Les travaux pour ce projet a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health R01-NR5339 et de la Uniformed Services University de la Santé de Sciences-R061LD.

1. L&#39;isolement et la préparation des artères Pial <ol><li> Alors que le rat est anesthésié et insérez sécurisé d&#39;un cathéter dans une artère et perfuser avec 1% de bleu Evans dans du PBS 1X. Vaisseaux Pial tache bien avec le bleu Evans rendant plus faciles à isoler. </li><li> Extrait du cerveau et de conserver à -70 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. Idéalement, les cerveaux doivent être stockés plus de 2 mois. </li><li> En utilisant un microscope à dissection retirer artérioles piales (diamètre moyen de 35 à 50 um) de la surface du cerveau. Retirer avec précaution toutes les artérioles colorées en bleu à partir dorsale et latérale de la surface du cortex à l&#39;aide à pointe fine pince. Retirez l&#39;excès de tissu cortical adhérente avant de placer dans le fixateur. </li><li> Fixer les artérioles récoltés dans du paraformaldéhyde à froid à 2% dans 0,1 M PBS pendant 30 min. </li><li> Pour préparer les artérioles pour sectionner versez milieu d&#39;inclusion sur le gel du disque / Chuck (fixé à -20 ° C). </li><li> Placez la section artériole à plat sur le mandrin uneND attendre qu&#39;il gèle. Fermement placer le récipient en haut à droite sur le disque de gel cryostat sur l&#39;intégration des médias avec le bout de l&#39;artère en face de vous. Tenez avec des pincettes jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit solidement gelé. </li><li> Placez le disque de congélation avec le navire dans la tête et couper cryostat 8 anneaux um artériole piales avec le cryostat. </li><li> Montez les sections artériole sur le chrome-potassium-gélatine diapositives subbed. </li><li> Stocker les lames préparées dans une boîte de glisser dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant la nuit. </li></ol> 2. ER-α en immunofluorescence Jour 1 <ol><li> Retirez les diapositives du réfrigérateur et amener chacun à température ambiante. </li><li> Pour laver les lames versez 1 à 1,5 ml de PBS 0,1 M (assez pour couvrir toutes les sections) laissez reposer pendant 10 minutes, égoutter et répéter la procédure à deux reprises. Chaque bord de la diapositive a un marqueur hydrophobe. Par conséquent, le liquide reste sur la surface de la lame. Avec chaque lavage, le liquide est verséet remplacé par du PBS frais 0,1 M. </li><li> Incuber les lames dans 1 ml de chlorure d&#39;ammonium 50 mM pendant 30 min à température ambiante pour réduire la fluorescence endogène. </li><li> Laver les lames dans du PBS 0,1 M 3x10 min. telle que décrite au point 2.2 </li><li> Diapositives bloc de 0,1% de Triton X-100, plus 1% de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS pendant 30 min. pour réduire la liaison non spécifique. </li><li> Incuber les échantillons avec l&#39;anticorps primaire (polyclonal de lapin anti-ER-α; 1:500) dans du PBS + 0,1% de Triton-X + 1% de NGS nuit à 4 ° C. </li></ol> Jour 2 <ol start="7"><li> Retirez les diapositives du réfrigérateur et amener chacun à température ambiante. </li><li> Laver les lames dans du PBS 0,1 M 3x10 min. telle que décrite au point 2.2 </li><li> Incuber avec Oregon Green 488 secondaire anti-lapin de NGS 1% 0.1% de Triton-X100 + PBS pendant 2 heures dans le noir à température ambiante. A partir de cette étape, les prochaines étapes qui doit