These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).

<ol>
	<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools.">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147, 1446-1457 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+neural+interface:+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology.">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> J Neural Eng. 4, S143-156 (2007).</li><li>Sidor, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychiatry's+age+of+enlightenment:+optogenetics+and+the+discovery+of+novel+targets+for+the+treatment+of+psychiatric+disorders.">Psychiatry's age of enlightenment: optogenetics and the discovery of novel targets for the treatment of psychiatric disorders.</a> J Psychiatry Neurosci. 37, 4-6 (2012).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li><li>Nieh, E. H., Kim, S. Y., Namburi, P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+neural+circuits+underlying+emotional+valence+and+motivated+behaviors.">Optogenetic dissection of neural circuits underlying emotional valence and motivated behaviors.</a> Brain Res. 1511, 73-92 (2013).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li><li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477, 171-178 (2011).</li><li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nat Protoc. 7, 12-23 (2012).</li><li>Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+identification+of+striatal+projection+neuron+subtypes+during+in+vivo+recordings.">Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings.</a> Brain Res. 1511, 21-32 (2013).</li><li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins.">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nat Methods. 9, 159-172 (2012).</li><li>Foutz, T. J., Arlow, R. L., McIntyre, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+principles+underlying+optical+stimulation+of+a+channelrhodopsin-2+positive+pyramidal+neuron.">Theoretical principles underlying optical stimulation of a channelrhodopsin-2 positive pyramidal neuron.</a> J Neurophysiol. 107, 3235-3245 (2012).</li><li>Tye, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety.">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li><li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5, 247-254 (2010).</li><li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463, 98-102 (2010).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nat Neurosci. 14, 387-397 (2011).</li><li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-stable+neural+state+switches.">Bi-stable neural state switches.</a> Nat Neurosci. 12, 229-234 (2009).</li><li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue.">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> J Vis Exp. , e50004 (2012).</li><li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13, 387-392 (2010).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96, 1803-1814 (2009).</li><li>Gradinaru, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Goshen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+retrieval+strategies+for+remote+memories.">Dynamics of retrieval strategies for remote memories.</a> Cell. 147, 678-689 (2011).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to report.

Les laser décrit set-ups et les stratégies actuelles d&#39;attache sont compatibles avec un large éventail de tests comportementaux de rongeurs. En effet, une variété de tests comportementaux ont été utilisés suivant, ou d&#39;accompagnement, la stimulation optogenetic in vivo qui comprennent tâches émotives comportement, conditionnement comportemental, l&#39;apprentissage et les paradigmes de mémoire, sommeil, l&#39;éveil et les tâches appétitives pour ne en nommer que quelques-uns (voir Nieh et al. 6 pour un examen complet). Optogenetics a changé la façon dont des tests comportementaux traditionnels sont menées en ce que les études de plusieurs jours peut maintenant être condensé en une seule session à laquelle le comportement est comparé, intra-sujets, au cours des époques distinctes de la lumière »sur» contre «off» 5. Compartiments de la note, appareils de comportement qui contiennent des portes, fermées ou d&#39;autres obstacles peuvent être modifiées pour permettre le passage de fibres captifs. Le stratégies d&#39;attache permis si décritstimulation multanée de souris multiples à partir d&#39;un seul laser. Haut débit tests comportementaux optogenetic peut donc être obtenue par l&#39;utilisation de multiples lasers et l&#39;équipement d&#39;essai. Le nombre d&#39;animaux qui peuvent être stimulés simultanément, cependant, sera limitée par la puissance lumineuse maximale qui peut être atteint à chaque extrémité de la