These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).

<ol>
	<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools.">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147, 1446-1457 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+neural+interface:+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology.">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> J Neural Eng. 4, S143-156 (2007).</li><li>Sidor, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychiatry's+age+of+enlightenment:+optogenetics+and+the+discovery+of+novel+targets+for+the+treatment+of+psychiatric+disorders.">Psychiatry's age of enlightenment: optogenetics and the discovery of novel targets for the treatment of psychiatric disorders.</a> J Psychiatry Neurosci. 37, 4-6 (2012).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li><li>Nieh, E. H., Kim, S. Y., Namburi, P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+neural+circuits+underlying+emotional+valence+and+motivated+behaviors.">Optogenetic dissection of neural circuits underlying emotional valence and motivated behaviors.</a> Brain Res. 1511, 73-92 (2013).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li><li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477, 171-178 (2011).</li><li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nat Protoc. 7, 12-23 (2012).</li><li>Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+identification+of+striatal+projection+neuron+subtypes+during+in+vivo+recordings.">Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings.</a> Brain Res. 1511, 21-32 (2013).</li><li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins.">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nat Methods. 9, 159-172 (2012).</li><li>Foutz, T. J., Arlow, R. L., McIntyre, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+principles+underlying+optical+stimulation+of+a+channelrhodopsin-2+positive+pyramidal+neuron.">Theoretical principles underlying optical stimulation of a channelrhodopsin-2 positive pyramidal neuron.</a> J Neurophysiol. 107, 3235-3245 (2012).</li><li>Tye, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety.">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li><li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5, 247-254 (2010).</li><li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463, 98-102 (2010).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nat Neurosci. 14, 387-397 (2011).</li><li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-stable+neural+state+switches.">Bi-stable neural state switches.</a> Nat Neurosci. 12, 229-234 (2009).</li><li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue.">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> J Vis Exp. , e50004 (2012).</li><li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13, 387-392 (2010).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96, 1803-1814 (2009).</li><li>Gradinaru, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Goshen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+retrieval+strategies+for+remote+memories.">Dynamics of retrieval strategies for remote memories.</a> Cell. 147, 678-689 (2011).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to report.

Les laser décrit set-ups et les stratégies actuelles d&#39;attache sont compatibles avec un large éventail de tests comportementaux de rongeurs. En effet, une variété de tests comportementaux ont été utilisés suivant, ou d&#39;accompagnement, la stimulation optogenetic in vivo qui comprennent tâches émotives comportement, conditionnement comportemental, l&#39;apprentissage et les paradigmes de mémoire, sommeil, l&#39;éveil et les tâches appétitives pour ne en nommer que quelques-uns (voir Nieh et al. 6 pour un examen complet). Optogenetics a changé la façon dont des tests comportementaux traditionnels sont menées en ce que les études de plusieurs jours peut maintenant être condensé en une seule session à laquelle le comportement est comparé, intra-sujets, au cours des époques distinctes de la lumière »sur» contre «off» 5. Compartiments de la note, appareils de comportement qui contiennent des portes, fermées ou d&#39;autres obstacles peuvent être modifiées pour permettre le passage de fibres captifs. Le stratégies d&#39;attache permis si décritstimulation multanée de souris multiples à partir d&#39;un seul laser. Haut débit tests comportementaux optogenetic peut donc être obtenue par l&#39;utilisation de multiples lasers et l&#39;équipement d&#39;essai. Le nombre d&#39;animaux qui peuvent être stimulés simultanément, cependant, sera limitée par la puissance lumineuse maximale qui peut être atteint à chaque extrémité de la