Nous remercions Tran Huynh, Andrew San Antonio, Jerry Lin pour leur assistance technique. Ce travail a été financé par les National Institutes of Health DA023700 subventions et de DA023700-04S1 à XX

1. La préparation de tranches de cerveau <ol><li> Les souris transgéniques sont profondément anesthésiés avec du pentobarbital de sodium (&gt; 100 mg / kg, ip) et rapidement décapité, et leurs cerveaux extraits dans une solution de découpe congelés et oxygéné. </li><li> Lunettes de GFP sont utilisés pour visuel écran si le cerveau de souris exprime bien la GFP. </li><li> Somatosensoriel primaire sections corticales de 400 um d&#39;épaisseur sont coupées avec un vibratome de saccharose contenant le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF). Les tranches sont d&#39;abord incubées dans le saccharose contenant ACSF pendant 30 min à 1 h à 32 ° C, et après la période d&#39;incubation initiale, transféré à l&#39;ACSF enregistrement à la température ambiante. Tout au long de l&#39;incubation et l&#39;enregistrement, les tranches sont en permanence à barboter avec 95% d&#39;O 2 -5% CO 2. </li></ol> 2. Équipement de démarrage La mise en œuvre globale du système est illustrée dans la Figure 1. <ol><li> Le système de refroidissement laser et fournisseur d&#39;énergie est activée, le laser se prête. </li><li> Tout le matériel lié au contrôle photostimulation (y compris le système de miroir de balayage, un modulateur optique, d&#39;un obturateur électronique et un amplificateur d&#39;entrée de photodiodes) est allumé. </li><li> L&#39;équipement d&#39;électrophysiologie (y compris un amplificateur Multiclamp 700B et micromanipulateurs) est allumé. Enregistrements électrophysiologiques, photostimulation et l&#39;imagerie de la préparation tranche sont fait dans une chambre de perfusion tranche monté sur la platine motorisée du microscope. </li><li> La caméra d&#39;imagerie (Retiga 2000, Q-imagerie, Austin, TX) est allumé. Les tranches sont visualisées avec le microscope droit (BW51X, Olympus) avec un contraste interférentiel différentiel infrarouge (DIC) et épi-fluorescence optique à travers le système d&#39;imagerie. </li><li> Le logiciel Matlab basée EPHUS et logiciel de la caméra capture sont Q-démarré. Une version personnalisée du logiciel modifié de Ephus (Ephus, disponible à <a href="https://openwiki.janelia.org/">https://openwiki.janelia.org/</a> ) est utilisé pour contrôler les protocoles photostimulation et acquérir des données photostimulation. </li><li> Après que le système est allumé, il faut vérifier si le système photostimulation laser est moins un état de travail. Comme l&#39;objectif du microscope 4x est utilisé pour remettre les flashs UV pour uncaging glutamate, un morceau de papier blanc peut être mis sous d&#39;observer le balayage laser tandis que le système fonctionne. </li></ol> 3. Mise en place d&#39;une perfusion tranche <ol><li> Un système de perfusion sous pression est activé pour nourrir les ACSF d&#39;enregistrement dans la chambre tranche. Il est pris soin d&#39;assurer un niveau de liquide constant de 2,0 mm au-dessus de la tranche dans la chambre. </li><li> Une aliquote de la solution stock de l&#39;INM-cage-glutamate est ajouté à 25 ml de circulation ACSF, pour une concentration de 0,2 mM de glutamate en cage. S&#39;il vous plaît noter que après 5-6 h de l&#39;expérimentation, la solution du bain et de l&#39;INM-glutamate sera rafraîchie. </li><li> Une tranche de cerveau est déplacé dans la chambre d&#39;enregistrement. On peut exécuter le système d&#39;imagerie pour vérifier la qualité de coupe et de localiser la zone anatomiquement somatosensoriel primaire. Puis la tranche est ancré avec une bague sur-mesure en platine cordes. Soyez prudent de ne pas mettre l&#39;ancre sur la région du cerveau destinés aux enregistrements. </li></ol> 4. Patch-clamp de cellules entières d&#39;enregistrement <ol><li> Électrodes de verre (4-6 MQ résistance) sont retirés et rempli d&#39;une solution interne contenant biocytine 0,1% pour l&#39;étiquetage et l&#39;identification morphologique des cellules. </li><li> Pour effectuer l&#39;enregistrement de patch, les cellules sont visualisées à l&#39;objectif 60x. Types de cellules inhibitrices sont d&#39;abord identifiés et sélectionnés sur la base de visualisation de l&#39;expression de la GFP sous un microscope DIC / fluorescentes Olympe; enregistrements sont ensuite réalisées sous contrôle visuel aidée par la surveillance vidéo infrarouge DIC. S&#39;il vous plaît noter que quelques temps de commutation entre les modes de DIC et fluorescents est nécessaire pour confirmer l&#39;emplacement de la cellule GFP en approchant l&#39;électrode de la cellule cible. </li><li> Les techniques classiques de patch-clamp sont appliquées. L&#39;électrode est rempli avec une pression