fibre. Puissance de sortie maximale à la pointe de la fibre dépend de la 1) une puissance de démarrage du laser; 2) l&#39;efficacité de couplage et 3) nombre de divisions de faisceau. Pour un laser bleu de 100 mW avec ~ 80% d&#39;efficacité de couplage et jusqu&#39;à quatre divisions de faisceau (comme illustré sur la figure 4C), puissance moyenne à la pointe de la fibre peut varier entre 5 à 10 mW lors de l&#39;utilisation de 200 um base, 0,22 NA cordons de raccordement de fibre (nb se attendre à une perte de transmission de joints rotatifs pour être &lt;15%). Sortie de mesure de la lumière à l&#39;extrémité de la fibre est essentiel pour déterminer la puissance de la lumière suffisante pour l&#39;activation de opsin que opsines diffèrent dans leur sensibilité à la lumière et donc la densité de puissance lumineuse (mW/ Mm 2) 11 nécessaire pour l&#39;activation. Par exemple, l&#39;étape consistant à fonction stable opsine (SSFO) agit comme un accumulateur de photons et nécessite donc très peu de densité de puissance lumineuse pour l&#39;activation (&lt;8 mW / mm 2) 8. Comparez cela à la rhodopsine canal traditionnel (ChR2) qui nécessite un minimum de 1 mW / mm 2 de la lumière pour obtenir des potentiels d&#39;action 2. Tableau 1 est fourni en référence rapide pour irradiances lumineuses minimales connues requises pour activer opsines les plus courantes actuellement en utiliser. Enfin, il faut considérer que les disperse la lumière et absorbe à mesure qu&#39;il traverse les tissus du cerveau de telle sorte que plus de puissance lumineuse est nécessaire pour les structures cérébrales profondes 3. Une ressource en ligne utile est disponible à <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php">http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a> qui va calculer l&#39;intensité de la lumière à différentes profondeurs à travers les tissus du cerveau en tenanttenir compte de la taille de coeur de la fibre, ouverture numérique, longueur d&#39;onde de la lumière utilisée, et la puissance de la lumière à partir de la pointe de la fibre. Pour un excellent aperçu des principes théoriques qui sous-tendent ces calculs, voir Foutz et al. (2012) 12. Des exemples de la façon d&#39;appliquer ces principes et les calculs à la conception expérimentale sont démontrés dans Aravanis et al. (2007) 3 et Tye et al. (2012) 13. L&#39;exécution de ces calculs avant le début d&#39;une expérience est cruciale pour assurer le rayonnement de la lumière suffisante pour l&#39;activation de l&#39;opsine. Compte tenu de ces considérations, il est avantageux d&#39;acheter des lasers de forte puissance pour assurer la puissance de sortie adéquate. Lasers avec une puissance de 100 à 200 mW sont généralement suffisantes pour compenser les petites fibres de l&#39;âme, multiples fractionnement de fibres, couplage inefficacité et la transmission perd 7. Si l&#39;aide de lasers de forte puissance, cependant, des précautions doivent être prises pour éviter les dommages neuronaux ou de la chaleur et de la lumière-associéartefacts d qui peuvent survenir avec prolongée et / ou de haute puissance éclairage en lumière sept. Une gamme sans danger pour les expériences in vivo est jusqu&#39;à 75 mW / mm 2. 14 Décider du type de laser à l&#39;achat peut être une affaire compliquée car il ya beaucoup de facteurs à considérer. Par exemple, des lasers à diodes directes fournissent sortie pulsée plus stable et reproductible de faire l&#39;état solide (DPSS) lasers pompés par diode, et sont plus fiables dans le temps dans un environnement de laboratoire. Dans certains cas, cependant, des lasers à diodes directes peut émettre une puissance lumineuse inférieure, ~ 0,1 mW, même lorsque la tension de commande V 0 est dû à un biais constant de courant étant envoyé à la diode par l&#39;électronique de commande du laser. Cette émission «spontanée» a un spectre plus large que ne le fait émission laser de la même laser, donc peut être spécifiquement réduite par l&#39;installation d&#39;un passe-bande étroite (ou «nettoyage») filtre entre le laser et le coupleur (voir liste des pièces). Ce filtre sera égalementréduire la puissance de sortie de ~ 50% lorsque l&#39;effet laser, donc acheter un laser de forte puissance en conséquence. Il convient de noter que les lasers DPSS jaunes sont extrêmement sensibles et peuvent se comporter de façon erratique et ont réduit la durée de vie si rapidement modulé par un générateur d&#39;impulsions. Réglage de la puissance du laser jaune doit être fait par roues à filtres de densité externes placés sur le trajet du faisceau (section 1.7) pendant le fonctionnement du laser dans le mode TTL +. Alternativement, l&#39;achat d&#39;un