fibre. Puissance de sortie maximale à la pointe de la fibre dépend de la 1) une puissance de démarrage du laser; 2) l&#39;efficacité de couplage et 3) nombre de divisions de faisceau. Pour un laser bleu de 100 mW avec ~ 80% d&#39;efficacité de couplage et jusqu&#39;à quatre divisions de faisceau (comme illustré sur la figure 4C), puissance moyenne à la pointe de la fibre peut varier entre 5 à 10 mW lors de l&#39;utilisation de 200 um base, 0,22 NA cordons de raccordement de fibre (nb se attendre à une perte de transmission de joints rotatifs pour être &lt;15%). Sortie de mesure de la lumière à l&#39;extrémité de la fibre est essentiel pour déterminer la puissance de la lumière suffisante pour l&#39;activation de opsin que opsines diffèrent dans leur sensibilité à la lumière et donc la densité de puissance lumineuse (mW/ Mm 2) 11 nécessaire pour l&#39;activation. Par exemple, l&#39;étape consistant à fonction stable opsine (SSFO) agit comme un accumulateur de photons et nécessite donc très peu de densité de puissance lumineuse pour l&#39;activation (&lt;8 mW / mm 2) 8. Comparez cela à la rhodopsine canal traditionnel (ChR2) qui nécessite un minimum de 1 mW / mm 2 de la lumière pour obtenir des potentiels d&#39;action 2. Tableau 1 est fourni en référence rapide pour irradiances lumineuses minimales connues requises pour activer opsines les plus courantes actuellement en utiliser. Enfin, il faut considérer que les disperse la lumière et absorbe à mesure qu&#39;il traverse les tissus du cerveau de telle sorte que plus de puissance lumineuse est nécessaire pour les structures cérébrales profondes 3. Une ressource en ligne utile est disponible à <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php">http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a> qui va calculer l&#39;intensité de la lumière à différentes profondeurs à travers les tissus du cerveau en tenanttenir compte de la taille de coeur de la fibre, ouverture numérique, longueur d&#39;onde de la lumière utilisée, et la puissance de la lumière à partir de la pointe de la fibre. Pour un excellent aperçu des principes théoriques qui sous-tendent ces calculs, voir Foutz et al. (2012) 12. Des exemples de la façon d&#39;appliquer ces principes et les calculs à la conception expérimentale sont démontrés dans Aravanis et al. (2007) 3 et Tye et al. (2012) 13. L&#39;exécution de ces calculs avant le début d&#39;une expérience est cruciale pour assurer le rayonnement de la lumière suffisante pour l&#39;activation de l&#39;opsine. Compte tenu de ces considérations, il est avantageux d&#39;acheter des lasers de forte puissance pour assurer la puissance de sortie adéquate. Lasers avec une puissance de 100 à 200 mW sont généralement suffisantes pour compenser les petites fibres de l&#39;âme, multiples fractionnement de fibres, couplage inefficacité et la transmission perd 7. Si l&#39;aide de lasers de forte puissance, cependant, des précautions doivent être prises pour éviter les dommages neuronaux ou de la chaleur et de la lumière-associéartefacts d qui peuvent survenir avec prolongée et / ou de haute puissance éclairage en lumière sept. Une gamme sans danger pour les expériences in vivo est jusqu&#39;à 75 mW / mm 2. 14 Décider du type de laser à l&#39;achat peut être une affaire compliquée car il ya beaucoup de facteurs à considérer. Par exemple, des lasers à diodes directes fournissent sortie pulsée plus stable et reproductible de faire l&#39;état solide (DPSS) lasers pompés par diode, et sont plus fiables dans le temps dans un environnement de laboratoire. Dans certains cas, cependant, des lasers à diodes directes peut émettre une puissance lumineuse inférieure, ~ 0,1 mW, même lorsque la tension de commande V 0 est dû à un biais constant de courant étant envoyé à la diode par l&#39;électronique de commande du laser. Cette émission «spontanée» a un spectre plus large que ne le fait émission laser de la même laser, donc peut être spécifiquement réduite par l&#39;installation d&#39;un passe-bande étroite (ou «nettoyage») filtre entre le laser et le coupleur (voir liste des pièces). Ce filtre sera égalementréduire la puissance de sortie de ~ 50% lorsque l&#39;effet laser, donc acheter un laser de forte puissance en conséquence. Il convient de noter que les lasers DPSS jaunes sont extrêmement sensibles et peuvent se comporter de façon erratique et ont réduit la durée de vie si rapidement modulé par un générateur d&#39;impulsions. Réglage de la puissance du laser jaune doit être fait par roues à filtres de densité externes placés sur le trajet du faisceau (section 1.7) pendant le fonctionnement du laser dans le mode TTL +. Alternativement, l&#39;achat d&#39;un