Cette recherche a été financée en partie par des subventions en aide à la recherche scientifique pour contester la recherche exploratoire (JK), et la recherche scientifique (A) (JK et SM) du ministère de l&#39;Education, la Culture, des Sports, des Sciences et Technologie, Japon . Un RIKEN FPR bourse (RCE) a fourni un appui supplémentaire. Les auteurs expriment leur gratitude à MM. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama et Mami Okamoto pour l&#39;assistance technique avec la RMN et les analyses statistiques.

1. Préparation du filtre pour éliminer extractibles <ol><li> Utilisez de 25 mm de diamètre de 0,22 um des pores de taille Durapore PVDF filtres hydrophiles (Millipore). Placer les filtres dans un bécher propre de 500 ml en pyrex à l&#39;aide des pincettes. Pré-rincer trois fois avec de l&#39;eau distillée. Swirl bien que vous rincer pour éviter les filtres de coller les uns aux autres. Ajouter 300 ml Milli-Q (Millipore) ou l&#39;équivalent en eau de qualité. Autoclave pour faciliter l&#39;enlèvement complet des substances extractibles par les filtres. </li><li> Décanter le Milli-Q et encore rincer trois fois les filtres, cette fois avec Milli-Q. L&#39;utilisation de filtres lieu pincettes individuelles sur une surface propre et sec (comme une feuille d&#39;aluminium) et soit à sec à une température raisonnable (par exemple 37 ° C) ou l&#39;air sec. Les filtres sont maintenant prêt à utiliser. </li></ol> 2. Filtration des matières échantillon <ol><li> Pour démontrer ce protocole, un acier inoxydable Millipore 3-lieu collecteur filtrant avec des colonnes de microanalyse de 25 mm avec filtre en verre prend en chargeet une pompe mécanique sont utilisés. En utilisant une technique aseptique, placer un seul filtre de 25 mm sur la base de la colonne de filtre, appliquer de la colonne et serrer ensemble. </li><li> Chargez 15 ml de l&#39;échantillon à la colonne, ouvrez l&#39;obturateur sur le collecteur filtrant, et tourner sur la pompe. Filtrer sous une légère pression pour minimiser la rupture des cellules (&lt;5 kPa). D&#39;autres pompes, comme la main ou une pompe péristaltique peut être adapté à ce protocole. Pour les échantillons à faible densité, des additions successives d&#39;eau peut être nécessaire, ne laissez pas le filtre est à sec pendant une période prolongée de temps entre les additions d&#39;eau. </li><li> Pour les échantillons marins, après avoir filtré l&#39;échantillon, vous pouvez effectuer une eau douce de rinçage en option pour réduire les ions paramagnétiques résiduelles dans votre échantillon et sur le filtre. Cela peut aider avec le réglage plus précis de l&#39;aimant du spectromètre. Il suffit de douceur ajouter un petit volume d&#39;eau et filtrer à travers votre échantillon prélevé à la fin. </li><li> Une fois que le filtrage est terminé, éteignez la pompe, et de laisser le robinet OPEn Il ya donc encore une pression négative dans le filtre. Retirez la pince et de la colonne filtre. </li><li> Avec une main, utilisez des pinces propres pour prendre la main sur le filtre. Repliez le filtre à travers lui-même, mais ne se froisse pas. Avec votre autre main utiliser la lèvre d&#39;un microtube de 2 ml stérile à maintenir enfoncé le filtre. Libérer la pince de les utiliser pour re-saisir les deux bords du filtre. Regrip à un angle de 45 ° au bercail. </li><li> Placez le filtre dans le tube de 2 ml et la libération de sorte qu&#39;il s&#39;ouvre avec le côté de l&#39;échantillon vers l&#39;intérieur. Vous pouvez placer jusqu&#39;à deux filtres dans le stérile tube de 2 ml de cette façon. Si vous utilisez deux filtres, veiller à ce qu&#39;ils se chevauchent aussi peu que possible. Geler immédiatement (au moins à -30 ° C). </li></ol> 3. Extraction d&#39;une solution aqueuse-solubles métabolites <ol><li> Lyophiliser vos échantillons pendant la nuit ou pendant au moins 10 heures. </li><li> Après lyophilisation, ajouter un concasseur acier inoxydable à chaque tube (Tokken). Ajouter 750 ul de potassium normaliséetampon phosphate de RMN en oxyde de deutérium (2 H&gt; 90%) avec le 2,2-diméthyl-2-silapentane-5-sulfonate (DSS) norme (KPI; 38,3 mM KH 2 PO 4, 61,7 mM de K 2 HPO 4, DSS 0.1 mM, pH 7,0, 90% de D 2 O) 2. </li><li> Sonication des échantillons pendant 5 minutes à 4 ° C dans un sonicateur eau (Bioruptor, Diagenode) pour enlever le matériau cellulaire provenant du filtre. Retirer les filtres avec des pincettes propres. </li><li> Dissocier les cellules en utilisant un broyeur moulin (1600 rpm) pendant 5 minutes. </li><li> Incuber à 65 ° C avec agitation (1400 rpm) sur un agitateur de paillasse (Eppendorf) pendant 15 minutes. </li><li> Retirer le porc de métal avec des pincettes propres, et centrifuger l&#39;échantillon à 13000 g pendant 5 minutes. </li><li> Prélever le surnageant directement à un tube de RMN pour la spectroscopie RMN. </li></ol> 4. La spectroscopie RMN et analyse des données <ol><li> Chargez votre échantillon dans un spectromètre de RMN (ici, un Bruker DRX-500 spectromètre équipé d&#39;Sonde TXI avec triple axe