être fait dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les lames dans du PBS 0,1 M 3x10 min. telle que décrite au point 2.2 </li><li> Sous un VECapuche ntilated, placez 1 goutte de 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), plus les médias de montage sur les navires et ensuite placer une lamelle sur l&#39;échantillon. </li><li> Appliquer à ongles vernis transparent pour sceller les bords de la lamelle. Ne pas déplacer les diapositives jusqu&#39;à séchage complet, ce qui prend environ 24 heures. </li></ol> 3. Numérique imagerie par fluorescence <ol><li> Pour l&#39;imagerie ER-α dans la cuve piales tranche, nous utilisons un Nikon Eclipse 80i numériques microscope à fluorescence avec des filtres pour 3 couleurs (bleu, vert et rouge) équipé d&#39;une caméra numérique. </li><li> Insérer les diapositives préparées avec les segments tachés navire piales sous le microscope et à s&#39;adapter à visualiser les zones marquées par fluorescence d&#39;intérêt. Démarrer à un grossissement x100 x600, puis augmenter à un grossissement. </li><li> Utilisez l&#39;appareil photo pour capturer des images dans DAPI (bleu) et FITC (vert) pour les chaînes de noyaux de cellules (DAPI) et ER-α (Oregon Green) en utilisant le logiciel Nikon étendue accent Profondeur de convertir de vue multipless de segments de navire dans images 2-D. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Nous avons localisé récepteurs d&#39;estrogènes α dans les artères piales aide de sondes fluorescentes et optimisé notre visualisation des récepteurs numériques en utilisant la microscopie à fluorescence. Pour détecter la présence du récepteur, un lapin d&#39;anticorps polyclonaux primaire et une verte l&#39;Oregon 488 anticorps secondaire marqué a été utilisé pour l&#39;image des récepteurs dans les artères piales isolé de la surface du cerveau. En outre, un colorant nucléaire (DAPI) a été utilisé pour identifier les noyaux des cellules et déterminer si nous avons pu détecter des récepteurs situés dans le noyau depuis ER-α a été signalé à être présents dans les cellules cyotosol et le noyau. En outre, nous avons mené des expériences de confirmation pour valider la spécificité de l&#39;anticorps primaire et de vérifier la liaison de l&#39;secondaires à l&#39;anticorps primaire. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="Figure 1"/><br/&gt; Figure 1. La coloration par immunofluorescence pour ER-α (vert) et une contre-coloration au DAPI (bleu) dans un anneau artères piales isolées de cerveau de rat femelle. Figure 1A montre les images fusionnées suggérant la présence de certains oestrogènes récepteurs intranucléaires une. (Flèche) Fig 1B et 1C sont l&#39;image focalisée sur ER-α qui est une combinaison d&#39;images Z-stack. Les images ont été prises à un grossissement x600 et de l&#39;anneau de coupe de la même navire dans des plans différents. Les flèches indiquent les récepteurs d&#39;estrogènes α. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. La coloration par immunofluorescence pour les groupes de contrôle dans un anneau de l&#39;artère piales isolées de cerveau de rat femelle. Figure 2D montre le navire sans anticorps primaire. 2E figure montre le navire sans l&#39;anticorps secondaire (autofluorescence noter distincts le long du côté endothélial). Les images ont été prises à un grossissement x600 et de l&#39;anneau de coupe de la même navire dans différent des avions.

