Le but de cette procédure est d’analyser des extraits de plantes par RMN par décalage pur. Le protocole suivant comprend des aspects clés dans la préparation d’échantillons à partir de différentes matrices de plantes, de feuilles de vanille, de tubercules de pomme de terre et de fruits de groseille à maquereau, ainsi que la procédure RMN détaillée étape par étape pour enregistrer les spectres optimaux de la psyché de changement pur et de la psyché SAPPHIRE. Le profilage métabolique par RMN des protons est l’art d’analyser signal par signal dans la myriade de signaux à l’intérieur des spectres RMN d’un mélange biologique complexe dans le but d’identifier chaque métabolite de ce mélange.
L’objectif est de décrire les biomarqueurs qui pourraient être associés à la chimiotaxonomie, au phénotypage, aux propriétés organoleptiques, à l’appellation d’origine, aux réponses métaboliques, entre autres domaines importants des sciences végétales. La RMN des protons est couramment utilisée dans le profilage métabolique. Cependant, le grand nombre de signaux avec des multiplicités expansées confinées dans une gamme spectrale de produit étroite conduit à un chevauchement important, ce qui complique l’analyse et l’interprétation du spectre.
En règle générale, une seule résonance a une largeur allant de un à cinq Hertz. Cependant, un signal fortement couplé peut se propager dans plus de 25 à 50 Hertz, ce qui augmente la probabilité de chevauchement du signal. Pour surmonter cette limitation, nous appliquons la méthode moderne de RMN à décalage pur pour annoncer la résolution spectrale comme le montre ici dans trois scénarios d’usine différents.
La préparation des échantillons, la préparation des extraits de plantes peuvent être effectuées de plusieurs façons et la procédure dépendra de la matrice. Les fruits de la groseille à maquereau du Cap ont d’abord été homogénéisés en un jus. Les feuilles de vanille ont été utilisées intactes et les pommes de terre ont été coupées en tranches à l’abri de l’oxydation.
Dans tous les cas, la matière a été lyophilisée, broyée puis extraite. Pour les fruits de la groseille à maquereau du Cap et les pommes de terre, de l’eau a été utilisée pour l’extraction, aidée par sonication. Le surnageant a été récupéré par centrifugation, tout liquide a été séché par lyophilisation ou speed vac.
L’extrait sec a été remis en suspension dans un tampon d’oxalate, s’est évaporé jusqu’à ce qu’il soit sec et a été redissous dans du D2O contenant du TMSP. Dans le cas de la vanille, l’extraction a été directe à l’aide d’un tampon phosphate deutéré contenant du TMSP et du méthanol deutéré. Le surnageant a également été récupéré par centrifugation.
Tous les échantillons ont été filtrés à travers un filtre à seringue en PTFE, et les tubes RMN ont été remplis de 0,6 millilitre de solution filtrée. La préparation des échantillons en métabolomique RMN est essentielle. Étant donné que la procédure sera répétée peut-être des centaines de fois, elle doit être préparée exactement de la même manière, afin de garantir que la variance observée n’est pas due à la préparation de l’échantillon, mais à des différences réelles entre les plantes étudiées.
RMN à décalage pur. Le spectre RMN est obtenu après transformée de Fourier du signal FID. Le signal FID peut être décomposé en deux composantes, la modulation par décalage chimique et la modulation de couplage J responsable du modèle de séparation du couplage J.
La modulation de couplage J pourrait être recentrée par un élément de refocalisation de couplage J, qui inverse sélectivement les spins passifs tandis que les spins actifs ne sont pas affectés. Après deux retards égaux, le couplage chimique J est entièrement recentré sur lui. L’élément Psyche basé sur une expérience anti-z-COSY est l’un des éléments de recentrage à large bande les plus robustes et les plus sensibles, des propriétés qui le rendent adapté à la métabolomique RMN.
Les expériences de décalage pur sont basées sur le recentrage de l’évolution du couplage J pendant l’enregistrement du décalage chimique. Ceci est généralement accompli en augmentant les délais afin de déplacer le point de recentrage du couplage J. Comme le décalage chimique évolue à une fréquence plus élevée que le couplage J, une expérience découplée homonucléaire peut être enregistrée sous forme d’interférogramme.
L’acquisition d’un interférogramme, consiste à enregistrer le FID par petits morceaux avec le point de recentrage de l’évolution du couplage J, coïncidant toujours avec le centre du morceau acquis. Le FID découplé est construit en concaténant chaque bloc successif. Configuration de l’acquisition des données RMN, transférez les échantillons vers le spectromètre RMN.
Réglez et assortissez la tête de la sonde, verrouillez et calez l’échantillon. Calibrez l’impulsion dure de 90 degrés. Exécutez un spectre RMN de protons 1D standard.
Expérience psyché. Sélectionnez la séquence d’impulsions 1D de la psyché réinitialisée dans la bibliothèque Bruker TopSpin. Réglez la largeur du spectre sur cinq kilohertz.
La relaxation de récupération retarde à au moins une ou deux secondes. Le mannequin scanne jusqu’à 16. Le nombre de balayages à 64 ou 128 et le nombre de points de données complexes par bloc, soit 64 ou 128, définissent l’excitation souhaitée de l’angle de retournement de l’impulsion chirp.
Un bon entre la sensibilité et les artefacts de recouplage faible est de régler la constante de 61 à 20 degrés, 10 kilohertz pour la bande passante de l’impulsion de chirp. Réglez la durée de l’impulsion dure sur le volume précédemment calibré et la durée de l’impulsion de la forme psychique sur 30 millisecondes. Choisissez l’Crp_psyche.
Impulsion de 20 formes pour l’élément Psyché. L’intensité du gradient de champ d’impulsion appliqué pendant l’élément psyché est normalement réglée entre un et 4 % de l’intensité maximale du gradient en fonction de la sonde. Choisissez RECT.