vert 532 nm DPSS laser est une alternative rentable qui peut activer les deux halorhodopsins et archaerhodopsins. L&#39;ouverture numérique (NA) d&#39;une fibre est important de tenir compte lors de la conception et l&#39;achat de composants en fibre pour l&#39;assemblage laser set-up. Le NA d&#39;une fibre optique détermine les angles de rayons lumineux qui peuvent être acceptées et émis à la pointe d&#39;une fibre. Si une fibre plus-NA est accouplé à une fibre inférieur NA, perte importante se produira à cette interface, il est donc important d&#39;être compatible wi<html> e NA fibres dans une seule configuration (ou de se assurer que NA augmente le long de la trajectoire de la lumière). L&#39;effet des fibres NA sur le volume des tissus du cerveau illuminé est moins important, puisque le tissu du cerveau est très dispersait, et puisque la lumière couplée d&#39;une source laser aura tendance à fibres high-na &#39;&#39; sous-remplissage; cependant fibres optiques avec une ouverture numérique de 0,22 et 0,37 sont couramment utilisés. De même, le couplage d&#39;un plus grand-core à une fibre plus petit noyau sera également entraîner des pertes importantes, il faut donc toujours être sûr d&#39;utiliser de plus en plus ou égales diamètres de base lors de la progression de la source laser à l&#39;implant animale. D&#39;une manière générale, les extrémités des fibres doivent toujours être plafonnés lorsqu&#39;il ne est pas utilisé pour éviter la poussière et l&#39;accumulation de particules. Ce est une bonne idée de régulièrement extrémités et connecteurs (70% d&#39;alcool isopropylique fonctionne bien) pour assurer maximale puissance lumineuse de sortie, et de tester la puissance de sortie la lumière à travers un «implant factice» avant de commencer les expériences de chaque jour fibres propres. &quot;&gt; Lors des tests de comportement, il est impératif que des mesures soient prises pour contrôler les effets de l&#39;infection virale, l&#39;expression de la protéine exogène, la lumière visible, et les effets et les artefacts de chauffage des tissus possibles sur le comportement animal. Par conséquent, le groupe de contrôle approprié devrait être composé d&#39;animaux transduites avec un virus témoin (par exemple, GFP, EYFP, mCherry) qui reçoivent des paramètres de stimulation lumineuse identiques. La vérification expérimentale est une étape finale déterminant que les données de comportement utilisés pour l&#39;analyse dépend entièrement de l&#39;opsine appropriée et le placement de la fibre optique dans la région d&#39;intérêt . En particulier, chez les animaux où aucun signal ne est détecté immunohistochimique, ou lorsque le signal de positionnement ou de la fibre ne est pas dans la région d&#39;intérêt, les données alors que le comportement de l&#39;animal doivent être retirés de l&#39;expérience. En outre, il est essentiel de tester la production de lumière à la pointe de la fibre à la fois avant l&#39;implantation chirurgicale et encore post-mortem pour assurer une alimentation adéquate de la lumière pour l&#39;activation de l&#39;opsine. Dans animals où de graves perte de lumière est produite par la fibre après l&#39;expérimentation (&gt; 30%) 9, les données de cet animal doit être considéré pour l&#39;enlèvement. Les critères de retrait devraient être établies a priori. Enfin, il faut considérer la fréquence des impulsions nécessaires pour moduler cuisson neural, qui dépendra de la structure du cerveau et des sous-types de neurones étant ciblé. Publié paramètres de stimulation lumineuse optogénétiques existent pour plusieurs sous-types de neurones, cependant, la capacité de moduler excitation nerveuse devrait être confirmée indépendamment par in vivo ou tranche de cerveau enregistrements électrophysiologiques. Comme on devient habile avec l&#39;utilisation du laser et la modification de laser set-ups, des combinaisons de différentes longueurs d&#39;onde peuvent être attachés à des fibres multiples sur un seul animal ou livrés sur la même fibre pour optogénétique combinatoire 8. Stimulation multi-longueur d&#39;onde va devenir de plus en plus important, étant donné le développement rapide de décalage vers le rougeed channelrhodopsins 8, l&#39;ingénierie de opsines hyperpolarisants décalée vers le bleu 15, l&#39;utilisation de bistables opsines étape fonctions 8,16,17, et la liste expansion générale de opsines avec les spectres d&#39;activation distincte 11. Cette expansion de la boîte à outils optogenetic permettra le contrôle sans précédent de plusieurs sous-types de neurones à la fois dans et entre les régions du cerveau pour déterminer leur rôle dans le gouvernement états comportementaux complexes.