du gradient contrôlé par un ordinateur exécutant xwin-RMN). </li><li> Obtenir 1D spectres RMN 1 H en utilisant des méthodes appropriées publiées précédemment 2,15 à partir de l&#39;interface xwin-RMN. Dans la présente étude 1 H RMN ont été enregistrés sur une exploitation DRX-500 spectromètre à 500,03 MHz à 298 K. signaux d&#39;eau résiduels ont été supprimées par la séquence d&#39;impulsions du Watergate, avec un temps de répétition de 1,2 s. 128 transitoires ont été recueillies pour obtenir 32.000 points de données par spectre. </li><li> Transférer les répertoires de données RMN à un PC installé le logiciel NMRPipe 16. Traiter les données brutes et de la DSS ensemble comme référence 0 ppm ensuite manuellement éliminer les spectres. Numérisez les données spectrales dans un ensemble de valeurs discrètes, en intégrant ou «binning» eux avec des logiciels tels que rNMR, Automics, ou en utilisant le paquet FT2B la disposition du public sur le site Web ECOMICS ( <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> ) 3,17. En eest, par exemple, les spectres ont été intégrés entre 0,5 et 10,5 ppm sur 0,032 ppm régions intégrales en utilisant ECOMICS et normalisées pour soit DSS ou de l&#39;intensité totale du signal. Les données de sortie peuvent maintenant être utilisées pour l&#39;analyse statistique en aval tels que l&#39;analyse en composantes principales (ACP) à l&#39;aide des logiciels gratuits comme R 18. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Un exemple de spectres RMN 1 H obtenu en utilisant les méthodes ci-dessus sont présentés dans la figure 1. Ces échantillons, à partir de deux points dans le temps d&#39;une expérience en microcosme montrent des différences claires en raison de l&#39;activité métabolique des algues. Le jour 4 spectre montre abondance considérable de pics, en particulier dans la gamme 3-4 ppm par rapport à l&#39;échantillon une jour. Ces pics peuvent être attribués à des sucres produits par la floraison des diatomées dans le microcosme. Dans une expérience similaire de comparer la croissance des communautés planctoniques naturelles en eau de mer artificielle ou naturelle, les approches statistiques sette comme tracé analyse en composantes principales score (PCA) provenant de spectres RMN binned peut être utilisé pour montrer clairement les différences métaboliques entre les deux traitements (Fig. 2), alors que les parcelles de chargement peut identifier les pics dans les spectres que la forme de la distribution des données . Ces résultats peuvent être comparés avec les données de niveaux omique autres, tels que des méthodes empreintes génomiques (Fig. 3). Ces pics de RMN peut être interrogé individuellement (par exemple à la BMRB; <a href="http://www.bmrb.wisc.edu/">http://www.bmrb.wisc.edu/</a> ) 19, ou des spectres entière peut être analysé statistiquement (par exemple avec SpinAssign à <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search">http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search</a> ) 2. Dans cet exemple, les différences entre les traitements étaient dus à une abondance de pics dans la région sucres (3,39 ppm à 4,04 ppm) des spectres de métabolites naturels de la communauté de plancton, et plusieurs pics caractéristiques des communautés d&#39;eau de mer artificielle étaient provisoirement identified que le lactate et le formate en utilisant SpinAssign. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Représentant spectres RMN 1 H obtenu à partir d&#39;échantillons transformés en utilisant cette procédure. Échantillons ont été prélevés avant Microcosm (jour 1) et pendant (jour 4) une prolifération de diatomées intense. Des expériences de RMN ont été effectuées sur un appareil Bruker DRX-500 avec des signaux normalisés à la hauteur du pic standard interne (DSS; 0 ppm). <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. L&#39;analyse des principaux composants score de parcelle (PCA) pour les spectres RMN binned de metabolomes de d&#39;origine naturelle communautés planctoniques microbiens cultivés dans des microcosmes avec naturel (losanges vides) ou d&#39;eau de mer artificielle (cercles noirs). Effacer les différences métaboliques peuvent être observés dans le nuage de points. Une parcelle de chargement d&#39;une telle analyse peut ensuite être utilisé pour identifier les pics distincts d&#39;importance dansle système; ces pics peuvent être analysées en fonction des besoins. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Un exemple de multi-omique analyse combinant la RMN avec les données génomiques. Composition de la communauté basés sur l&#39;électrophorèse sur gel en gradient de dénaturation de 18S (à gauche) et 16S (à droite) ARNr provenant des mêmes échantillons analysées dans la figure 2 montre également différents schémas de répartition des communautés microbiennes naturelles entre (losanges vides) et artificiels (cercles noirs) microcosmes d&#39;eau de mer. Cette correspondance entre le métabolome et du génome de systèmes naturels démontre l&#39;utilité de cette approche.