vert 532 nm DPSS laser est une alternative rentable qui peut activer les deux halorhodopsins et archaerhodopsins. L&#39;ouverture numérique (NA) d&#39;une fibre est important de tenir compte lors de la conception et l&#39;achat de composants en fibre pour l&#39;assemblage laser set-up. Le NA d&#39;une fibre optique détermine les angles de rayons lumineux qui peuvent être acceptées et émis à la pointe d&#39;une fibre. Si une fibre plus-NA est accouplé à une fibre inférieur NA, perte importante se produira à cette interface, il est donc important d&#39;être compatible wi<html> e NA fibres dans une seule configuration (ou de se assurer que NA augmente le long de la trajectoire de la lumière). L&#39;effet des fibres NA sur le volume des tissus du cerveau illuminé est moins important, puisque le tissu du cerveau est très dispersait, et puisque la lumière couplée d&#39;une source laser aura tendance à fibres high-na &#39;&#39; sous-remplissage; cependant fibres optiques avec une ouverture numérique de 0,22 et 0,37 sont couramment utilisés. De même, le couplage d&#39;un plus grand-core à une fibre plus petit noyau sera également entraîner des pertes importantes, il faut donc toujours être sûr d&#39;utiliser de plus en plus ou égales diamètres de base lors de la progression de la source laser à l&#39;implant animale. D&#39;une manière générale, les extrémités des fibres doivent toujours être plafonnés lorsqu&#39;il ne est pas utilisé pour éviter la poussière et l&#39;accumulation de particules. Ce est une bonne idée de régulièrement extrémités et connecteurs (70% d&#39;alcool isopropylique fonctionne bien) pour assurer maximale puissance lumineuse de sortie, et de tester la puissance de sortie la lumière à travers un «implant factice» avant de commencer les expériences de chaque jour fibres propres. &quot;&gt; Lors des tests de comportement, il est impératif que des mesures soient prises pour contrôler les effets de l&#39;infection virale, l&#39;expression de la protéine exogène, la lumière visible, et les effets et les artefacts de chauffage des tissus possibles sur le comportement animal. Par conséquent, le groupe de contrôle approprié devrait être composé d&#39;animaux transduites avec un virus témoin (par exemple, GFP, EYFP, mCherry) qui reçoivent des paramètres de stimulation lumineuse identiques. La vérification expérimentale est une étape finale déterminant que les données de comportement utilisés pour l&#39;analyse dépend entièrement de l&#39;opsine appropriée et le placement de la fibre optique dans la région d&#39;intérêt . En particulier, chez les animaux où aucun signal ne est détecté immunohistochimique, ou lorsque le signal de positionnement ou de la fibre ne est pas dans la région d&#39;intérêt, les données alors que le comportement de l&#39;animal doivent être retirés de l&#39;expérience. En outre, il est essentiel de tester la production de lumière à la pointe de la fibre à la fois avant l&#39;implantation chirurgicale et encore post-mortem pour assurer une alimentation adéquate de la lumière pour l&#39;activation de l&#39;opsine. Dans animals où de graves perte de lumière est produite par la fibre après l&#39;expérimentation (&gt; 30%) 9, les données de cet animal doit être considéré pour l&#39;enlèvement. Les critères de retrait devraient être établies a priori. Enfin, il faut considérer la fréquence des impulsions nécessaires pour moduler cuisson neural, qui dépendra de la structure du cerveau et des sous-types de neurones étant ciblé. Publié paramètres de stimulation lumineuse optogénétiques existent pour plusieurs sous-types de neurones, cependant, la capacité de moduler excitation nerveuse devrait être confirmée indépendamment par in vivo ou tranche de cerveau enregistrements électrophysiologiques. Comme on devient habile avec l&#39;utilisation du laser et la modification de laser set-ups, des combinaisons de différentes longueurs d&#39;onde peuvent être attachés à des fibres multiples sur un seul animal ou livrés sur la même fibre pour optogénétique combinatoire 8. Stimulation multi-longueur d&#39;onde va devenir de plus en plus important, étant donné le développement rapide de décalage vers le rougeed channelrhodopsins 8, l&#39;ingénierie de opsines hyperpolarisants décalée vers le bleu 15, l&#39;utilisation de bistables opsines étape fonctions 8,16,17, et la liste expansion générale de opsines avec les spectres d&#39;activation distincte 11. Cette expansion de la boîte à outils optogenetic permettra le contrôle sans précédent de plusieurs sous-types de neurones à la fois dans et entre les régions du cerveau pour déterminer leur rôle dans le gouvernement états comportementaux complexes.