Optogenetics a révolutionné les neurosciences au niveau des systèmes dans sa recherche pour les éléments de circuit neuronal de conduite états comportementaux normaux et pathologiques pertinentes. La découverte que opsines microbiennes sensibles à la lumière 1 pourraient être exprimés dans des cellules de mammifères fonctionnellement fourni la plate-forme pour l&#39;utilisation de la lumière pour obtenir un contrôle sans précédent de l&#39;activité neuronale avec une grande précision spatiale et temporelle 2. Contrairement aux approches traditionnelles électrophysiologiques ou pharmacologiques à la manipulation de l&#39;activité neuronale, optogénétique permet le contrôle de types de cellules spécifiques (sur la base génétique identifier ou projection spatiale) à l&#39;intérieur des populations hétérogènes à des échelles de temps et physiologiquement pertinents. L&#39;introduction ultérieure d&#39;une interface neurale-optique a fourni un outil pratique pour la livraison de la lumière pour se comporter trois animaux. Cela a permis pour la modulation en temps réel des circuits neuronaux définis chez les rongeurs de se comporter éveillés afin de tester le lien de causalitérôle de ces circuits neuronaux dans la gouvernance des états comportementaux concernant les maladies neurologiques et psychiatriques 4-6. Optogenetics, représente donc un outil puissant pour l&#39;introduction dans ne importe quel laboratoire intéressé à étudier la relation fonctionnelle entre l&#39;activité cérébrale et les mesures comportementales ou physiologiques dans des modèles animaux. La conception et la réalisation de une expérience optogenetic implique différentes étapes et considérations (voir Figure 1). Le but du protocole actuel est de fournir aux individus les outils et composants, avec la connaissance théorique et pratique, nécessaire pour effectuer une stimulation optogenetic chez les rongeurs de se comporter éveillés. Actuellement, il ya deux plages de longueur d&#39;onde prédominante utilisées pour activer les canaux opsin microbiennes: dans le spectre bleu (473 nm couramment) et spectres vert-jaune (couramment 532 ou 591 nm). Les deux lasers et de diodes électroluminescentes (DEL) peuvent être utilisés comme sources de lumière à dEliver longueurs d&#39;onde spécifiques de la lumière aux tissus du cerveau. La lumière non cohérente émise par des LED, cependant, rend la transmission efficace de la lumière difficile lors de l&#39;accouplement dans les petites fibres de base nécessaires à la stimulation in vivo de rongeurs. Décider sur l&#39;ensemble de laser approprié est une première étape cruciale et dépendra de l&#39;utilisation prévue de l&#39;optogénétique dans le laboratoire. Le protocole actuel décrit deux configurations de base qui diffèrent dans leur facilité de montage et de l&#39;utilisation des lasers: pré-couplé simples et les systèmes à double laser (voir figure 2). Systèmes laser simples qui sont pré-couplés par le fabricant sont essentiellement prêt-à-go à l&#39;arrivée avec peu ou pas de set-up nécessaire mais présentent l&#39;inconvénient de personnalisation minimale de l&#39;utilisateur final. Système de laser à double permet la livraison de deux longueurs d&#39;onde différentes sur la même fibre. Cela va devenir de plus en plus importante avec l&#39;avènement de l&#39;optogénétique combinatoire lequel différentes longueurs d&#39;onde peuvent être utilisés pour activer / inhiber la distinctiont types cellulaires qui sont co-localisé spatialement. Ce est également essentiel pour une utilisation avec bi-stables opsines de fonction de l&#39;étape où sont photocourants début et la fin par la lumière bleue et jaune, respectivement 7,8. Systèmes laser double sont également personnalisables que l&#39;utilisateur peut ajouter ou supprimer des composants (par exemple, volets extérieurs, des filtres de faisceau, compteurs de puissance en ligne) de la trajectoire du faisceau selon les besoins. Grâce à sa polyvalence, le laser double set-up est recommandé si optogénétique va être un outil continué utilisé dans le laboratoire. Le couplage des lasers, cependant, peut présenter un défi et donc un mécanisme de couplage rapide, simple et fiable est prévue dans ce protocole. Remarque, ce protocole détaille l&#39;assemblage de composants optiques et utilise les cordons de brassage et de composants qui sont optimisés pour les fibres multimodes à saut d&#39;indice avec un noyau de 200 um et une ouverture numérique (NA) de 0,22. Tailles de base différentes et NA sont disponibles à l&#39;achat, mais tous les composants devraient idéalement correspondre en termes de coeurtaille et NA pour éviter la perte de lumière aux points de connexion de la fibre. En variante, à une connexion de fibre, la lumière peut passer à partir d&#39;une plus petite à une taille de noyau plus grand; et / ou d&#39;un faible NA-NA à une fibre plus élevé sans perte supplémentaire. stratégies d&#39;attache sont prévus qui permettent une stimulation simultanée de plusieurs tests comportementaux pour les souris à haut débit. Les protocoles fournis supposent l&#39;utilisation de fibres implantables chroniques pour les tests de comportement mais peuvent être modifiés pour les protocoles de stimulation aiguë. Fibres aiguë implantés sont avantageux pour combiner la stimulation optogenetic avec la manipulation pharmacologique, puisque le même canule peut être utilisé pour délivrer des médicaments et la pointe d&#39;une fibre optique au même