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	<li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+compounds,+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels.">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li><li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+actions+of+estrogens:+functional+implications.">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li><li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+effects+of+oestrogen:+multiplicity+of+action.">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li><li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels:+regulation+by+estrogen.">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li><li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha,+but+not+-beta,+in+en+face+arterial+endothelium.">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li><li>Fritschy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+my+antibody+staining+specific?+How+to+deal+with+pitfalls+of+immunohistochemistry.">Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry.</a> Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).</li><li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation.">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li><li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP.">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li><li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery.">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li><li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity.">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li><li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection:+procedures+in+immunohistochemical+studies.">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li><li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+immunoreactants.">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li></ol>

Les opinions exprimées sont celles des auteurs et ne reflètent pas la politique ou la position officielle de l&#39;Uniformed Services University Health Sciences de l&#39;, le ministère de la Défense ou le gouvernement des Etats-Unis.

Auparavant, nous avons montré que, après une lésion cérébrale transitoire globale ischémique de la capacité des artères piales de changer de diamètre en réponse aux deux vasodilatateurs 7, 8 et 9 vasoconstricteurs est nettement déprimée chez les jeunes rats ayant subi une ovariectomie. Réplétion oestrogène chronique restaure réponses vasomotrices 7-9. En outre, le remplacement d&#39;oestrogène retardé renverse les effets bénéfiques des œstrogènes sur l&#39;artère la capacité de vasodilatation piales 10 nous conduit à se demander si l&#39;épuisement oestrogènes à long terme affecte ER-α densité dans le cerebrovasculature. Nous avions prévu d&#39;utiliser l&#39;étiquetage immunofluorescence combiné avec Western blot pour évaluer les changements dans les ER-α expression en réponse à l&#39;épuisement des oestrogènes chronique. Parce que nous avons eu quelques difficultés dans la visualisation des groupes discrets de récepteurs, nous avons modifié la méthode que nous démontrons ici. Par conséquent, notre objectif principal dans cette étude était de développer d&#39;abord une méthode relativement simple pour optimiser le visuelsation des récepteurs dans les artérioles piales. En accord avec plusieurs rapports 6,11,12 nous avons jugé nécessaire de faire des ajustements pour le type de tissu nous sonder, l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon, la répartition des ER-α dans la cuve, ainsi que le degré de liaison non-spécifique . Notre méthode est très efficace de visualiser la présence de ER-α en tranches navire piales. Mais comme d&#39;autres l&#39;ont déjà souligné la bonne utilisation de ces méthodes est très dépendante de la spécificité et des concentrations de l&#39;anticorps, la localisation subcellulaire des protéines d&#39;intérêt, la fixation et le blocage des protocoles et 12 manipulation des tissus. Avant de visualisation de nos préparatifs, nous avons passé des navires de temps pour travailler sur toutes ces variables. Nous avons souligné combien nous avions besoin d&#39;ajuster certains de notre approche dans ce document. Nous avons cherché à visualiser de manière optimale ER-α dans les artérioles piales et cela a présenté un certain nombre de défis.Tout d&#39;abord, la taille moyenne d&#39;une artère de rat piales est entre 35-50 um faisant l&#39;isolement et le retrait de la surface du cerveau assez délicat. Nous avons constaté que la perfusion avec bleu Evans avant le sacrifice fait la dissection des artères plus facile. Bleu Evans peut affecter la fluorescence, mais nous pensons que l&#39;avantage d&#39;utiliser ce colorant l&#39;emportent sur ses inconvénients mineurs. Dans notre protocole, les navires sont lavées plusieurs fois. Cela minimise le colorant résiduel dans les vaisseaux et réduit les effets possibles de la teinture sur la fluorescence. Une autre difficulté rencontrée est que l&#39;épaisseur de la pie-mère fait les segments de flotte visualisation claire des récepteurs difficile. De plus, nous n&#39;avons pas pu obtenir des