positive, déplacé près de la surface cellulaire pour établir une fossette visible sur la membrane de la cellule cible, puis la pression négative est appliquée rapidement pour former un gigaseal et rupture tout en surveillant les réactions d&#39;injection de courant sur le moniteur vidéo. </li><li> Après effraction, les images de la cellule à 60x sous les modes de DIC et fluorescents sont prises pour la vérification en ligne. Avant la collecte de données photostimulation, hyperpolarisante et dépolarisants impulsions de courant sont injectés pour examiner base de chaque cellule des propriétés électrophysiologiques. </li><li> Une fois les enregistrements stables de cellules entières sont obtenus avec la résistance d&#39;un bon accès (généralement &lt;20 MW), l&#39;objectif du microscope est commutée de 60x à 4x pour les photostimulation à balayage laser. L&#39;image tranche à 4x est acquis et sera utilisé pour le guidage et d&#39;enregistrer les lieux photostimulation. </li></ol> 5. Laser SCAnning photostimulation <ol><li> Les paramètres d&#39;acquisition photostimulation et les données sont mis en activant le module commutateur de configuration du Ephus. Normalement, 1 ms au laser (20 mW) avec un intervalle de relance de 1 seconde est utilisée pour la cartographie de photostimulation. Des traces de données de 1 seconde échantillonné à 10 kHz sont acquises. </li><li> L&#39;image tranche de 4x est chargé dans le module mappeur du Ephus. L&#39;emplacement du corps cellulaire est défini, et les sites photostimulation d&#39;un modèle 16x16 (80 um um espacement x 80) sont mis en place autour de l&#39;emplacement de la cellule, couvrant toutes les couches corticales. </li><li> Le profil d&#39;excitation du neurone enregistré est mappé en examinant les lieux de dopage en réponse à la photostimulation à la mode courant imposé. Notre logiciel convivial avec les fonctions d&#39;affichage en ligne facilite les expériences de cartographie. </li><li> Local connexions du circuit excitateur sont mappés par la détection de courants postsynaptiques excitateurs (RPEC) de la cellule enregistrée alors à balayage laser à différents endroits. La cellule est maintenue à -70 mV en mode voltage pour détecter l&#39;intérieur des courants excitateurs. Les cartes sont RPEC répétée 2-3 fois avec le modèle de rotation photostimulation ou basculé. </li><li> En option: Local connexions inhibitrices du circuit peut également cartographié par la détection de courants postsynaptiques inhibiteurs (CISP) de la cellule enregistrée lieu à près de 0 mV en mode voltage imposé à détecter les courants extérieurs inhibitrices. Notez qu&#39;il est préférable d&#39;utiliser la solution électrode interne avec le potassium remplacé par du césium pour la cartographie de l&#39;IPSC. </li><li> Après tous les tests physiologiques sont terminées, l&#39;électrode est délicatement retiré de la cellule enregistrée. La tranche de cerveau est sorti et fixés dans du paraformaldéhyde 4% pendant la nuit. Les cellules enregistrées est taché contre biocytine. Morphologie des cellules est examinée avec confocale ou épi-fluorescence microscopique, ce qui confirme également que chaque cellule enregistrée est en effet l&#39;interneurone exprimant la GFP initialement visés. </li></ol> 6. Photostimulation d&#39;analyse de données Notre méthodologie nouvellement développés et 11 la mise en œuvre du logiciel est appliquée à la détection et la mesure de la photostimulation évoqués événements synaptiques dans les cartes de données brutes. Comme le montre la figure 2, des cartes couleur sont construits pour illustrer le modèle d&#39;entrée synaptique au neurone enregistré. 7. Les résultats représentatifs: Exemple de résultats d&#39;enregistrement électrophysiologiques et la cartographie sont photostimulation montre la figure 2. Enregistrements spécifiques ciblées sur des types de cellules inhibitrices sont rendues possibles par l&#39;utilisation de souris transgéniques exprimant la GFP dans des cellules inhibitrices des types connus. Étant donné la diversité des interneurones inhibiteurs, des analyses d&#39;expression GFP, intrinsèque électrophysiologie et les caractéristiques morphologiques (figure 2A) sont combinés pour arriver à la classification des types de cellules finale. Figure 2B-C montrent que photostimulation laser à balayage pour la cartographie permet étendu de connexions locales circuits corticaux aux simples neurones inhibiteurs. La carte de données brutes est montré dans la figure 2C. Les réponses uncaging directs sont exclus de l&#39;analyse de données (figure 2C). Les cartes d&#39;entrée quantitatives sont codés par couleur, figure 2D-F. L&#39;exemple rapide de dopage interneurones inhibiteurs reçus forte entrée synaptique excitatrice (EPSCs) de la couche 4 et les couches plus profondes. En portant organisation de la cellule d&#39;entrée synaptic pour définir les voies corticales, nous sommes en mesure de déduire de son rôle possible (par exemple, de rétroaction et d&#39;inhibition feedforward) dans le traitement des informations corticales. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;instrumentation du système général de photostimulation à balayage laser. Notre système global de contrôle se compose de photostimulation, l&#39;imagerie vidéo et les systèmes d&#39;enregistrement électrophysiologiques. Nous avons adopté la conception du système décrit précédemment LSPS 7,17. Une unité laser est utilisé pour générer 355 nm laser UV pour uncaging glutamate. Le faisceau laser est dirigé par le chemin optique de notre système. De courtes durées d&#39;impulsions laser (par exemple, 1 - 3 ms) sont contrôlés en utilisant un modulateur électro-optique (par exemple, la cellule de Pockels) et un obturateur mécanique. Le faisceau laser de puissance est modulée par une roue gradient de densité neutre et surveillé en détournant une petite fraction du faisceau laser avec une lamelle de verre à une photodiode. Le système de balayage laser comprend une paire XY de miroirs de balayage, la lentille de balayage, la lentille de tube, et l&#39;objectif. Les miroirs livrer le faisceau laser à travers une lentille de balayage, puis le faisceau pénètre dans le microscope par un miroir dichroïque et est focalisé par une lentille sur-mesure tube UV-transmission. Le faisceau underfills l&#39;ouverture arrière de l&#39;objectif du microscope à fournir plus une colonnaire (par opposition aux coniques) faisceau d&#39;éclairage, en gardant la cartographie à deux dimensions que possible en réduisant la résolution axiale. Sous l&#39;objectif 4x, le faisceau laser forme des taches uncaging, chaque approximating un profil gaussien avec une largeur de 153 um latéralement dans le plan focal (voir l&#39;encart). Différentes positions de la stimulation par laser peut être réalisé par des galvanomètres axée miroirs de balayage XY, comme les miroirs et l&#39;ouverture arrière de l&#39;objectif sont dans des plans conjugués, traduisant des positions miroir dans différents endroits de balayage dans le plan focal objectif. Pendant uncaging, un nombre variable de sites de motifs qui couvre tout le champ sont stimulés de manière séquentielle dans une nonraster, séquence non aléatoire pour éviter de revoir la proximité des sites récemment stimulée. S&#39;il vous plaît se référer à Xu et al. (2010) pour des informations plus détaillées. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig2.jpg" /> Figure 2. Cartographie locales connexions du circuit excitateur à une exprimant la GFP rapide dopage interneurone dans la couche 4 de la souris cortex sensoriel primaire. A1 et A2 montrent les images DIC et GFP fluorescentes de la cellule cible sous l&#39;objectif 60x dans les tranches de cerveau de vie, tout montre A3 la morphologie des cellules révélées par coloration biocytine dans le post-enregistrement, tranche fixe. A4 montre les schémas de tir de la cellule de la GFP a enregistré, caractéristique d&#39;un interneurone inhibiteur rapide de dopage, en réponse à intrasomatic injections de courant de différentes forces. B montrent l&#39;image superposée à la tranche de 16 sites photostimulation x16 (*). L&#39;emplacement de la cellule est indiqué par le petit cercle rouge. C montre un tableau de photostimulation évoqués traces de réponse à partir des emplacements de stimulation montré en B, tandis que la cellule a été tenue à -70 mV pour détecter l&#39;intérieur des courants excitateurs. Différentes formes de réponses photostimulation sont illustrés par les traces dans des endroits de 1 et 2, qui sont développées et distincte dans l&#39;insert. La trace 1 est un exemple des réponses directes (indiqué par les flèches rouges) au glutamate uncaging sur le corps cellulaire et les dendrites promximal. D&#39;autres traces dans les 2 sont des exemples typiques de réponses excitatrices entrée synaptique (en bleu). Réponses directes et des entrées synaptiques peuvent être distingués par leurs amplitudes et des latences de réponse. D, E et F sont les cartes de couleur (16x16 sites) de la moyenne RPEC amplitude, le nombre de RPEC, et le premier temps de latence détecté RPEC par site, respectivement, pour les données brutes carte montrée dans C. L&#39;amplitude moyenne de chaque entrée site de la stimulation est l&#39;amplitude moyenne de EPSCs dans la fenêtre d&#39;analyse, avec la réponse de base spontanée soustraite de la réponse photostimulation du même site. Le nombre de EPSCs et l&#39;heure d&#39;arrivée ou de latence de l&#39;EPSC détecté pour la première par site sont également mesurées et tracées. S&#39;il vous plaît se référer à (Shi et al., 2010) pour plus de détails.

