Les auteurs tiennent à remercier Emilie Mairey et Emmanuel Donnadieu pour le réglage initial de la procédure.

1. Cellule hôte de l&#39;homme et de la culture bactérienne <ol><li> HUVEC culture entre le passage 1 et 9 à 37 ° dans un incubateur humidifié avec 5% (v / v) de CO 2. Passage des cellules quand ils s&#39;approcheront 80% de confluence avec la trypsine / EDTA à fournir des cultures de maintenance sur 75 flacons cm 2 de culture et de cultures expérimentales en chambres d&#39;écoulement jetables (μ-Slides VI). </li><li> Retirer moyenne des flacons pour être repiquées, laver les cellules avec 10 ml de PBS, de retirer et le remplacer par 1,5 ml de trypsine / EDTA. Permettre aux cellules de se détacher dans un incubateur de culture cellulaire pendant 5 minutes à 37 ° C. </li><li> Recueillir les cellules avec 10 ml de milieu de culture cellulaire dans un tube de 15 ml de collecte. Pellet les cellules avec une centrifugation de 5 minutes (à 200 g), à température ambiante. Suspendre les cellules dans 4 ml d&#39;Endo-GDF complété avec 10% (v / v) de FBS et les compter sur une chambre de Malassez, conformément aux instructions du fabricant. </li><li> Présentez-30 ul d&#39;un 1x10 6 cellules HUVEC par ml de suspension dans le canal (3x10 4 au total) et permettent aux cellules d&#39;adhérer pendant 3 heures à 37 ° dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% (v / v) de CO 2. Ajouter un volume supplémentaire de 120 pl d&#39;Endo-GDF pour remplir les puits. Les cellules doivent former une monocouche subconfluentes (figure 2). </li><li> Cultivez N. meningitidis exprimant la GFP (dans ce cas souche 8013 GFP exprimé sous le contrôle d&#39;un promoteur inductible par l&#39;IPTG), sur gélose GCB contenant des suppléments de Kellogg et 5 ug / ml de chloramphénicol à 37 ° C dans une atmosphère humide contenant 5% (v / v) de CO 2 pendant 16 heures. </li></ol> 2. Adhérence initiale de bactéries individuelles à des cellules hôtes <ol><li> Ajuster la concentration de bactéries cultivées sur gélose GCB à une DO600 de 0,05 avec préchauffé Endo-GDF, contenant 10% (v / v) de FBS et incuber pendant 120 minutes à 37 ° C dans une atmosphère humide contenant 5% (v / v) de CO 2, sous agitation douce (130 rpm). Induire l&#39;expression de la GFP en ajoutant 1 mM d&#39;IPTG dans le milieu de culture pour la période d&#39;incubation. </li><li> Placez le jetables μ-Slide sur la scène d&#39;un microscope inversé équipé d&#39;une plateforme chauffé pour maintenir la température de l&#39;échantillon à 37 ° C. </li><li> Verser préchauffé Endo-GDF supplémenté avec 2% (v / v) de FBS dans un bécher de verre stérile et de remplir une seringue stérile de 50 ml avec ce médium. Fixez le &quot;entrée&quot; tube à la seringue et remplir par l&#39;introduction à moyen terme. </li><li> Connectez le &quot;entrée&quot; tuyau à la μ-Slide, avec soin, afin d&#39;éviter l&#39;introduction d&#39;air dans la chambre. Puis, apposer la «sortie» du tube à l&#39;autre extrémité et remplissez soigneusement le canal de moyenne à environ 1 cm de distance de la chambre de «sortie». </li><li> Mesurer la DO600 bactérienne et d&#39;ajuster à 0,15 en Endo-GDF contenant 2% (v / v) de FBS. Afin de regarder les bactéries individuelles, les agrégats doivent être perturbée par des vortex vigoureux de l&#39;échantillon bactérien. </li><li> Placer 100 pi d&#39;Endo-GDF supplémenté avec 2% (v / v) de FBS milieu dans le réservoir et ajouter 100 ml de la solution bactérienne prises depuis le sommet de la solution de vortex d&#39;éviter de prélever des autres agrégats bactériens. </li><li> Soigneusement introduire le volume de 200 ul dans le μ-Slide en tournant le robinet d&#39;injecter des bactéries dans la chambre. </li><li> Présentez-Endo-GDF contenant 2% (v / v) de FBS, maintenue à 37 ° C avec la plate-forme chauffée, dans la chambre à l&#39;aide d&#39;une seringue avec une contrainte de cisaillement compatible avec l&#39;adhésion de 0,044 dynes / cm 2 pendant 15 minutes. </li></ol> Voir par exemple la vidéo 1 ou la figure 3. Après cette étape, soit de déplacer des articles 3, 4 ou 6. 3. Quantification de l&#39;adhésion initiale des bactéries aux cellules hôtes individuels <ol><li> Après l&#39;adhésion initiale pendant 15 minutes, d&#39;acquérir des images de dix champs au hasard tandis que le liquide est toujours en circulation. </li><li> Analyser les images acquises en utilisant le logiciel ImageJ 8, afin d&#39;accéder au nombre moyen de bactéries adherant par champ. Cela se fait comme suit: tout d&#39;abord, chaque image est seuillée en utilisant le «seuil» dans la fenêtre de trouver menu &quot;Image&quot; pour mettre en évidence individuels adhérant bactéries fluorescentes, tout en minimisant le fond des cellules. Ensuite, chaque bactérie unique est compté, en utilisant le Plug-In &quot;Contre Cell&quot; ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). Les données pour chaque image sont rapportés dans un tableur Excel et sont en moyenne de quantifier le nombre moyen de bactéries adhérentes par champ. </li></ol> 4. Mesure de la résistance à l&#39;écoulement des bactéries individuelles adhérentes à cellules de l&#39;hôte <ol><li> Programme de la pompe seringue mise en place pour générer des contraintes de cisaillement variant de 3 à 100 dynes / cm 2 pendant 5 minutes. </li><li> A la fin des 5 minutes, l&#39;acquisition de dix champs choisis au hasard, comme décrit dans l&#39;étape 3.1, mais avec l&#39;écoulement arrêté prIOR à l&#39;acquisition. </li><li> Analyser les images acquises comme