images particulièrement claires probablement dû au fait que les ER-α a été dispersée à travers plusieurs couches de cellules. Nous avons essayé de travailler avec des tranches de navires longitudinales (comme d&#39;autres l&#39;ont), mais en raison de la petite taille piales il était difficile de gérer les navires et éviter la torsion des vaisseaux pendant le montagesur des lames, même à l&#39;aide d&#39;un microscope. Enfin, nous avons réussi modifié notre technique en utilisant un cryostat et la découpe du navire de la Croix-sage dans les anneaux à 8 um d&#39;épaisseur. Les anneaux sont plus faciles à manipuler et à plusieurs peut être monté sur une glissière. Une fois que nous avons acquis les bateaux nous avons jugé nécessaire de tester l&#39;efficacité du premier flash geler le tissu, puis fixer les vaisseaux comme suggéré par Danseshatalb et associés 11. Bien que nous avons trouvé immunofluorescence de fond un peu moins, nous avons également noté que les récepteurs tachés moins intensément rendant la visualisation des récepteurs plus difficile. Par conséquent, nous préférons d&#39;abord de geler l&#39;ensemble du cerveau et de stocker jusqu&#39;à ce que nécessaire (généralement entre 1-2 mois). Nous avons ensuite retirer les vaisseaux tels que décrits et fixer les bateaux avant le tranchage avec le cryostat. comme nous le démontrons ici. Une étape nécessaire consiste à exécuter des contrôles à la fois avec le primaire et l&#39;anticorps secondaire séparémentpour déterminer la spécificité et l&#39;immunofluorescence fond. Récepteurs aux œstrogènes α-anticorps peut être difficile de travailler avec. En fait, nous avons essayé trois différents anticorps primaires (1 et 2 monoclonal polyclonaux) avant que nous soyons satisfaits de la réussite de notre coloration récepteur. Dans le cadre de nos contrôles nous avons d&#39;abord vérifié la spécificité de l&#39;anticorps primaire par omission de l&#39;ajout de l&#39;anticorps primaire. Figure 2D montre le navire sans anticorps primaire. Il n&#39;ya pas de coloration et juste un signal de fond peu. Depuis l&#39;anticorps primaire est polyclonale, il ya une certaine coloration fond diffus non spécifique. Deuxièmement, nous avons ajouté l&#39;anticorps primaire, mais pas l&#39;anticorps secondaire (Fig. 2E). On peut voir une belle marge représentant la autofluoresence le long des frontières endothéliales des vaisseaux. Ceci est cohérent avec le travail de Dan et associés 5. Toutefois, ni les petits points de l&#39;immunofluorescence qui représentent ER-α, ni la ref aspect granuleuxlecting la présence de nombreux récepteurs peuvent être détectées sans la combinaison de deux anticorps primaires et secondaires. Nous avons noté une tendance distincte des autofluoresence le long des marges endothéliales des vaisseaux. Ces tests indépendants pour la spécificité des anticorps sont importants car ils confirment la spécificité de l&#39;anticorps pour ER-α et l&#39;anticorps secondaire se lie à la primaire. En conclusion, comme l&#39;a démontré par d&#39;autres 4, 5 vaisseaux sanguins du cerveau contiennent de nombreux ER-α sous-type de récepteurs. Dans nos mains, la préparation de la Croix-8μm tranches transversales du isolées artères piales améliore la coloration et la visualisation des récepteurs. Les méthodes traditionnelles utilisent la microscopie confocale pour examiner les échantillons. Ayant la capacité de visualiser des sections optiques de série à partir de spécimens d&#39;épaisseur est un avantage important de la microscopie confocale. Toutefois, l&#39;achat d&#39;un microscope confocal à bonne peut être très coûteux. En utilisant Extended Depth (FED) de logiciels, nous avons constaté quepourraient réduire nos coûts d&#39;équipement. En utilisant un microscope à fluorescence avec EDF, nous avons obtenu des images claires et sont capables de visualiser piales artérielle ER-α sur plusieurs niveaux en utilisant Z-piles. Un avantage significatif du logiciel d&#39;EDF est qu&#39;il permet la capture d&#39;image de manière à créer efficacement une image 3-D à partir des images. Pour les laboratoires qui n&#39;ont pas accès à un microscope confocal ou les fonds pour acheter un microscope numérique fluorescent avec le logiciel approprié peut être une option pratique et moins coûteux en fonction des objectifs de l&#39;enquêteur.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Bleu Evans </td><td> Sigma </td><td> E-2129 </td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Sigma </td><td> P-5493 </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek octobre Compound </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Le chlorure d&#39;ammonium </td><td> Sigma </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td></tr><tr><td> Sérum de chèvre normal </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> Anticorps de lapin polyclonal ER-α </td><td> Santa Cruz </td><td> H-184 </td></tr><tr><td> Oregon Green 488 chèvres de lapin anti-IgG </td><td> Invitrogen </td><td> O-11038 </td></tr><tr><td> Vectashield de montagemoyenne pour fluorescence avec DAPI </td><td> Vecteur Lab </td><td> H-1200 </td></tr></tbody></table>