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	<li>Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology:+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature. 9, 557-568 (2008).</li><li>Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system.">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nature. 5, 793-807 (2004).</li><li>Xu, X., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+specificity+of+functional+input+to+distinct+types+of+inhibitory+cortical+neurons.">Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 70-85 (2009).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons:+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells.">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li><li>Dantzker, J. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+sources+of+synaptic+input+to+cortical+inhibitory+interneurons+and+pyramidal+neurons.">Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 3, 701-707 (2000).</li><li>Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-scale+specificity+of+cortical+networks+depends+on+inhibitory+cell+type+and+connectivity.">Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity.</a> Nat Neurosci. 8, 1552-1559 (2005).</li><li>Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+analysis+of+experience-dependent+plasticity+in+the+developing+rat+barrel+cortex.">Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex.</a> Neuron. 38, 277-289 (2003).</li><li>Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+laminar+organization+of+the+excitatory+network+in+motor+cortex.">Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex.</a> Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).</li><li>Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+and+fast+functional+mapping+of+cortical+circuitry+through+a+combination+of+voltage+sensitive+dye+imaging+and+laser+scanning+photostimulation.">High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation.</a> J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cortical+inhibitory+neuron+type+that+coexpresses+somatostatin+and+calretinin.">Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin.</a> J Comp Neurol. 499, 144-160 (2006).</li><li>Shi, Y., Nenadic, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+of+matched+filtering+for+synaptic+event+detection+and+extraction.">Novel use of matched filtering for synaptic event detection and extraction.</a> PLoS ONE. 5, e15517-e15517 (2010).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression.">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).</li><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+fast-spiking+cells+induces+gamma+rhythm+and+controls+sensory+responses.">Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses.</a> Nature. 459, 663-667 (2009).</li><li>Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+columnar+organization+of+ascending+excitatory+projections+to+layer+2/3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex.">Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex.</a> J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Techniques de cartographie basée sur photostimulation ont été effectivement appliquées pour l&#39;analyse des circuits corticaux. Photostimulation balayage laser combinée avec l&#39;enregistrement de cellules entières permet de cartographier à haute résolution des distributions laminaires des sources d&#39;entrée pour les neurones présynaptiques unique, car l&#39;enregistrement simultané d&#39;un neurone postsynaptique avec photostimulation d&#39;amas de neurones présynaptiques à différents endroits fourni...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> lignées de souris transgéniques </td><td> Jackson laboratoire ou d&#39;autres sources </td><td></td><td> S&#39;il vous plaît se référer à Xu et Callaway (2009) </td></tr><tr><td> GFP lunettes </td><td> BLS SA, en Hongrie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> vibratome </td><td> Systèmes Leica </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Glutamate INM en cage (4-méthoxy-7-nitroindolinyl-cage L-glutamate) </td><td> Bioscience Tocris, Ellisville, MO </td><td> Cat n ​​° 1490 </td><td></td></tr><tr><td> biocytine </td><td></td><td> B4261 </td><td></td></tr><tr><td> Extracteur d&#39;électrode </td><td> Sutter Instrument, Novato, CA </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> tubes de verre pour faire des électrodes </td><td></td><td> BF150-86-10 </td><td></td></tr><tr><td> Multiclamp ampli 700B </td><td> Molecular Devices, Sunnyvale, CA </td><td> Multiclamp 700B </td><td></td></tr><tr><td> La caméra CCD numérique </td><td> Q-imagerie, Austin, TX </td><td> Retiga 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à la recherche </td><td> Olympus, Tokyo, Japon </td><td> BW51X </td><td></td></tr><tr><td> Unité laser UV </td><td> DPSS Lasers, Santa Clara, Californie </td><td> le modèle 3501 </td><td></td></tr><tr><td> Autres équipements pour la numérisation laser phostimulation </td><td></td><td></td><td> S&#39;il vous plaît se référer à Xu et al (2010). </td></tr></tbody></table> Solutions: <ul><li> Contenant du saccharose liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour couper une tranche (en mM: NaCl 85, 75 de saccharose, 2,5 KCl, 25 de glucose, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 0,5 CaCl2, et 24 NaHCO 3). </li><li> Enregistrement ACSF (en mM: NaCl 126, KCl 2,5, 26 NaHCO 3, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, 1,25 NaH 2 PO 4, et 10 de glucose) </li><li> Solution électrode interne (en mM: 126 K-gluconate, 4 KCl, HEPES 10, 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na, et 10 phosphocréatine; pH 7,2, 300 mOsm). </li></ul>

mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation

Les neurones inhibiteurs sont cruciaux pour la fonction corticale. Ils représentent environ 20% de toute la population neuronale corticale et peut être subdivisée en sous-types différents en fonction de leurs propriétés immunochimiques, morphologiques, physiologiques et 1-4. Bien que des recherches antérieures ont révélé beaucoup sur les propriétés intrinsèques des différents types de neurones inhibiteurs, les connaissances sur leurs connexions circuit local est encore relativement limitée 3,5,6. Étant donné que la fonction de chaque neurone individuel est façonné par son entrée synaptique excitateurs et inhibiteurs dans les circuits corticaux, nous avons eu recours à balayage laser photostimulation (LSP) pour les connexions locales au plan du circuit des types spécifiques de cellules inhibitrices. Comparé à une stimulation électrique conventionnel ou la stimulation de glutamate feuilletée, LSPS a des avantages uniques permettant la cartographie étendue et l&#39;analyse quantitative des locaux fonctionnels pour les entrées enregistrés individuellement neurones 3,7-9. Photostimulation laser via uncaging glutamate active sélectivement les neurones perisomatically, sans activer les axones de passage ou de dendrites distales, ce qui assure une résolution de cartographie sous-laminaire. La sensibilité et l&#39;efficacité de LSP pour les entrées de cartographie à partir de nombreux sites de stimulation sur une vaste région sont bien adaptées pour l&#39;analyse des circuits corticaux. Ici, nous introduisons la technique de LSP combinée avec la cellule entière patch clamp pour la cartographie des circuits locaux inhibiteurs. Enregistrements spécifiques ciblées sur des types de cellules inhibitrices sont facilitées par l&#39;utilisation de souris transgéniques exprimant des protéines vertes fluorescentes (GFP) dans des populations limitées neurone inhibiteur du cortex 3,10, ce qui permet l&#39;échantillonnage uniforme des types de cellules ciblées et d&#39;identifier sans ambiguïté les types de cellules enregistrées . Comme pour la cartographie des LSP, nous décrivons l&#39;instrumentation du système, décrire la procédure expérimentale et acquisition de données, et présente des exemples de cartographie circuit principal de la souris cortex somatosensoriel. Comme illustré dans nos expériences, le glutamate est activé en cage dans une région géographiquement limitée de la tranche de cerveau par photolyse laser UV; simultanée voltage-clamp enregistrements permettent la détection de photostimulation évoqués réponses synaptiques. Cartes d&#39;entrée soit excitateurs ou inhibiteurs synaptiques du neurone cible sont générés par la numérisation du faisceau laser pour stimuler des centaines de sites potentiels présynaptiques. Ainsi, les LSP permet la construction de cartes détaillées des entrées synaptiques empiéter sur des types spécifiques de neurones inhibiteurs par des expériences répétées. Pris ensemble, la technique basée sur la photostimulation offre neuroscientifiques un outil puissant pour déterminer l&#39;organisation fonctionnelle des locaux circuits corticaux.