décrit dans l&#39;étape 3.2 et de quantifier le nombre moyen de bactéries restantes par champ. </li></ol> 5. Mesurer la croissance d&#39;une bactérie isolée adhérente à une micro- <ol><li> Présentez-Endo-GDF, contenant 10% (v / v) de FBS, maintenue à 37 ° C avec la plate-forme chauffée, dans la chambre à l&#39;aide d&#39;une seringue avec le stress de cisaillement choisie pour plusieurs heures. Enregistrement des images pour la microscopie vidéo en temps réel à une image toutes les 5 minutes. </li><li> Suite à la microscopie vidéo, arrêtez la contrainte de cisaillement en désactivant la pompe seringue, d&#39;acquérir des images supplémentaires 2-3 puis arrêter la séquence d&#39;acquisition d&#39;image sur le logiciel. Un exemple de la prolifération bactérienne peut être vu sur la vidéo 2. </li></ol> 6. Mesure de la résistance à l&#39;écoulement des microcolonies bactériennes adhérente <ol><li> Après la formation de microcolonies grande à la surface cellulaire (step5.2) acquérir 2-3 images des deux cellules (par contraste de phase) et des bactéries (par la GFP-fluorescence) avant l&#39;application de flux. Pour le reste de l&#39;expérience, le protocole d&#39;acquisition sera de surveiller que la fluorescence. </li><li> Application des contraintes de cisaillement élevées pendant 5 minutes (300-100 dynes / cm 2) et d&#39;enregistrer des images à une image toutes les 5 secondes. </li><li> Arrêtez la contrainte de cisaillement en désactivant la pompe seringue, d&#39;acquérir des images supplémentaires 2-3 puis arrêter la séquence d&#39;acquisition d&#39;image sur le logiciel. </li><li> Ensuite, retirez la &quot;sortie&quot; première tubulure et soigneusement, pour éviter de vider le canal, puis ajoutez préchauffé milieu frais pour remplir les puits avant d&#39;enlever le &quot;entrée&quot; tubes. </li><li> Pour déterminer quantitativement l&#39;effet de la contrainte de cisaillement sur la résistance bactérienne, un dosage de plaquage peut être effectuée comme suit: recueillir le milieu restant et laver les μ-Slide deux fois avec 120 pl de PBS, qui enlève le milieu restant du canal (deux lavages sont ) a également recueilli. </li><li> Détacher les cellules infectées par l&#39;ajout de 50 pi de trypsine / EDTA pendant 5 minutes à 37 ° et mélanger cet échantillon indépendante avec la suspension recueillis à l&#39;étape précédente. </li><li> Effectuer des dilutions en série dans du PBS et la plaque une fraction de 10 ul sur des plaques de gélose GCB, en trois exemplaires, afin de déterminer le nombre d&#39;unités formant colonies (UFC), le jour suivant, après l&#39;incubation des plaques à 37 ° C dans un incubateur à 5% (v / v) de CO 2. </li></ol> Vidéos 3 et 4 comparer la souche de type sauvage avec le mutant pilV. 7. Décollement de microcolonies bactériennes <ol><li> Infecter les cellules dans la chambre d&#39;écoulement en répétant les étapes 2.1 à 2.8 et permettent l&#39;infection se poursuivre pendant 30 minutes. </li><li> Retirer bactéries non en augmentant le flux à 10 dynes / cm 2 pour une période de 2 minutes et laisser l&#39;infection se poursuivre pendant 2h. </li><li> Réduire le débit à 0,15 dynes / cm 2. </li><li> Chaque heure, de recueillir une goutte de milieu sortant de la chambre d&#39;écoulement. </li><li> Effectuer des dilutions en série des échantillons et leur plaque sur gélose GCB. </li><li> Déterminer le nombre d&#39;unités formant colonies (UFC), le jour suivant, après l&#39;incubation des plaques à 37 ° C dans un incubateur à 5% (v / v) de CO 2. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" /> Figure 1: Différentes étapes d&#39;une monocouche cellulaire qui peuvent être observés et mesurés en présence de l&#39;écoulement dans la procédure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" /> Figure 2: monocouche de cellules endothéliales dans la chambre de circulation au début d&#39;une expérience (absence de cisaillement). Environ 50 cellules endothéliales sont organisés en une monocouche sous-confluente. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" /> Figure 3: représentation graphique de l&#39;adhésion initiale des bactéries à la surface cellulaire. Les valeurs des trois champs sont indiqués pour donner une idée de la variation de champ à champ qui est prévu (0044 dynes / cm 2). Vidéo 1. Visualisation de l&#39;adhésion initiale des bactéries sur la monocouche cellulaire en fonction du temps (0044 dynes / cm 2). Exprimant la GFP bactéries sont en suivant la direction du milieu coule. Le film est accéléré de 60 fois, la durée réelle de la vidéo est de 10 minutes. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a> Vidéo 2. Après l&#39;adhésion initiale des bactéries ont été autorisés à proliférer à la surface cellulaire pour une période de 7 heures (accélérée 1000 fois). <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a> Vidéo 3. Après la prolifération à la surface cellulaire le mécanicienRésistance al de microcolonies a été testé en augmentant le niveau de stress de cisaillement à 10 dynes / cm 2 pendant 5 minutes, mais microcolonies de type sauvage sont résistants accélération de 60 fois. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a> Microcolonies vidéo 4. Formé par le mutant pilV sont perturbés par augmenter le flux (10 dynes / cm 2). Ce mutant ne parvient pas à induire le remodelage de la membrane plasmique en microcolonies et est donc plus très sensibles à la contrainte de cisaillement augmente (la vidéo est accélérée 60 fois) 5. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a>