endroit. L&#39;utilisation de fibres implantées chronique est cependant fortement recommandé pour les tests comportementaux plusieurs jours, car elle réduit les lésions tissulaires associées à l&#39;insertion et le retrait répétés de fibres et augmente la précision en termes de placement cohérent de fibres pourillumination de tissu 3. Lorsqu&#39;il est combiné avec les configurations d&#39;attache décrits ici, le comportement peut être enregistrée de manière fiable sur plusieurs jours. Mois En effet, la transmission de lumière fiable n&#39;a été signalée après l&#39;implantation de la fibre 9 telles que la stimulation chronique et des modèles de tests comportementaux peuvent, en théorie, être effectuées sur plusieurs jours et semaines. Notes supplémentaires sur les composants matériels ont été ajoutés au protocole pour permettre le choix de lecteur dans le meilleur produit qui répondra à leurs besoins individuels, y compris des solutions de rechange rentables et les produits qui peuvent être faites en interne. Conseils importants qui sont utiles lors de l&#39;installation et de mise en œuvre sont également fournis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">1. Laser Set-up</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , &#60;2% Stability</td>
			<td style="width:59px;">Omicron</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">Luxx/Phoxx 473/488-100</td>
			<td style="width:245px;">Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">100mW 594nm DPSS laser</td>
			<td style="width:59px;">Colbolt</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0594-04-01-0100-300</td>
			<td style="width:245px;">04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability</td>
			<td style="width:59px;">Shanghai Lasers</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">GL532T3-200</td>
			<td style="width:245px;">Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Non-contact style laser to multimode fiber coupler&#160;</td>
			<td style="width:59px;">OZ Optics</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HPUC-23-400/700-M-20AC-11</td>
			<td style="width:245px;">For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 12&#34; x 18&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1213</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 10&#34; x 12&#34; x 1/2&#34;. 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1012</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 4&#34; x 6&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">MB4</td>
			<td style="width:245px;">For blue laser; dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact variable height clamp, 1/4&#34;-20 Tapped</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">CL3</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">3/4&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TR075</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">TR1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">PH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Pedestal Base Adapter</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BE1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Small Clamping Fork</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">CF125</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics with visible laser quality mirror</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">KM100-E02</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Neutral filter density wheel</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">NDC-50C-2M</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; Longpass dichroic mirror 50%</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DMLP505</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">KM100</td>
			<td style="width:245px;">For dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">20-piece hex wrench kit with stand</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TC2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1/4&#34;-20 cap screw and hardware kit</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HW-KIT2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Mounting base 1&#34; x 2.3&#34;x3/8&#34;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">BA1S</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">ADAFCB1</td>
			<td style="width:245px;">Dual FC/PC L-bracket also available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Breadboard lifting handles</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BBH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">&#216;1&#34; Bandpass Filter, CWL = 450 &#177; 2 nm, FWHM = 10 &#177; 2 nm</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FB450-10</td>
			<td style="width:245px;">For use with diode lasers that spontaneously emit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">2. Laser Coupling</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:304px;">! Laser protective eyewear</td>
			<td style="width:59px;">Various</td>
			<td style="width:65px;">One for every user at each wavelength</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;">! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Fiber optic cable tester</td>