Optogenetics a révolutionné les neurosciences au niveau des systèmes dans sa recherche pour les éléments de circuit neuronal de conduite états comportementaux normaux et pathologiques pertinentes. La découverte que opsines microbiennes sensibles à la lumière 1 pourraient être exprimés dans des cellules de mammifères fonctionnellement fourni la plate-forme pour l&#39;utilisation de la lumière pour obtenir un contrôle sans précédent de l&#39;activité neuronale avec une grande précision spatiale et temporelle 2. Contrairement aux approches traditionnelles électrophysiologiques ou pharmacologiques à la manipulation de l&#39;activité neuronale, optogénétique permet le contrôle de types de cellules spécifiques (sur la base génétique identifier ou projection spatiale) à l&#39;intérieur des populations hétérogènes à des échelles de temps et physiologiquement pertinents. L&#39;introduction ultérieure d&#39;une interface neurale-optique a fourni un outil pratique pour la livraison de la lumière pour se comporter trois animaux. Cela a permis pour la modulation en temps réel des circuits neuronaux définis chez les rongeurs de se comporter éveillés afin de tester le lien de causalitérôle de ces circuits neuronaux dans la gouvernance des états comportementaux concernant les maladies neurologiques et psychiatriques 4-6. Optogenetics, représente donc un outil puissant pour l&#39;introduction dans ne importe quel laboratoire intéressé à étudier la relation fonctionnelle entre l&#39;activité cérébrale et les mesures comportementales ou physiologiques dans des modèles animaux. La conception et la réalisation de une expérience optogenetic implique différentes étapes et considérations (voir Figure 1). Le but du protocole actuel est de fournir aux individus les outils et composants, avec la connaissance théorique et pratique, nécessaire pour effectuer une stimulation optogenetic chez les rongeurs de se comporter éveillés. Actuellement, il ya deux plages de longueur d&#39;onde prédominante utilisées pour activer les canaux opsin microbiennes: dans le spectre bleu (473 nm couramment) et spectres vert-jaune (couramment 532 ou 591 nm). Les deux lasers et de diodes électroluminescentes (DEL) peuvent être utilisés comme sources de lumière à dEliver longueurs d&#39;onde spécifiques de la lumière aux tissus du cerveau. La lumière non cohérente émise par des LED, cependant, rend la transmission efficace de la lumière difficile lors de l&#39;accouplement dans les petites fibres de base nécessaires à la stimulation in vivo de rongeurs. Décider sur l&#39;ensemble de laser approprié est une première étape cruciale et dépendra de l&#39;utilisation prévue de l&#39;optogénétique dans le laboratoire. Le protocole actuel décrit deux configurations de base qui diffèrent dans leur facilité de montage et de l&#39;utilisation des lasers: pré-couplé simples et les systèmes à double laser (voir figure 2). Systèmes laser simples qui sont pré-couplés par le fabricant sont essentiellement prêt-à-go à l&#39;arrivée avec peu ou pas de set-up nécessaire mais présentent l&#39;inconvénient de personnalisation minimale de l&#39;utilisateur final. Système de laser à double permet la livraison de deux longueurs d&#39;onde différentes sur la même fibre. Cela va devenir de plus en plus importante avec l&#39;avènement de l&#39;optogénétique combinatoire lequel différentes longueurs d&#39;onde peuvent être utilisés pour activer / inhiber la distinctiont types cellulaires qui sont co-localisé spatialement. Ce est également essentiel pour une utilisation avec bi-stables opsines de fonction de l&#39;étape où sont photocourants début et la fin par la lumière bleue et jaune, respectivement 7,8. Systèmes laser double sont également personnalisables que l&#39;utilisateur peut ajouter ou supprimer des composants (par exemple, volets extérieurs, des filtres de faisceau, compteurs de puissance en ligne) de la trajectoire du faisceau selon les besoins. Grâce à sa polyvalence, le laser double set-up est recommandé si optogénétique va être un outil continué utilisé dans le laboratoire. Le couplage des lasers, cependant, peut présenter un défi et donc un mécanisme de couplage rapide, simple et fiable est prévue dans ce protocole. Remarque, ce protocole détaille l&#39;assemblage de composants optiques et utilise les cordons de brassage et de composants qui sont optimisés pour les fibres multimodes à saut d&#39;indice avec un noyau de 200 um et une ouverture numérique (NA) de 0,22. Tailles de base différentes et NA sont disponibles à l&#39;achat, mais tous les composants devraient idéalement correspondre en termes de coeurtaille et NA pour éviter la perte de lumière aux points de connexion de la fibre. En variante, à une connexion de fibre, la lumière peut passer à partir d&#39;une plus petite à une taille de noyau plus grand; et / ou d&#39;un faible NA-NA à une fibre plus élevé sans perte supplémentaire. stratégies d&#39;attache sont prévus qui permettent une stimulation simultanée de plusieurs tests comportementaux pour les souris à haut débit. Les protocoles fournis supposent l&#39;utilisation de fibres implantables chroniques pour les tests de comportement mais peuvent être modifiés pour les protocoles de stimulation aiguë. Fibres aiguë implantés sont avantageux pour combiner la stimulation optogenetic avec la manipulation pharmacologique, puisque le même canule peut être utilisé pour délivrer des médicaments et la pointe d&#39;une fibre optique au même endroit. L&#39;utilisation de fibres implantées chronique est cependant fortement recommandé pour les tests comportementaux plusieurs jours, car elle réduit les lésions tissulaires associées à l&#39;insertion et le retrait répétés de fibres et augmente la