<ol>
	<li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier.">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Vascular+Beds.">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li><li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow.">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li><li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress.">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li><li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination.">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li><li>Soyer, M., Dum&#237;nil, G., Christodoulides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+under+shear+stress.">Bacterial adhesion under shear stress.</a> Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). , (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force.">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li><li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li><li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae.">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

L&#39;importance de la contrainte de cisaillement et généralement des aspects mécaniques de la biologie est de plus en plus reconnu. Par exemple, les propriétés hautement adaptées adhésif de la famille des sélectines de protéines dans le processus d&#39;adhésion des lymphocytes et roulant sur la paroi vasculaire a été reconnu par l&#39;introduction de la contrainte de cisaillement dans le processus. La procédure décrite ci-dessus a été appliquée à l&#39;meningitidis bactéries à Gram négatif Neisseria mais devrait être applicable à un large éventail d&#39;agents pathogènes. L&#39;importance de la contrainte de cisaillement a été montré aussi pour d&#39;autres pathogènes et les sites d&#39;autres infections. Adhésion bactérienne conditionnée par la contrainte de cisaillement a été décrit par l&#39;étude de l&#39;adhésine FimH trouvé sur Escherichia coli uropathogènes (UPEC) 9. Similaire à sélectines, l&#39;interaction entre FimH et son récepteur de la cellule hôte a été montré pour être renforcée par cisaillement induite par des forces mécaniques 9 et l&#39;adhésine CFAE des E.coli entérotoxinogène a été rapporté également de servir de médiateur d&#39;adhérence aux cellules épithéliales via un cisaillement-dépendant mécanisme 10. Nous avons signalé, en utilisant le protocole flux laminaire chambre de dosage décrite dans ce chapitre que Streptococcus agalactiae pili étaient essentiels pour l&#39;adhésion de cet agent pathogène aux cellules épithéliales dans des conditions d&#39;écoulement 11. De telles études confirment que notre test de la chambre de flux est un outil utile pour enquêter sur des cellules hôtes-pathogènes dans des conditions de contrainte de cisaillement.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0.4 kit de débit </td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Seringue Plastipak 50 ml Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tygon R3603 Tubing 3.2 x 4.8mm </td><td> Fisher Scientific- </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> Robinet 3 voies, 2 Luer femelle Luer mâle </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Pompe à seringue </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Microscope inversé, Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD ou ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> Logiciel ImageJ </td><td> NIH </td><td> Freeware ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