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Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Cet article présente une approche consistant à combiner photostimulation à balayage laser avec des enregistrements de cellules entières dans des souris transgéniques exprimant la GFP dans les populations limitées neurone inhibiteur. La technique permet de cartographie étendue et l&#39;analyse quantitative des locaux des circuits synaptiques inhibitrices spécifiques des neurones corticaux.

Cartographie inhibitrice circuits neuronaux par balayage laser photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

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17.2K vues.  University of California, Irvine. Cet article présente une approche consistant à combiner photostimulation à balayage laser avec des enregistrements de cellules entières dans des souris transgéniques exprimant la GFP dans les populations limitées neurone inhibiteur. La technique permet de cartographie étendue et l'analyse quantitative des locaux des circuits synaptiques inhibitrices spécifiques des neurones corticaux.

Vidéo: Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Recherche

Neurosciences

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire of dynamical motifs, which underlie most diverse brain functions, can emerge out of a fixed topological and modular organization of brain circuits. Compared to in vivo studies of neuronal circuits which present intrinsic experimental difficulties, in vitro preparations offer a much larger possibility to manipulate and probe the structural, dynamical and chemical properties of experimental neuronal systems. This work describes an in vitro experimental methodology which allows growing of modular networks composed by spatially distinct, functionally interconnected neuronal assemblies. The protocol allows controlling the two-dimensional (2D) architecture of the neuronal network at different levels of topological complexity.
A desired network patterning can be achieved both on regular cover slips and substrate embedded micro electrode arrays. Micromachined structures are embossed on a silicon wafer and used to create biocompatible polymeric stencils, which incorporate the negative features of the desired network architecture. The stencils are placed on the culturing substrates during the surface coating procedure with a molecular layer for promoting cellular adhesion. After removal of the stencils, neurons are plated and they spontaneously redirected to the coated areas. By decreasing the inter-compartment distance, it is possible to obtain either isolated or interconnected neuronal circuits. To promote cell survival, cells are co-cultured with a supporting neuronal network which is located at the periphery of the culture dish. Electrophysiological and optical recordings of the activity of modular networks obtained respectively by using substrate embedded micro electrode arrays and calcium imaging are presented. While each module shows spontaneous global synchronizations, the occurrence of inter-module synchronization is regulated by the density of connection among the circuits.

This manuscript describes a protocol to grow in vitro modular networks consisting of spatially confined, functionally inter-connected neuronal circuits. A polymeric mask is used to pattern a protein layer to promote cellular adhesion over the culturing substrate. Plated neurons grow on coated areas establishing spontaneous connections and exhibiting electrophysiological activity.

Conception, Traitement de surface, Cellulaire Placage et culture des réseaux neuronaux modulaires Composé de circuits Fonctionnellement Inter-connectées

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Neuronal Tracing dans des explants de cerveau à guidage laser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Rappel des circuits neuronaux: une nouvelle méthode pour une extension rapide des neurones et une connexion neuronale fonctionnelle

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

La Stimulation électrique chronique transcrânienne et Intracortical enregistrement chez le rat

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Alliant Optogenetics artificiel microARN pour caractériser les effets du gène Knockdown fonction présynaptique dans les Circuits de neurones intacts

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic entraînement des Oscillations thêta hippocampique en comportement des souris

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

Préparation in vitro en tranches compensées pour imiter la connectivité du circuit neuronal In Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.