précision en termes de placement cohérent de fibres pourillumination de tissu 3. Lorsqu&#39;il est combiné avec les configurations d&#39;attache décrits ici, le comportement peut être enregistrée de manière fiable sur plusieurs jours. Mois En effet, la transmission de lumière fiable n&#39;a été signalée après l&#39;implantation de la fibre 9 telles que la stimulation chronique et des modèles de tests comportementaux peuvent, en théorie, être effectuées sur plusieurs jours et semaines. Notes supplémentaires sur les composants matériels ont été ajoutés au protocole pour permettre le choix de lecteur dans le meilleur produit qui répondra à leurs besoins individuels, y compris des solutions de rechange rentables et les produits qui peuvent être faites en interne. Conseils importants qui sont utiles lors de l&#39;installation et de mise en œuvre sont également fournis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">1. Laser Set-up</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , &#60;2% Stability</td>
			<td style="width:59px;">Omicron</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">Luxx/Phoxx 473/488-100</td>
			<td style="width:245px;">Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">100mW 594nm DPSS laser</td>
			<td style="width:59px;">Colbolt</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0594-04-01-0100-300</td>
			<td style="width:245px;">04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability</td>
			<td style="width:59px;">Shanghai Lasers</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">GL532T3-200</td>
			<td style="width:245px;">Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Non-contact style laser to multimode fiber coupler&#160;</td>
			<td style="width:59px;">OZ Optics</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HPUC-23-400/700-M-20AC-11</td>
			<td style="width:245px;">For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 12&#34; x 18&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1213</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 10&#34; x 12&#34; x 1/2&#34;. 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1012</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 4&#34; x 6&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">MB4</td>
			<td style="width:245px;">For blue laser; dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact variable height clamp, 1/4&#34;-20 Tapped</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">CL3</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">3/4&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TR075</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">TR1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">PH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Pedestal Base Adapter</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BE1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Small Clamping Fork</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">CF125</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics with visible laser quality mirror</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">KM100-E02</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Neutral filter density wheel</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">NDC-50C-2M</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; Longpass dichroic mirror 50%</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DMLP505</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">KM100</td>
			<td style="width:245px;">For dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">20-piece hex wrench kit with stand</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TC2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1/4&#34;-20 cap screw and hardware kit</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HW-KIT2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Mounting base 1&#34; x 2.3&#34;x3/8&#34;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">BA1S</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">ADAFCB1</td>
			<td style="width:245px;">Dual FC/PC L-bracket also available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Breadboard lifting handles</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BBH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">&#216;1&#34; Bandpass Filter, CWL = 450 &#177; 2 nm, FWHM = 10 &#177; 2 nm</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FB450-10</td>
			<td style="width:245px;">For use with diode lasers that spontaneously emit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">2. Laser Coupling</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:304px;">! Laser protective eyewear</td>
			<td style="width:59px;">Various</td>
			<td style="width:65px;">One for every user at each wavelength</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;">! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Fiber optic cable tester</td>
			<td style="width:59px;">Eclipse</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">902-186N</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">One-step fiber connector cleaner</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FBC1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.75 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.5 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode&#160;</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Doric mini cube</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">DMC_1x2_FC-2FC</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact power and energy meter console</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">PM100D</td>