introducing shear stress in the study of bacterial adhesion

Lors des infections bactériennes d&#39;une séquence d&#39;interactions se produisent entre le pathogène et son hôte. L&#39;adhérence des bactéries à la surface de la cellule hôte est souvent l&#39;étape initiale et la détermination de la pathogenèse. Bien que l&#39;adhérence est expérimentalement étudiée principalement dans des conditions statiques d&#39;adhérence a effectivement lieu, en présence de l&#39;écoulement liquide. Les premières rencontres entre les bactéries et leur hôte se produisent souvent au niveau des muqueuses, bouche, poumon, intestin, yeux, etc, où le mucus s&#39;écoule le long de la surface des cellules épithéliales. Plus tard dans l&#39;infection, les pathogènes occasionnellement accès à la circulation sanguine provoquant des maladies mortelles telles que la septicémie, la septicémie et la méningite. Un trait caractéristique de ces infections est la capacité de ces agents pathogènes d&#39;interagir avec les cellules endothéliales en présence de sang circulant. La présence de liquide s&#39;écoulant, de mucus ou de sang par exemple, détermine l&#39;adhésion, car elle génère une force mécanique sur le pathogène. Pour caractériser l&#39;effet de l&#39;écoulement d&#39;un liquide se réfère généralement à la notion de contrainte de cisaillement, ce qui est la force tangentielle exercée par unité de surface par un fluide en mouvement près d&#39;une paroi fixe, exprimée en dynes / cm 2. Intensités de contrainte de cisaillement varient largement selon les différents types des navires, la taille, l&#39;orgue, emplacement, etc (0-100 dynes / cm 2). Circulation dans les capillaires peut atteindre des valeurs très faibles contraintes de cisaillement et même arrêter temporairement durant les périodes allant de quelques secondes à plusieurs minutes 1. À l&#39;autre extrémité du spectre de la contrainte de cisaillement dans les artérioles peuvent atteindre 100 dynes / cm 2 2. L&#39;impact de la contrainte de cisaillement sur ​​différents processus biologiques a été clairement démontré que, par exemple lors de l&#39;interaction des leucocytes avec les 3 endothélium. Pour prendre en compte ce paramètre mécanique dans le processus d&#39;adhésion bactérienne, nous avons profité d&#39;une procédure expérimentale basée sur l&#39;utilisation d&#39;un flux jetables chambre 4. Les cellules hôtes sont cultivées dans la chambre de circulation et de bactéries fluorescentes sont introduits dans le flux contrôlé par une pompe seringue. Nous avons d&#39;abord concentré nos recherches sur le bactériennes pathogènes de Neisseria meningitidis, une bactérie Gram-négatif responsable de la septicémie et la méningite. La procédure décrite ici nous a permis d&#39;étudier l&#39;impact de la contrainte de cisaillement sur ​​la capacité des bactéries à: adhérer aux cellules 1, à proliférer à la surface cellulaire et 5 pour détacher à coloniser de nouveaux sites 6 (figure 1). Des informations techniques complémentaires peuvent être trouvés dans la référence 7. Les valeurs des contraintes de cisaillement présentées ici ont été choisis en fonction de notre expérience précédente 1 et pour représenter les valeurs trouvées dans la littérature. Le protocole devrait être applicable à une large gamme de pathogènes avec des ajustements spécifiques en fonction des objectifs de l&#39;étude.

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Pendant le processus d&#39;infection, une étape clé est l&#39;adhésion des agents pathogènes avec les cellules hôtes. Dans la plupart des cas, cette étape d&#39;adhésion a lieu en présence de contraintes mécaniques générées par l&#39;écoulement liquide. Nous décrivons une technique qui introduit la contrainte de cisaillement comme un paramètre important dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K vues.  INSERM U970. Pendant le processus d'infection, une étape clé est l'adhésion des agents pathogènes avec les cellules hôtes. Dans la plupart des cas, cette étape d'adhésion a lieu en présence de contraintes mécaniques générées par l'écoulement liquide. Nous décrivons une technique qui introduit la contrainte de cisaillement comme un paramètre important dans l'étude de l'adhésion bactérienne.

Vidéo: Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Test in vitro de l&#39;adhésion bactérienne sur des mammifères cellules épithéliales

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Recherche

Immunologie et infection

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Souris humanisée modèle pour étudier les infections bactériennes Cibler la microvascularisation

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Statique Essai d&#39;adhésion pour l&#39;étude de l&#39;intégrine activation dans les lymphocytes T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants de transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Méthodes pour inhiber bactérienne Pyomelanin production et de déterminer l&#39;augmentation correspondante de la sensibilité au stress oxydatif

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l&#39;étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

Dosages pour étudier le rôle de la vitronectine dans adhésion bactérienne et la résistance au sérum

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

Analyse d&#39;immunofluorescence de la formation de granules de stress après le dépistage bactérien des cellules de mammifères

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...