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Bioeng. 110, 87-93 (2010).</li><li>Nakanishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+omics+approach+identifies+nutrition-mediated+microbial+interactions.">Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions.</a> J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).</li><li>Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogeochemical+controls+and+feedbacks+on+ocean+primary+production.">Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production.</a> Science. 281, 200-207 (1998).</li><li>Viant, M. 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Chem. 82, 1643-1652 (2011).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode d&#39;extraction de filtration et de son métabolite démontré ici permet de biomasse planctonique microbienne être collectées en quantité suffisante pour la métabolomique RMN. Bien que l&#39;extraction d&#39;une solution aqueuse ne solubles métabolites en utilisant des KPI et 1D 1 H RMN est démontrée, les solvants d&#39;extraction d&#39;autres approches et spectroscopiques peuvent être utilisés. Un exemple intéressant est l&#39;utilisation de méthanol deutéré comme solvant semi-pola...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 0,22 um PVDF hydrophile Durapore filtres, 25 mm </td><td> Millipore </td><td> GVWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Titulaire Microanalyse filtre, 25 mm, fritte de verre soutien </td><td> Millipore </td><td> XX1002500 </td><td></td></tr><tr><td> 3-lieu collecteur, 47 mm, en acier inoxydable </td><td> Millipore </td><td> XX2504735 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Wako </td><td> 164-04295 </td><td></td></tr><tr><td> Oxyde de deutérium, 2 H&gt; 90% </td><td> Campridge Laboratoties isotopes </td><td> DLM-4 </td><td></td<html> &gt; </tr><tr><td> DSS </td><td> Fluka </td><td> 92754 </td><td></td></tr><tr><td> Automill </td><td> Tokken </td><td> TK-AM4 </td><td> Concasseurs en acier inoxydable inclus </td></tr><tr><td> Thermomixer confort </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 000.011 </td><td></td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200 </td><td></td></tr><tr><td> Évaporateur sous vide </td><td> Eyela </td><td> CVE-3100 </td><td></td></tr><tr><td> RMN </td><td> Bruker </td><td> DRX-500 avec 5 mm de TXI sonde </td><td></td></tr><tr><td> Spectral outil binning </td><td> Développé à l&#39;origine </td><td> FT2DB </td><td> <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> </td></tr><tr><td> Outil d&#39;annotation et de base de données métabolite </td><td> Développé à l&#39;origine </td><td> SpinAssign </td><td>= Nmr_search &quot;&gt; http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search </td></tr></tbody></table>

concentration of metabolites from low-density planktonic communities for environmental metabolomics using nuclear magnetic resonance spectroscopy