			<td style="width:245px;">Digital 4&#34; LCD</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">C-series slim power sensor 5-500mW</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">S130C&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Multiple detectors types are available; check with vendor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">3. In vivo Optogenetic Stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Multimode fiber splitters</td>
			<td style="width:59px;">FONT Canada</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Arbitrary waveform function generator (2 channel)</td>
			<td style="width:59px;">Rigol</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DG1022</td>
			<td style="width:245px;">Can control up to 2 lasers at once</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Fiber optic rotary joint (commutator)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC*</td>
			<td style="width:65px;">6 to 8</td>
			<td style="width:127px;">FRJ_1X1_FC-FC</td>
			<td style="width:245px;">*Also available through Thorlabs and Prizmatix</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:304px;">Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">8</td>
			<td style="width:127px;">MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg)</td>
			<td style="width:59px;">Precision fiber Products</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">SM-CS1140S</td>
			<td style="width:245px;">Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Clear dust caps for &#216;2.5 mm ferrules (25/pkg)&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">CAPF</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">CAPF1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">Thick-jacketed patch cords (custom order)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

Les résultats comportementaux obtenus avec la stimulation in vivo de optogenetic dépendent entièrement sur ​​le circuit neuronal étant ciblée, le modèle animal utilisé, et les paramètres de modulation. Pour fins de démonstration actuelles, les neurones dopaminergiques dans l&#39;aire tegmentale ventrale, ou VTA, de la tyrosine hydroxylase :: souris Cre ont été transduites avec une étape-fonction stable opsine (SSFO) 8, ou le virus de commande (EYFP), et un implant de fibres était chroniquement implanté. L&#39;utilisation de souris transgéniques TH :: Cre assure que opsine expression est restreinte aux cellules TH + (dopamine) dans l&#39;aire tegmentale ventrale. La figure 7 représente les résultats obtenus en utilisant représentatifs du comportement du laser mise en place décrit en cours pour la stimulation simultanée de plusieurs souris. Ici, les souris ont été stimulées relié et en même temps en utilisant des lasers séparés (3 souris / Laser selon la figure 4C) et le comportement locomotrice a été enregistrée pendant 1 heure. Stimulation répétée des neurones dopaminergiques dans le VTA a entraîné unehyperactif phénotype qui a persisté pendant toute la durée de la stimulation. Aucun changement dans le comportement locomoteur a été observée chez les souris EYFP (voir vidéo 1). Après les tests de comportement, immunohistochimie a été effectué pour vérifier ciblage virale exact de neurones dopaminergiques VTA et placement de fibres a été confirmée visuellement (voir Figure 7). <img alt="Figure 1" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig1highres.jpg" /> Figure 1. étapes expérimentales pour la stimulation optogenetic in vivo. Il ya quatre étapes générales impliquées dans la conception et la réalisation in vivo la stimulation optogenetic. Ce protocole détaille notamment les étapes impliquées dans la livraison de la lumière provenant d&#39;une source de lumière laser à des structures profondes du cerveau chez le rongeur de se comporter et comprend 1) l&#39;assemblage du système de couplage de la lumière laser et; 2) stratégies d&#39;attache pour connexion plusieurs animaux à une source de lumière pour les tests de comportement à haut débit et 3) fournit des lignes directrices pour confirmer la stratégie de ciblage pour la livraison la lumière - une étape qui est essentielle pour l&#39;interprétation des données. Note: bien que ce protocole ne est pas exclusive aux fibres implantables chroniques à des fins d&#39;attache, il est recommandé et pris en charge lors de la combinaison avec la stimulation optogenetic tests comportementaux. Voir tant Ung &amp; Arenkiel, 2012 18 et Sparte et al., 2012 9 pour la production et l&#39;implantation de fibres optiques chroniques en interne. Les lignes continues = étapes couvertes par ce protocole. <img alt="Figure 2" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig2highres.jpg" /> Figure 2. Systèmes laser utilisés pour la stimulation optogenetic in vivo. (A) de système laser unique pour la stimulation in vivo. Ce laser est ph<html> ysically pré-couplés par fabricant et nécessite peu d&#39;utilisateur final set-up. (B) système laser double. Deux lasers sont couplées dans une fibre unique par l&#39;utilisation de miroirs qui agissent pour diriger chaque trajet de faisceau en un coupleur de type sans contact. Ce est le plus polyvalent set-up en tant que composants optiques peuvent être retirées ou ajoutées, au besoin, mais présente un plus grand défi en termes de couplage laser efficace. (C) Schéma du système à double laser montré en (B) de placement indiquant des lasers et miroirs avec le trajet du faisceau de lumière laser correspondant (flèches) représenté. Ici, le miroir dichroïque &quot;D&quot; est utilisé pour dévier les longueurs d&#39;onde bleues de la lumière tout en transmettant les longueurs d&#39;onde jaunes à travers le coupleur de &quot;C&quot; et dans le cordon de raccordement de coupleur joint. B = laser bleu; C = coupleur de style non-contact; D = miroir dichroïque; FW = roue de filtre; M = Miroir; Y = laser jaune.obtenir = &quot;_ blank&quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig3highres.jpg" /> Bottom Figure 3. testeur (A) de câble utilisé dans le protocole de couplage non physique:. Testeur de câble directement relié à un cordon de raccordement. Insérer dépeint point de testeur au câble de connexion cordons (B) de Patch référence tout au long de protocole De extérieur vers l&#39;intérieur:.. Multimode séparateur de fibres, noir-chemise animale cordon de raccordement avec le blanc manchon zircone split attaché au-cleave plat (FC) fin, Cordon de raccordement à double paroi épaisse (également dénommé une «corde de coupleur&quot;). Cordons épais enveloppe sont recouvertes avec du chlorure de polyvinyle (PVC) tube pour une protection supplémentaire. Pour ces câbles, les codes de couleurs standard de l&#39;industrie sont utilisés pour distinguer entre les différents types de fibres, où Orange = fibre multimode. cordons de brassage sont des animaux<html> mince à double enveloppe pour permettre la flexibilité pour les mouvements d&#39;animaux au cours des essais de comportement. Notez que la poussière bouchons sont placés sur FC / PC se termine lorsque les câbles ne sont pas en cours d&#39;utilisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig4highres.jpg" /> Figure 4. Stratégies d&#39;attache pour la stimulation optogenetic in vivo de (A) un seul animal, (B) deux animaux; . (C) trois ou quatre animaux configurations possibles ne sont pas limités à ceux ci-dessus - de multiples configurations sont possibles grâce à la combinaison unique d&#39;adaptateurs, séparateurs de fibres, et de branchement des cordons de brassage qui sont disponibles dans le commerce ou en commande spéciale. Remarque: les cordons de raccordement et répartiteurs de fibres contiennent FC / PC connecteurs sur les deux extrémités (une seule extrémité est représenté).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 5" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig5highres.jpg" /> Figure 5. (Rouge x) raccordement correct et incorrect d&#39;un cordon de raccordement à une fibre optique implantable en utilisant une fraction de manches. (Panneau de gauche) A zircone split-manchon est utilisé pour connecter un cordon de raccordement à la virole d&#39;une fibre optique implantable (ici pas apposé à un animal). Flèche pointe vers le point de connexion entre le cordon de raccordement et implantable fibre optique. Comparer à (panneau de droite) où il existe un écart entre le cordon de raccordement et implantable fibre optique, tels que révélés par la fente du manchon de raccordement. Notez la fuite de lumière qui peut se produire avec une mauvaise connexion (en bas à droite). Culot sur upper panneau de gauche représente composants individuels utilisés. De haut en bas de l&#39;insert: Doric implantable fibre optique canule, zircone blanc split-manche, cleeve-plat (FC) fin d&#39;un patch animale cordon noir à double enveloppe (cordon de raccordement complète représentée sur la figure 3B). Dans tous les panneaux, noter que le manchon de raccordement ne est pas de niveau avec la fin de la FC cordon de raccordement. Laissez ~ 0,5 cm d&#39;une plus-accrocher pour la connexion à la fibre optique implantable apposée sur l&#39;animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig5large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig6highres.jpg" /> Figure 6. Side (à gauche) et frontale (à droite) vue d&#39;une souris avec une fibre optique implanté relié à un cordon de raccordement. Utilisez la scission sur le manchon de raccordement pour aider à visualiser une connexion correcte du cordon de raccordement to la virole de la fibre optique implanté. Le point de connexion est mise en évidence par une boîte en pointillé rouge et également représenté dans l&#39;insert supérieure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig6large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig7highres.jpg" /> Figure 7. Les résultats représentatifs. (Gauche) lecture comportementale de la stimulation optogenetic in vivo. Exemple de comportement qui peut être obtenu en utilisant le laser décrit set-up et le protocole d&#39;attache. L&#39;activité locomotrice a été enregistrée pendant la stimulation optogenetic de l&#39;aire tegmentale ventrale (VTA) dans la tyrosine hydroxylase (TH) :: souris Cre (n = 7-8 / groupe) transduites avec soit une étape-fonction opsine (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ) ou le virus de commande (AAV5-DIO-EYFP) dans le VTA. Des groupes de trois souris ont été simultanément attachés à un seullaser comme représenté sur la figure 4C et stimulé par une impulsion de 5 sec de 447 ou 473 nm lumière livré une fois toutes les 15 min. Mesures répétées Two-Way ANOVA ont révélé une interaction significative groupe x temps (F 3,39 = 15,27, p &lt;0,0001) et un effet principal significatif de temps (F 3,39 = 4,67, p = 0,007) selon laquelle la stimulation optogenetic augmentation de l&#39;activité locomotrice seulement chez les souris SSFO (Bonferroni post-hoc p &lt;0,0001, par rapport à t = 0-15 bin de temps), résultant en une augmentation globale de l&#39;activité locomotrice par rapport aux souris EYFP (effet principal de groupe: F 1,39 = 10,69, p = 0,0061; Bonferroni post-hoc p &lt;0,01 à t = 15-30 et p &lt;0,001 à t = 30 à 45 et t = 45 à 60). Fiche d&#39;Fibre: 200 um base, 0,22 NA. Lumière irradiance = 6-66 mW / mm 2, correspondant à la fibre pointe distance de 0,1 à 0,6 mm de virale site d&#39;injection avec la puissance de la lumière de 5 mW émise au bout de la fibre avant tethering. