Les auteurs tiennent à remercier Anna Walduck, Christina Cheers, Stuart Berzins, Dale Godfrey, Yifan Zhan et Jonathan Wilksch pour des conseils et des réactifs. Ce travail a été financé par la Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) et de la Santé et de l&#39;Australian National Medical Research Council (575552). NO est soutenue par un Prix d&#39;études supérieures en Australie. OW est soutenu par une bourse de RD Wright, de l&#39;Australian National Health Medical Research Council.

<ol>
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Inflammatory response and resistance to Listeria monocytogenes.</a> J Immunol. 142, 2057-2060 (1989).</li><li>Boyartchuk, V. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+in+mouse+models+of+intracellular+bacterial+infection.">DCs in mouse models of intracellular bacterial infection.</a> Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).</li><li>Conlan, J. W., North, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+are+essential+for+early+anti-Listeria+defense+in+the+liver,+but+not+in+the+spleen+or+peritoneal+cavity,+as+revealed+by+a+granulocyte-depleting+monoclonal+antibody.">Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 179, 259-268 (1994).</li><li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+antigranulocyte+monoclonal+antibody+RB6-8C5+prevents+expression+of+acquired+resistance+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+previously+immunized+mice.">Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice.</a> Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Listeria is one of the most widely used organisms to characterize host immune responses to intracellular bacteria6. The protocol presented here enables one to measure bacterial load and immune cell responses within the same tissue of a given mouse. This dual measurement of a particular tissue for each infected mouse provides for more robust comparisons within and between mouse cohorts (either representing different mouse strains or time points post-infection). While Listeria infection by oral administration could also be used to study immune responses in mice, infection by intravenous injection is often used because: 1) it ensures rapid and effective delivery to the bloodstream; 2) it results in a synchronized and consistent systemic infection; and 3) the Mus species harbors a mutation in the gene encoding the E-cadherin receptor, which limits Listeria infection by oral administration (this mutation affects Listeria's ability to bind the mouse E-cadherin receptor and to efficiently cross the epithelial lining of the gastrointestinal tract)16-18.
There are a few critical steps in this protocol. First, the Listeria inoculum stock should be generated from a fresh overnight HBA culture to ensure viability and virulence. Second, it is important to accurately determine the CFU concentration of the inoculum before and after injecting all mice to ensure that the CFU concentration does not differ greatly between the first and last mouse injected. Third, injection of Listeria into the tail vein must be consistent for all mice. Lastly, it is necessary to perfuse the liver to deplete non-resident leukocytes to ensure accurate measurement of immune cells within the liver and not leukocytes passing through in the peripheral blood. All of these steps, if not performed successfully, can result in unwanted variability for bacterial load and/or immune responses between individual mice infected with Listeria. 
Two limitations of this protocol are the investigator's skill for infecting mice by intravenous injection and the detection of bacterial load in tissues. If one person is injecting a large number of mice, Listeria viability (i.e. CFU concentration) may reduce over time once the frozen inoculum is thawed (e.g. &gt;2 hours between injecting first and last mouse). It is up to the investigator to determine how many mice she/he can inject before the inoculum is compromised. Another limitation of this method is that the Listeria load cannot be accurately measured below 100CFU/organ due to the relatively small amounts of cultured tissue homogenate (e.g. Figure 3 indicates that 100CFU/organ is the detection limit). To more accurately measure lower values for CFU/organ, a larger amount of the tissue homogenate can be cultured (up to 0.5mL per plate, multiple plates can be used) so a greater proportion of the tissue is sampled for detection of Listeria. If a Stomacher is not available, then alternative methods to homogenate the tissue, such as using a tissue homogenizer, can be used instead for steps 7.1-7.2. On a practical note, if space in the 37&deg;C incubator is limited for culturing tissue samples from infected mice, then HBA culture plates can be incubated at room temperature for 2-3 days (the colonies will grow slower at room temperature). However, room temperature should not be used when growing cultures for preparation of frozen Listeria stocks.
This protocol provides a basic approach for characterizing Listeria infection in mice and can be used with other Listeria strains besides EGD. In addition to the liver and spleen, single-cell suspensions from lymph nodes can also be generated. In either instance, these single-cell suspensions can be used for a variety of analyses, including measuring immune cell subsets, and in vitro stimulation of sorted immune cells. Once the basic techniques are mastered this protocol can also be modified to isolate Listeria-specific T cells19, characterize dendritic cells20, or perform immune cell depletion at certain time-points after infection21,22 to more thoroughly characterize the immune response in mice infected with Listeria.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Cheval gélose au sang de base n ° 2 </td><td> Oxoid </td><td> CM0271 </td><td> Préparation de la gélose de base pour les plaques HBA </td></tr><tr><td> Le sang de cheval (défibriné) </td><td> Oxoid </td><td> HB1000 </td><td> Ajouter 5-10% à la base d&#39;agar </td></tr><tr><td> Brain Heart Infusion (BHI) (10 ml) </td><td> Oxoid </td><td> TM456 </td><td></td></tr><tr><td> Les médias du cerveau coeur perfusion déshydratée </td><td> Oxoid </td><td> CM1135 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits à fond plat </td><td> BD Biosciences </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 70 tamis cellulaire um </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Petite boîte de Pétri </td><td> BD Biosciences </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Stomacher 80 Biomaster laboratoire de système de </td><td> Seward </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sacs en plastique Stomacher </td><td> Sarstedt </td><td> 86 9924 530 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;albumine sérique bovine </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon FACS </td><td></td><td></td><td> 0,1% (p / v) de sérum albumine bovine dans du PBS </td></tr><tr><td> Isotonique Percoll (33,75 Percoll% dans PBS) </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, PBS 1x 62.5mL fait 100mL isotonique Percoll </td></tr><tr><td> TAC Tampon </td><td></td><td></td><td> Tris 17mm, 140mm de chlorure d&#39;ammonium dans l&#39;eau distillée </td></tr><tr><td> FCS / EDTA </td><td></td><td></td><td> Sérum de veau fœtal à 10mm EDTA </td></tr><tr><td> FACS / EDTA </td><td></td><td></td><td> FACS tampon + EDTA 5mM </td></tr><tr><td> Le bleu trypan </td><td> Sigma </td><td> T6146 </td><td> 0,4% (p / v) dans du PBS, stérilisée par filtration </td></tr><tr><td> 2mL Cryovial </td><td> Greiner Bio One </td><td> 121263 </td><td></td></tr><tr><td> 27 seringue à insuline gauge/1mL </td><td> Terumo Medical Products </td><td> SS10M2713 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;aiguille </td><td> Terumo Medical Products </td><td> NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in) </td><td></td></tr><tr><td> Seringue </td><td> Terumo Medical Products </td><td> SS-01T (1ml), SS-053 (5 ml), le SS-10S (10 ml) </td><td></td></tr></tbody></table>