L&#39;environnement métabolomique est un domaine émergent qui est de promouvoir la compréhension nouvelle dans la façon dont les organismes de répondre et d&#39;interagir avec l&#39;environnement et l&#39;autre au niveau biochimique 1. La résonance magnétique nucléaire (RMN) est l&#39;un de plusieurs technologies, y compris chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), avec la promesse considérable pour de telles études. Avantages de la RMN est qu&#39;il est adapté à des analyses non ciblées, fournit des informations structurelles et les spectres peuvent être interrogés de façon quantitative et statistique des bases de données récemment disponibles contre des spectres métabolite individuelle 2,3. En outre, les données spectrales de RMN peuvent être combinées avec des données provenant d&#39;autres niveaux omique (transcriptomique, par exemple, la génomique) pour fournir une compréhension plus complète des réponses physiologiques des taxons les uns aux autres et l&#39;environnement 4,5,6. Cependant, la RMN est moins sensible que d&#39;autres techniques de métabolomique, ce qui rend difficile à apnappe à des systèmes microbiens naturels où les populations d&#39;échantillons peuvent être concentrations de faible densité et de son métabolite faibles par rapport à des métabolites de bien défini et facilement extractibles sources telles que les tissus entiers, ou de cellules biofluides-cultures. Par conséquent, les quelques directs sur l&#39;environnement métabolomique de microbes réalisées à ce jour ont été limitées à la culture à base de ou facilement définies à haute densité tels que les écosystèmes d&#39;accueil-symbiotes systèmes, construits co-cultures ou des manipulations de l&#39;environnement intestin, où l&#39;étiquetage des isotopes stables peuvent être en outre utilisé pour amplifier les signaux de RMN 7,8,9,10,11,12. Les méthodes qui facilitent la concentration et la collecte des métabolites de l&#39;environnement à des concentrations appropriées pour la RMN font défaut. Depuis l&#39;attention récente a été donnée aux métabolomique de l&#39;environnement d&#39;organismes dans le milieu aquatique, où une grande partie du flux d&#39;énergie et des matériaux est médiée par la communauté planctonique 13,14, nous avons développé une méthode pour la concentrationtion et l&#39;extraction de l&#39;ensemble de la communauté-métabolites de systèmes microbiens planctoniques par filtration. Disponibles dans le commerce hydrophiles poly-1 ,1-difluoroéthylène (PVDF) filtres sont spécialement traitées pour supprimer complètement extractibles, ce qui peut apparaître autrement en tant que contaminants dans les analyses ultérieures. Ces filtres traités sont ensuite utilisés pour filtrer des échantillons environnementaux ou expérimentaux d&#39;intérêt. Filtres contenant l&#39;échantillon humide sont lyophilisée et une solution aqueuse-solubles métabolites sont extraits directement de la spectroscopie RMN classique en utilisant un tampon phosphate de potassium standardisé d&#39;extraction 2. Données issues de ces méthodes peuvent être analysées statistiquement pour identifier les tendances significatives, ou intégrée à d&#39;autres niveaux omique pour la compréhension globale de la communauté et la fonction des écosystèmes.

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Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Une méthode pour l&#39;extraction de métabolite communautés planctoniques microbiens est présenté. Échantillonnage ensemble de la communauté est réalisée par filtration sur des filtres spécialement préparés. Après lyophilisation, aqueuse-solubles métabolites sont extraits. Cette approche permet une application de la métabolomique environnementaux trans-omique enquêtes de communautés microbiennes naturelles ou expérimentales.

Concentration des métabolites issus de communautés planctoniques à faible densité de l&#39;environnement en utilisant métabolomique résonance magnétique nucléaire

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each ...

concentration-metabolites-from-low-density-planktonic-communities-for

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K vues.  RIKEN Advanced Science Institute. Une méthode pour l'extraction de métabolite communautés planctoniques microbiens est présenté. Échantillonnage ensemble de la communauté est réalisée par filtration sur des filtres spécialement préparés. Après lyophilisation, aqueuse-solubles métabolites sont extraits. Cette approche permet une application de la métabolomique environnementaux trans-omique enquêtes de communautés microbiennes naturelles ou expérimentales.