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;erreur standard de la moyenne. EYFPvs SSFO: ** p &lt;0,01; *** P &lt;0,001; effet du temps: #### p &lt;0,0001 (droite) La confirmation histologique du placement virale et fibre optique.. Image de fluorescence confocale acquise sur un Leica TCS microscope à balayage laser SP5 a été utilisé pour visualiser placement de fibres (en pointillés) et d&#39;expression à médiation virale (vert) dans l&#39;aire tegmentale ventrale de souris après la stimulation in vivo dans optogenetic. Les neurones dopaminergiques (TH +) sont considérés en bleu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig7large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Vidéo 1. In vivo la stimulation optogenetic:. Hyperactivité pendant la stimulation VTA utilisant SSFO chez les souris TH :: Cre <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/JOVE_video_1.mov" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellsstimulation = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="5"> Tableau 1. irradiances lumière nécessaire pour activer opsines couramment utilisés. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Opsin Variant </td><td rowspan="2"> λ </td><td rowspan="2"> La densité de puissance (/ mm 2) </td><td></td><td rowspan="2"> Propriétés </td></tr><tr><td> ON / OFF Kinetics </td></tr><tr><td colspan="5"> Excitation optique: channelrhodopsins action rapide </td></tr><tr><td> ChR2 2 </td><td> 470 </td><td> 1 - 5mW </td><td> 1,21 / 12 msec </td><td> Feux jusqu&#39;à 40 Hz </td></tr><tr><td> CHETA 19 </td><td> 490 </td><td> 5 mW </td><td> 0,86 / 8,5 msec </td><td> Incendies jusqu&#39;à 200 Hz </td></tr><tr><td> ChEF 20 </td><td> 450 </td><td> 1,65 mW </td><td> 1,62 / 12 msec </td><td> Forme non-désensibilisation des ChR2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> C1V 18 </td><td rowspan="2"> 540-630 </td><td> 8 mW (540 nm) </td><td> 5/34 msec à 540nm </td><td rowspan="2"> Décalée vers le rouge </td></tr><tr><td> 3,2 mW (630nm) </td><td> 67 ms (sur) à 630nm </td></tr><tr><td colspan="5"> Excitation optique: action lente rhodopsines de canal </td></tr><tr><td> Stable fonction échelon opsine (SFO) 8 </td><td> 470/590 </td><td> 8 mW (470nm) </td><td> 20 msec / 29 min </td><td> La nouvelle version OFS; état plus ouvert. Ouverte par 470 nm, fermé par 590 nm </td></tr><tr><td colspan="4"> Inhibition optique </td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> eNpHR3.0 21 </td><td rowspan="2"> 560-630 </td><td rowspan="2"> 3-5 mW </td><td rowspan="2"> 2,5 ms / &lt;10 msec </td><td> Inhibition soutenue pendant 30 min 22 avec la lumière constante * </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> ArchT3.0 11, 23 </td><td> 520-560 </td><td> 1-5 mW </td><td> 2 / &lt;10 msec </td><td> Plus sensible avec de plus grandes photocourants que eNpHR3.0 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td colspan="5"> Ce tableau est fourni qu&#39;à titre indicatif; irradiances de lumière spécifiques requises pour la modulation de neurones doivent être confirmées de façon indépendante. </td></tr><tr><td colspan="5"> Validation expérimentale est important de vérifier que l&#39;opsine, la stratégie de ciblage, et des paramètres de stimulation neurale lumière modulent cuisson de la manière prévue 5. </td></tr><tr><td colspan="5"> La densité de puissance (mW / mm 2) se réfère à la puissance de la lumière lumineux sur une zone donnée des tissus du cerveau et ne se réfère pas à la puissance lumineuse émise par la pointe de la fibre. </td></tr><tr><td colspan="5"> * Toujours utiliser l&#39;intensité de la lumière le plus bas possible, surtout avec la stimulation lumineuse prolongée. </td></tr></tbody></table> Tableau 1. irradiances lumière nécessaire pour activer opsines couramment utilisés. Abréviations AAV = virus adéno-associé DPSS = état solide pompé par diode <br/&gt; EYFP = amélioré la protéine fluorescente jaune FC / PC = cleave plat / contact physique GFP = protéine fluorescente verte PBS = solution saline tamponnée au phosphate PVC = polychlorure de vinyle mW = milliwatt NA = ouverture numérique SSFO = stable étape fonction opsin TH = tyrosine hydroxylase Logique TTL = transistor-transistor V = tension VTA = aire tegmentale ventrale

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In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

59.0K vues.  University of Pittsburgh Medical Center. Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

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Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Drug Delivery systémique et locale pour traiter les maladies du système nerveux central dans les modèles rongeurs

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Recherche

Neurosciences

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Section du nerf optique: un modèle de l&#39;apoptose neuronale des adultes dans le système nerveux central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagerie multimodale d&#39;implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

La production de vecteurs lentiviraux pour les cellules de transduction du Système Nerveux Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Un paradigme d&#39;enquêter sur les blessures du système nerveux central de réparation de<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Livraison intraventriculaire directe des médicaments pour le système nerveux central rongeurs

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Analyse immunohistochimique dans le système nerveux central et périphérique Rat ganglionnaire sections de tissu

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing optique du système nerveux central de souris utilisant CLARITY passive

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...