1 pour l’impulsion de forme de dégradé. Définissez le nombre de blocs à acquérir pour reconstruire le FID de décalage pur. En règle générale, 16 ou 32 blocs avec 64 ou 128 points complexes par bloc fourniront une résolution numérique suffisante, parcourront le spectre et traiteront les données.
Avec le programme AU proc_reset de Bruker, puis la transformée de Fourier. Nous recommandons de transformer le spectre en utilisant un remplissage zéro et une apodisation en cloche sinusoïdale. Psyché est une expérience d’interférogramme pseudo 2D.
Il s’agit d’un logiciel à partir d’artefacts périodiques de portée latérale arrivant de l’évolution du petit couplage J lors de l’acquisition de chaque bloc qui varient généralement de cinq à 20 millisecondes dans l’analyse du composé pur, ces artefacts peuvent être négligés car ils représentent normalement moins de 5% du pic parent. Cependant, dans les mélanges complexes, l’artefact de portée latérale de certains métabolites pourrait être aussi grand ou plus grand que le signal de métabolites moins concentrés, compromettant la précision de l’analyse métabolique. Ces artefacts peuvent être efficacement éliminés à l’aide d’une expérience de modification de la psyché appelée SAPPHIRE psyche développée dans l’expérience SAPPHIRE psyche du Morris Lab.
Pour obtenir le spectre découplé, la séquence d’impulsions acquiert de petits morceaux de refocalisation FID dans le couplage J au milieu de chaque bloc. Cependant, une petite évolution du couplage J se produit au cours de chaque bloc et génère les artefacts périodiques de la bande latérale. L’expérience SAPPHIRE est une modification de la séquence psychique régulière dans laquelle ces artefacts périodiques sont éliminés par une modulation de phase systématique, obtenue par décalage du point de refocalisation J.
Après l’ajout de chaque modulation de phase, l’évolution résiduelle du couplage J est fortement supprimée, ce qui donne un spectre de décalage pur beaucoup plus propre. Sélectionnez la séquence d’impulsions SAPPHIRE psyche et réglez les paramètres de la séquence d’impulsions. Cette séquence n’est pas dans le répertoire de Bruker, cependant, la séquence et les programmes de traitement peuvent être obtenus sur le site Web du groupe de méthodologie RMN de Manchester.
Les paramètres standard sont définis sur les valeurs suivantes : une largeur spectrale de cinq kilohertz, au moins une ou deux secondes de retard de relaxation. 16 balayages factices, huit ou 16 balayages par incrément et D2 réglé sur 14 millisecondes. Ce paramètre garantit que la relaxation T2 reste constante à chaque incrément de modulation J.
Réglez la valeur d’excitation souhaitée de l’angle de retournement de l’impulsion du chirp et la bande passante de l’impulsion. Réglez la durée de l’impulsion dure sur la valeur précédemment calibrée et la durée de l’impulsion de la forme psychique sur 30 millisecondes. Choisissez la forme PSYCHE_Saltire_10kHz_30m l’impulsion pour l’élément psyché.
Réglez l’intensité du gradient de champ d’impulsion appliqué pendant l’élément psyché. Choisissez RECT. 1 pour la forme dégradée.
Réglez le nombre d’incréments de modulation Sapphire J dans F2, normalement huit incréments assurent une excellente suppression des artefacts de bande latérale. Définissez les fenêtres spectrales F1 et F2 calculées à partir de la valeur de la fenêtre spectrale F3 sélectionnée à l’aide des expressions suivantes. La durée pure du bloc de décalage décrite comme une sur SW1 est généralement définie entre 20 et 40 millisecondes.
Définissez le nombre de blocs de décalage pur. Étant donné que la psyché SAPPHIRE doit compenser la modulation de phase de découplage du premier bloc, un bloc supplémentaire doit être ajouté. En règle générale, 17 ou 33 blocs donnent une résolution numérique suffisante.
Traitez les données, exécutez dans le pm_pshift et les programmes AU pm_fidadd suivis de la transformée de Fourier, nous recommandons de transformer le spectre en utilisant le remplissage zéro et d’attribuer l’apodisation en cloche. Les résultats de l’expérience SAPPHIRE Psyche augmentent la résolution des spectres en réduisant les résonances couplées en jolis singlets dièses, comme on le voit dans trois matrices végétales différentes. Feuilles de vanille, fruits de Physalis Peruviana et tubercules de pomme de terre avec des multiplicités du complexe SAPPHIRE Psyche par exemple, les hydrogènes hautement couplés de l’acide homocitrique qui génèrent des signaux presque continus s’étendant jusqu’à 40 Hertz se sont refondus en trois singuets pointus.
Réduire l’encombrement qui pourrait masquer d’autres signaux dans la zone. La résolution gagnante a également permis de démêler clairement la région fortement chevauchée entre 2,6 et 2,8 PPM dans laquelle l’acide homocitrique est lactone et les résonances d’acide malique apparaissent. Les biomarqueurs clés de la vanille, par exemple, dont les signaux se chevauchent avec ceux des glucosides dans la RMN régulière des protons, ont été mieux identifiés dans les spectres SAPPHIRE en raison de ce gain de résolution exceptionnel. Conclusions.
Pure shift est un excellent nouvel outil pour la métabolomique végétale. Il a considérablement augmenté la résolution spectrale et permet donc une identification plus facile des métabolites, une analyse métrique de corrélation plus fine et une meilleure interprétation de l’analyse multivariée. Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la façon de préparer différents extraits de plan pour l’analyse RMN et de la façon d’enregistrer la psyché de décalage pur optimale et le spectre de la psyché SAPPHIRE.