Vidéo: Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Les communautés microbiennes dans la Nature et de laboratoire - Interview

Recherche

Biologie

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

Marquage in vitro des cellules souches embryonnaires humaines pour l&#39;imagerie par résonance magnétique

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage without prior knowledge of what genes the community might be expressing. Thus it provides the most unbiased perspective on community gene expression in situ. Environmental transcriptomics protocols are technically difficult since prokaryotic mRNAs generally lack the poly(A) tails that make isolation of eukaryotic messages relatively straightforward 1 and because of the relatively short half lives of mRNAs 2. In addition, mRNAs are much less abundant than rRNAs in total RNA extracts, thus an rRNA background often overwhelms mRNA signals. However, techniques for overcoming some of these difficulties have recently been developed. A procedure for analyzing environmental transcriptomes by creating clone libraries using random primers to reverse-transcribe and amplify environmental mRNAs was recently described was successful in two different natural environments, but results were biased by selection of the random primers used to initiate cDNA synthesis 3. Advances in linear amplification of mRNA obviate the need for random primers in the amplification step and make it possible to use less starting material decreasing the collection and processing time of samples and thereby minimizing RNA degradation 4. In vitro transcription methods for amplifying mRNA involve polyadenylating the mRNA and incorporating a T7 promoter onto the 3 end of the transcript. Amplified RNA (aRNA) can then be converted to double stranded cDNA using random hexamers and directly sequenced by pyrosequencing 5. A first use of this method at Station ALOHA demonstrated its utility for characterizing microbial community gene expression 6.

We present a method for generating cDNA from environmental mRNA. In general, total RNA is first collected from the environment, rRNA is selectively removed, mRNA is selectively amplified, and cDNA synthesized from the enriched mRNA pool is sequenced. Recovered sequences can be annotated using standard bioinformatics techniques to identify the expressed genes.

Analysant l&#39;expression de gènes à partir communautés microbiennes marines utilisant Transcriptomique environnement

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Détection de l&#39;oxyde nitrique et de l&#39;anion superoxyde radical par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique à partir de cellules en utilisant des pièges de spin

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Quantifier mélange à l&#39;aide d&#39;imagerie par résonance magnétique

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purification des relevés de notes et de métabolites<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

Enlèvement des matériaux exogènes de la partie extérieure des surgelés Cores d&#39;enquêter sur l&#39;Ancien Communautés biologiques nourrissais intérieur

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

Protocole expérimental pour l’utilisation de drosophile comme un système modèle d’invertébrés pour les essais de toxicité en laboratoire

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /(T1)Magnetic Resonance Imaging

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible synthetic procedures. In this case, starting from FeCl3 and citrate trisodium salt, iron oxide nanoparticles coated with citric acid are obtained in 10 min in the microwave. These nanoparticles present a small core size of 4.2 &#177; 1.1 nm and a hydrodynamic size of 7.5 &#177; 2.1 nm. Moreover, they have a high longitudinal relaxivity (r1) value of 11.9 mM-1&#183;s-1 and a modest transversal relaxivity value (r2) of 22.9 mM-1&#183;s-1, which results in a low r2/r1 ratio of 1.9. These values enable positive contrast generation in magnetic resonance imaging (MRI) instead of negative contrast, commonly used with iron oxide nanoparticles. In addition, if a 68GaCl3 elution from a 68Ge/68Ga generator is added to the starting materials, a nano-radiotracer doped with 68Ga is obtained. The product is obtained with a high radiolabeling yield (&#62; 90%), regardless of the initial activity used. Furthermore, a single purification step renders the nano-radiomaterial ready to be used in vivo.

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /T1Magnetic Resonance Imaging

Here, we present a protocol to obtain 68Ga core-doped iron oxide nanoparticles via fast microwave-driven synthesis. The methodology renders PET/(T1)MRI nanoparticles with radiolabeling efficiencies higher than 90% and radiochemical purity of 99% in a 20-min synthesis.

Synthèse de 68Ga dopée à base d’oxyde de fer nanoparticules pour tomographie par émission de double/imagerie de résonance magnétique (T1)

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;