			<td style="width:59px;">Eclipse</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">902-186N</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">One-step fiber connector cleaner</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FBC1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.75 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.5 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode&#160;</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Doric mini cube</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">DMC_1x2_FC-2FC</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact power and energy meter console</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">PM100D</td>
			<td style="width:245px;">Digital 4&#34; LCD</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">C-series slim power sensor 5-500mW</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">S130C&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Multiple detectors types are available; check with vendor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">3. In vivo Optogenetic Stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Multimode fiber splitters</td>
			<td style="width:59px;">FONT Canada</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Arbitrary waveform function generator (2 channel)</td>
			<td style="width:59px;">Rigol</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DG1022</td>
			<td style="width:245px;">Can control up to 2 lasers at once</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Fiber optic rotary joint (commutator)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC*</td>
			<td style="width:65px;">6 to 8</td>
			<td style="width:127px;">FRJ_1X1_FC-FC</td>
			<td style="width:245px;">*Also available through Thorlabs and Prizmatix</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:304px;">Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">8</td>
			<td style="width:127px;">MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg)</td>
			<td style="width:59px;">Precision fiber Products</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">SM-CS1140S</td>
			<td style="width:245px;">Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Clear dust caps for &#216;2.5 mm ferrules (25/pkg)&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">CAPF</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">CAPF1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">Thick-jacketed patch cords (custom order)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

Les résultats comportementaux obtenus avec la stimulation in vivo de optogenetic dépendent entièrement sur ​​le circuit neuronal étant ciblée, le modèle animal utilisé, et les paramètres de modulation. Pour fins de démonstration actuelles, les neurones dopaminergiques dans l&#39;aire tegmentale ventrale, ou VTA, de la tyrosine hydroxylase :: souris Cre ont été transduites avec une étape-fonction stable opsine (SSFO) 8, ou le virus de commande (EYFP), et un implant de fibres était chroniquement implanté. L&#39;utilisation de souris transgéniques TH :: Cre assure que opsine expression est restreinte aux cellules TH + (dopamine) dans l&#39;aire tegmentale ventrale. La figure 7 représente les résultats obtenus en utilisant représentatifs du comportement du laser mise en place décrit en cours pour la stimulation simultanée de plusieurs souris. Ici, les souris ont été stimulées relié et en même temps en utilisant des lasers séparés (3 souris / Laser selon la figure 4C) et le comportement locomotrice a été enregistrée pendant 1 heure. Stimulation répétée des neurones dopaminergiques dans le VTA a entraîné unehyperactif phénotype qui a persisté pendant toute la durée de la stimulation. Aucun changement dans le comportement locomoteur a été observée chez les souris EYFP (voir vidéo 1). Après les tests de comportement, immunohistochimie a été effectué pour vérifier ciblage virale exact de neurones dopaminergiques VTA et placement de fibres a été confirmée visuellement (voir Figure 7). <img alt="Figure 1" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig1highres.jpg" /> Figure 1. étapes expérimentales pour la stimulation optogenetic in vivo. Il ya quatre étapes générales impliquées dans la conception et la réalisation in vivo la stimulation optogenetic. Ce protocole détaille notamment les étapes impliquées dans la livraison de la lumière provenant d&#39;une source de lumière laser à des structures profondes du cerveau chez le rongeur de se comporter et comprend 1) l&#39;assemblage du système de couplage de la lumière laser et; 2) stratégies d&#39;attache pour connexion plusieurs animaux à une source de lumière pour les tests de comportement à haut débit et 3) fournit des lignes directrices pour confirmer la stratégie de ciblage pour la livraison la lumière - une étape qui est essentielle pour l&#39;interprétation des données. Note: bien que ce protocole ne est pas exclusive aux fibres implantables chroniques à des fins d&#39;attache, il est recommandé et pris en charge lors de la combinaison avec la stimulation optogenetic tests comportementaux. Voir tant Ung &amp; Arenkiel, 2012 18 et Sparte et al., 2012 9 pour la production et l&#39;implantation de fibres optiques chroniques en interne. Les lignes continues = étapes couvertes par ce protocole. <img alt="Figure 2" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig2highres.jpg" /> Figure 2. Systèmes laser utilisés pour la stimulation optogenetic in vivo. (A) de système laser unique pour la stimulation in vivo. Ce laser est ph<html> ysically pré-couplés par fabricant et nécessite peu d&#39;utilisateur final set-up. (B) système laser double. Deux lasers sont couplées dans une fibre unique par l&#39;utilisation de miroirs qui agissent pour