measuring bacterial load and immune responses in mice infected with listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) est un agent pathogène facultatives Gram-positives intracellulaires 1. Études sur les souris utilisent généralement une injection intraveineuse de la bactérie Listeria, qui se traduit par une infection systémique 2. Après l&#39;injection, Listeria diffuse rapidement à la rate et du foie due à l&#39;absorption par CD8a + cellules dendritiques et les cellules de Kupffer 3,4. Une fois phagocyté, différentes protéines bactériennes permettent d&#39;échapper à la Listeria phagosome, survivre dans le cytosol, et infecter les cellules voisines 5. Pendant les trois premiers jours de l&#39;infection, différentes cellules immunitaires innées (monocytes, par exemple, les neutrophiles, les cellules NK, cellules dendritiques) arbitrer les mécanismes bactéricides qui minimisent la prolifération de Listeria. Lymphocytes T CD8 + sont ensuite recrutés et responsable de l&#39;apurement éventuel de Listeria provenant de l&#39;hôte, habituellement dans les 10 jours d&#39;infection 6. Dédouanement réussie de Listeria chez les souris infectées dépend de la survenue de réactions appropriées immunitaire de l&#39;hôte 6. Il ya un large éventail de sensibilités parmi les souches de souris consanguines 7,8. Généralement, les souris à une susceptibilité accrue aux infections Listeria sont moins capables de contrôler la prolifération bactérienne, démontrant augmentation de la charge bactérienne et / ou une clairance retardée par rapport à des souris résistantes. Des études génétiques, y compris les analyses de liaison et de souches de souris knock-out, ont identifié des gènes différents pour lesquels la variation des séquences affecte réponses de l&#39;hôte à l&#39;infection Listeria 6,8-14. Détermination et comparaison des cinétiques d&#39;infection entre les différentes souches de souris est donc une méthode importante pour l&#39;identification des facteurs génétiques de l&#39;hôte qui contribuent à la réponse immunitaire contre la bactérie Listeria. Comparaison des réponses de l&#39;hôte à différentes souches de Listeria est également un moyen efficace d&#39;identifier les facteurs de virulence bactériens qui peuvent servir de cibles potentielles pour un traitement antibiotique ou de la conception du vaccin. Nous décrivons ici une méthode simple pour mesurer la charge bactérienne (unités formant colonie [CFU] par les tissus) et la préparation des suspensions à cellule unique du foie et la rate pour une analyse FACS des réponses immunitaires chez des souris infectées par Listeria. Cette méthode est particulièrement utile pour la caractérisation initiale de l&#39;infection par Listeria dans les souches de souris roman, ainsi que la comparaison des réponses immunitaires entre les différentes souches de souris infectées par la bactérie Listeria. Nous utilisons la bactérie Listeria monocytogenes EGD souche 15, qui, lorsqu&#39;elles sont cultivées sur gélose au sang, présente une zone halo caractéristique autour de chaque colonie, en raison de β-hémolyse 1 (figure 1). Charge bactérienne et les réponses immunitaires peuvent être déterminés à tout moment-point après l&#39;infection par homogénat de tissu en culture sur gélose au sang et à la préparation de suspensions de cellules de tissu pour analyse FACS en utilisant les protocoles décrits ci-dessous. Nous tenons à souligner que les personnes qui sont immunodéprimées ou enceintes ne devraient pas manipuler de Listeria, et les institutionnels concernés comité de biosécurité et la gestion de l&#39;animalerie doit être consulté avant le début des travaux.

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes est un organisme modèle pour étudier les réponses immunitaires et une susceptibilité génétique à des bactéries intracellulaires chez les souris. Cette méthode permet de mesurer la charge bactérienne et de générer une seule cellule de suspensions de foie et de rate de souris pour l&#39;analyse de FACS pour déterminer les changements dans les cellules immunitaires dues à l&#39;infection par Listeria.

Mesure de la charge bactérienne et les réponses immunitaires chez des souris infectées avec des Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

measuring-bacterial-load-immune-responses-mice-infected-with-listeria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

30.8K vues.  The University of Melbourne. Listeria monocytogenes est un organisme modèle pour étudier les réponses immunitaires et une susceptibilité génétique à des bactéries intracellulaires chez les souris. Cette méthode permet de mesurer la charge bactérienne et de générer une seule cellule de suspensions de foie et de rate de souris pour l'analyse de FACS pour déterminer les changements dans les cellules immunitaires dues à l'infection par Listeria.