux tampons d&#39;échantillon tout en maintenant l&#39;activité des protéines. En utilisant une approche similaire, l&#39;AFM a été utilisée pour visualiser les différentes enzymes, dont l&#39;ARN polymérase 4 et 5 une enzyme de réparation, lié à des brins d&#39;ADN individuelles. Ces expériences fournissent un aperçu significatif de la protéine-protéine et ADN-protéines interactions biophysiques ayant lieu au niveau moléculaire. Particules macromoléculaires Imaging individuels avec l&#39;AFM peut être utile pour déterminer l&#39;homogénéité des particules et pour identifier la disposition physique des éléments constitutifs des particules imagée. Bien que la méthode actuelle a été développée pour la visualisation des complexes de protéines chaperonnes GR-brins 1,2 et d&#39;ADN à laquelle le GR peuvent se lier, il peut être largement appliquée à l&#39;ADN et des échantillons de protéines d&#39;imagerie à partir de diverses sources.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Un mode tapping microscope à force atomique (AFM) Méthode pour la visualisation de l&#39;ADN plasmidique, protéines cytoplasmiques et complexes ADN-protéine est décrite. La méthode comprend d&#39;autres approches pour la préparation d&#39;échantillons pour l&#39;imagerie AFM après manipulation biochimique. Spécifiques d&#39;ADN contenant les régions interacting protein sont observées dans des conditions quasi-tampon physiologique.

Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

visualization-recombinant-dna-protein-complexes-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.3K vues.  Seattle University. Un mode tapping microscope à force atomique (AFM) Méthode pour la visualisation de l'ADN plasmidique, protéines cytoplasmiques et complexes ADN-protéine est décrite. La méthode comprend d'autres approches pour la préparation d'échantillons pour l'imagerie AFM après manipulation biochimique. Spécifiques d'ADN contenant les régions interacting protein sont observées dans des conditions quasi-tampon physiologique.

Vidéo: Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilisation bactérienne pour l&#39;imagerie par microscopie à force atomique

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Recherche

Bio-ingénierie

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l&#39;aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Surface de mesure potentielle de bactéries utilisant Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour l&#39;isolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Visualisation de Germinosomes et de la Membrane interne dans les Spores de Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Application de la microscopie de force atomique pour détecter l’arthrose précoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automatisation des mesures de microscope à force bioatomique sur des centaines de cellules de C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...