diriger chaque trajet de faisceau en un coupleur de type sans contact. Ce est le plus polyvalent set-up en tant que composants optiques peuvent être retirées ou ajoutées, au besoin, mais présente un plus grand défi en termes de couplage laser efficace. (C) Schéma du système à double laser montré en (B) de placement indiquant des lasers et miroirs avec le trajet du faisceau de lumière laser correspondant (flèches) représenté. Ici, le miroir dichroïque &quot;D&quot; est utilisé pour dévier les longueurs d&#39;onde bleues de la lumière tout en transmettant les longueurs d&#39;onde jaunes à travers le coupleur de &quot;C&quot; et dans le cordon de raccordement de coupleur joint. B = laser bleu; C = coupleur de style non-contact; D = miroir dichroïque; FW = roue de filtre; M = Miroir; Y = laser jaune.obtenir = &quot;_ blank&quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig3highres.jpg" /> Bottom Figure 3. testeur (A) de câble utilisé dans le protocole de couplage non physique:. Testeur de câble directement relié à un cordon de raccordement. Insérer dépeint point de testeur au câble de connexion cordons (B) de Patch référence tout au long de protocole De extérieur vers l&#39;intérieur:.. Multimode séparateur de fibres, noir-chemise animale cordon de raccordement avec le blanc manchon zircone split attaché au-cleave plat (FC) fin, Cordon de raccordement à double paroi épaisse (également dénommé une «corde de coupleur&quot;). Cordons épais enveloppe sont recouvertes avec du chlorure de polyvinyle (PVC) tube pour une protection supplémentaire. Pour ces câbles, les codes de couleurs standard de l&#39;industrie sont utilisés pour distinguer entre les différents types de fibres, où Orange = fibre multimode. cordons de brassage sont des animaux<html> mince à double enveloppe pour permettre la flexibilité pour les mouvements d&#39;animaux au cours des essais de comportement. Notez que la poussière bouchons sont placés sur FC / PC se termine lorsque les câbles ne sont pas en cours d&#39;utilisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig4highres.jpg" /> Figure 4. Stratégies d&#39;attache pour la stimulation optogenetic in vivo de (A) un seul animal, (B) deux animaux; . (C) trois ou quatre animaux configurations possibles ne sont pas limités à ceux ci-dessus - de multiples configurations sont possibles grâce à la combinaison unique d&#39;adaptateurs, séparateurs de fibres, et de branchement des cordons de brassage qui sont disponibles dans le commerce ou en commande spéciale. Remarque: les cordons de raccordement et répartiteurs de fibres contiennent FC / PC connecteurs sur les deux extrémités (une seule extrémité est représenté).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 5" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig5highres.jpg" /> Figure 5. (Rouge x) raccordement correct et incorrect d&#39;un cordon de raccordement à une fibre optique implantable en utilisant une fraction de manches. (Panneau de gauche) A zircone split-manchon est utilisé pour connecter un cordon de raccordement à la virole d&#39;une fibre optique implantable (ici pas apposé à un animal). Flèche pointe vers le point de connexion entre le cordon de raccordement et implantable fibre optique. Comparer à (panneau de droite) où il existe un écart entre le cordon de raccordement et implantable fibre optique, tels que révélés par la fente du manchon de raccordement. Notez la fuite de lumière qui peut se produire avec une mauvaise connexion (en bas à droite). Culot sur upper panneau de gauche représente composants individuels utilisés. De haut en bas de l&#39;insert: Doric implantable fibre optique canule, zircone blanc split-manche, cleeve-plat (FC) fin d&#39;un patch animale cordon noir à double enveloppe (cordon de raccordement complète représentée sur la figure 3B). Dans tous les panneaux, noter que le manchon de raccordement ne est pas de niveau avec la fin de la FC cordon de raccordement. Laissez ~ 0,5 cm d&#39;une plus-accrocher pour la connexion à la fibre optique implantable apposée sur l&#39;animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig5large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig6highres.jpg" /> Figure 6. Side (à gauche) et frontale (à droite) vue d&#39;une souris avec une fibre optique implanté relié à un cordon de raccordement. Utilisez la scission sur le manchon de raccordement pour aider à visualiser une connexion correcte du cordon de raccordement to la virole de la fibre optique implanté. Le point de connexion est mise en évidence par une boîte en pointillé rouge et également représenté dans l&#39;insert supérieure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig6large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig7highres.jpg" /> Figure 7. Les résultats représentatifs. (Gauche) lecture comportementale de la stimulation optogenetic in vivo. Exemple de comportement qui peut être obtenu en utilisant le laser décrit set-up et le protocole d&#39;attache. L&#39;activité locomotrice a été enregistrée pendant la stimulation optogenetic de l&#39;aire tegmentale ventrale (VTA) dans la tyrosine hydroxylase (TH) :: souris Cre (n = 7-8 / groupe) transduites avec soit une étape-fonction opsine (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ) ou le virus de commande (AAV5-DIO-EYFP) dans le VTA. Des groupes de trois souris ont été simultanément attachés à un seullaser comme représenté sur la figure 4C et stimulé par une impulsion de 5 sec de 447 ou 473 nm