imaging of estrogen receptor-&alpha; in rat pial arterioles using a digital immunofluorescent microscope

Beaucoup d&#39;effets de l&#39;oestrogène sur la réactivité vasculaire sont médiés par l&#39;interaction avec une récepteurs d&#39;oestrogène, 2, 3. Bien que deux sous-types existent (récepteurs des œstrogènes α-β et l&#39;), récepteurs d&#39;estrogènes α a été identifié dans les muscles lisses et des cellules endothéliales de la pie-mère segments artériels utilisant une coloration fluorescente combinée avec la microscopie confocale à balayage laser 4. Par ailleurs, ER-α est située dans les noyaux et dans le cytoplasme des artères basilaires de rat 5. Les récepteurs sont abondantes et fluorescentes vives, mais la visualisation claire des groupes discrets de récepteurs est difficile sans doute à cause du nombre de couches de cellules situées dans de nombreux segments de vaisseaux piales. De plus, de nombreux rapports en utilisant des techniques d&#39;immunohistochimie couplé à la microscopie confocale mal en détail les exigences essentielles pour la reproduction des expériences 6. Notre objectif pour cet article est de décrire une technique simple pour optimiser tIl coloration et la visualisation des ER-α en utilisant transversale des tranches de artérioles piales obtenir de cerveaux de rats femelles. Nous avons d&#39;abord perfuser rats avec bleu Evans pour identifier facilement les artères piales de surface dont nous isolons dans un microscope à dissection. L&#39;utilisation d&#39;un cryostat à la tranche de 8 um sections des artères nous permet d&#39;obtenir des coupes fines cuve pour que les avions des navires différents sont plus clairement visibles. Coupe à travers le navire plutôt que l&#39;utilisation d&#39;un segment de vaisseau petite a l&#39;avantage de faciliter la visualisation des couches endothéliales et musculaires lisses. En outre, l&#39;utilisation d&#39;un microscope numérique immunofluorescence avec le logiciel de profondeur prolongée produit des images claires de dix à douze avions navire différente et est moins coûteuse que l&#39;utilisation d&#39;un microscope confocal à balayage laser.

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Imaging of Estrogen Receptor-&amp;#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Le but de cet article est de démontrer une méthode pour optimiser la détection par immunofluorescence des récepteurs d&#39;estrogènes α (ERa) chez le rat piales tranches artérielle en utilisant un microscope numérique immunofluorescence.

Imagerie des récepteurs d&#39;estrogènes α chez le rat artérioles Pial aide d&#39;un microscope numérique immunofluorescence

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

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Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

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Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

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Biologie

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

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Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

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The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

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Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

La mise en œuvre d&#39;un système anti-Stokes cohérente Raman Scattering (CARS) sur un Ti: saphir et microscope à balayage laser OPO Based Laser Standard

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Visualisation et quantification de la couche acellulaire en artérioles du muscle Cremaster Rat

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un protocole automatisé pour l&#39;analyse rapide de la population de fibre musculaire chez le rat Muscle Sections Cross Utilisation myosine chaîne lourde immunohistochimie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

Détection des Ligands oestrogéniques dans les produits de soins personnels à l’aide d’une levure oestrogène écran optimisé pour le laboratoire d’enseignement de premier cycle

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Techniques de phénotypage micron-échelle de maïs faisceaux vasculaires issu de tomographie à rayons x Microcomputed

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Isolement des hépatocytes primaires de rat avec contrôle de perfusion multiparamétrique

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...