lumière livré une fois toutes les 15 min. Mesures répétées Two-Way ANOVA ont révélé une interaction significative groupe x temps (F 3,39 = 15,27, p &lt;0,0001) et un effet principal significatif de temps (F 3,39 = 4,67, p = 0,007) selon laquelle la stimulation optogenetic augmentation de l&#39;activité locomotrice seulement chez les souris SSFO (Bonferroni post-hoc p &lt;0,0001, par rapport à t = 0-15 bin de temps), résultant en une augmentation globale de l&#39;activité locomotrice par rapport aux souris EYFP (effet principal de groupe: F 1,39 = 10,69, p = 0,0061; Bonferroni post-hoc p &lt;0,01 à t = 15-30 et p &lt;0,001 à t = 30 à 45 et t = 45 à 60). Fiche d&#39;Fibre: 200 um base, 0,22 NA. Lumière irradiance = 6-66 mW / mm 2, correspondant à la fibre pointe distance de 0,1 à 0,6 mm de virale site d&#39;injection avec la puissance de la lumière de 5 mW émise au bout de la fibre avant tethering. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;erreur standard de la moyenne. EYFPvs SSFO: ** p &lt;0,01; *** P &lt;0,001; effet du temps: #### p &lt;0,0001 (droite) La confirmation histologique du placement virale et fibre optique.. Image de fluorescence confocale acquise sur un Leica TCS microscope à balayage laser SP5 a été utilisé pour visualiser placement de fibres (en pointillés) et d&#39;expression à médiation virale (vert) dans l&#39;aire tegmentale ventrale de souris après la stimulation in vivo dans optogenetic. Les neurones dopaminergiques (TH +) sont considérés en bleu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig7large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Vidéo 1. In vivo la stimulation optogenetic:. Hyperactivité pendant la stimulation VTA utilisant SSFO chez les souris TH :: Cre <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/JOVE_video_1.mov" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellsstimulation = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="5"> Tableau 1. irradiances lumière nécessaire pour activer opsines couramment utilisés. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Opsin Variant </td><td rowspan="2"> λ </td><td rowspan="2"> La densité de puissance (/ mm 2) </td><td></td><td rowspan="2"> Propriétés </td></tr><tr><td> ON / OFF Kinetics </td></tr><tr><td colspan="5"> Excitation optique: channelrhodopsins action rapide </td></tr><tr><td> ChR2 2 </td><td> 470 </td><td> 1 - 5mW </td><td> 1,21 / 12 msec </td><td> Feux jusqu&#39;à 40 Hz </td></tr><tr><td> CHETA 19 </td><td> 490 </td><td> 5 mW </td><td> 0,86 / 8,5 msec </td><td> Incendies jusqu&#39;à 200 Hz </td></tr><tr><td> ChEF 20 </td><td> 450 </td><td> 1,65 mW </td><td> 1,62 / 12 msec </td><td> Forme non-désensibilisation des ChR2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> C1V 18 </td><td rowspan="2"> 540-630 </td><td> 8 mW (540 nm) </td><td> 5/34 msec à 540nm </td><td rowspan="2"> Décalée vers le rouge </td></tr><tr><td> 3,2 mW (630nm) </td><td> 67 ms (sur) à 630nm </td></tr><tr><td colspan="5"> Excitation optique: action lente rhodopsines de canal </td></tr><tr><td> Stable fonction échelon opsine (SFO) 8 </td><td> 470/590 </td><td> 8 mW (470nm) </td><td> 20 msec / 29 min </td><td> La nouvelle version OFS; état plus ouvert. Ouverte par 470 nm, fermé par 590 nm </td></tr><tr><td colspan="4"> Inhibition optique </td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> eNpHR3.0 21 </td><td rowspan="2"> 560-630 </td><td rowspan="2"> 3-5 mW </td><td rowspan="2"> 2,5 ms / &lt;10 msec </td><td> Inhibition soutenue pendant 30 min 22 avec la lumière constante * </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> ArchT3.0 11, 23 </td><td> 520-560 </td><td> 1-5 mW </td><td> 2 / &lt;10 msec </td><td> Plus sensible avec de plus grandes photocourants que eNpHR3.0 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td colspan="5"> Ce tableau est fourni qu&#39;à titre indicatif; irradiances de lumière spécifiques requises pour la modulation de neurones doivent être confirmées de façon indépendante. </td></tr><tr><td colspan="5"> Validation expérimentale est important de vérifier que l&#39;opsine, la stratégie de ciblage, et des paramètres de stimulation neurale lumière modulent cuisson de la manière prévue 5. </td></tr><tr><td colspan="5"> La densité de puissance (mW / mm 2) se réfère à la puissance de la lumière lumineux sur une zone donnée des tissus du cerveau et ne se réfère pas à la puissance lumineuse émise par la pointe de la fibre. </td></tr><tr><td colspan="5"> * Toujours utiliser l&#39;intensité de la lumière le plus bas possible, surtout avec la stimulation lumineuse prolongée. </td></tr></tbody></table> Tableau 1. irradiances lumière nécessaire pour activer opsines couramment utilisés. Abréviations AAV = virus adéno-associé DPSS = état solide pompé par diode <br/&gt; EYFP = amélioré la protéine fluorescente jaune FC / PC = cleave plat / contact physique GFP = protéine fluorescente verte PBS = solution saline tamponnée au phosphate PVC = polychlorure de vinyle mW = milliwatt NA = ouverture numérique SSFO = stable étape fonction opsin TH = tyrosine hydroxylase Logique TTL = transistor-transistor V = tension VTA = aire tegmentale ventrale

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In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

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In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

58.6K vues.  University of Pittsburgh Medical Center. Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.