Interne des fonds institutionnels et les sciences biologiques Scholars Program à l&#39;Université du Michigan ont soutenu ce travail.

Préparation Worm <ol><li> Transfert vers L4 larvaires à des plaques appropriées 18-24h avant d&#39;imagerie 22. Cela permettra d&#39;assurer que vous avez œuvées adultes pour un approvisionnement suffisant d&#39;embryons précoces. </li><li> Préparer des tubes de vaseline et d&#39;agarose. Nous préparons plusieurs tubes Falcon 15 ml par fusion dans un bécher de vaseline dans le micro-ondes et de distribution en aliquot 4-5 ml par tube. De même fondre 2-3% (p / v) agarose dans un tampon (Buffer M9 ou oeufs) et aliquot 4-5 ml dans des tubes Falcon. Attention à ne pas faire bouillir à l&#39;excès afin de minimiser l&#39;évaporation. Le jour de l&#39;imagerie, faire fondre 1 tube de vaseline dans un bloc de 65-70 ° C chaleur et faire fondre 1 tube d&#39;agarose dans le micro-ondes, encore une fois être prudent afin de minimiser bouillante sur. Stocker les tubes dans le bloc de chaleur pour maintenir la vaseline et l&#39;agarose à l&#39;état fondu. </li><li> Faire Agarose pad. Position une lame de microscopie nouvelle entre deux glissières de guidage, qui sont des diapositives couvert par une seule couche de ruban laboratoire commun adhéré au haut et au bas de chaque diapositive guide. Utiliser une pipette Pasteur à bout rompu de placer 2-3 gouttes de fondue d&#39;agarose sur la nouvelle diapositive. Couvrir avec une perpendiculaire 2 e diapositive à la diapositive originale, de sorte qu&#39;il couvre et contribue à répandre l&#39;agarose à créer un coussin mince carré. La diapositive 2 ème doit reposer au-dessus du ruban adhésif sur les diapositives guide. La concentration d&#39;agarose peut être porté à 5% pour les plus épais coussinets. </li><li> En utilisant un microscope à dissection et un fil de platine &quot;pick&quot;, vers le transfert adulte 2 à une baisse de 9-12μL de tampon M9 ou d&#39;oeufs sur une lamelle de 18 mm x 18 mm. </li><li> Couper Worms Open avec une aiguille (nous utilisons 27G1 / 2 aiguilles) ou d&#39;un scalpel pour libérer embryons. Essayez de couper au milieu du ver. </li><li> Basse Agarose pad (avec le côté agar bas) sur la lamelle mm 18x18 contenant les embryons. Agar Garniture s&#39;étendant depuis le bord de la lamelle avec une lame de rasoir. </li><li> Recouvrir les phoques en utilisant un pinceau ou mince bâton de bois pour appliquer la vaseline fondue à toutes les quatre bords de la lamelle. </li></ol> Alternative aux montages agar sont des gouttes pendantes 23 si les embryons sont sensibles à la pression (c&#39;est à dire si la coquille d&#39;oeuf ne se forme pas correctement). L&#39;imagerie peut également être effectuée in utero à suivre la fécondation ou événements précoces tels que la méiose. Worms devrait être anesthésiés avec lévamisole 24. Afin d&#39;augmenter le nombre d&#39;embryons à partir d&#39;un stade particulier de développement, plusieurs vers peuvent être disséqués en une seule fois et les embryons placés ensemble doucement avec une pointe fine pipette ou une brosse à cils ou par pipetage à la bouche. 4D Nomarski DIC (Contraste interférentiel différentiel) Films <ol start="8"><li> Allumez le microscope Olympus BX61. Parce que la caméra est sensible aux ondes EM émis par d&#39;autres appareils, il est allumé dernière, l&#39;ampoule au mercure (si nécessaire pour la GFP ou de fluorescence) en premier. Micro Start-Manager une fois que tout est en marche. Choisissez le fichier de configuration approprié pour l&#39;imagerie DIC ou fluorescent. La différence majeure est que le fichier DIC ne comprend pas le contrôle de l&#39;obturateur fluorescentes. Chaque fichier sélectionne également le cube filtre approprié et la mise en gain de la caméra. </li><li> Trouver des embryons sur le microscope en utilisant l&#39;objectif 10x. Rechercher près des organes ver pour des groupes de jeunes embryons afin d&#39;obtenir plusieurs embryons dans le domaine de l&#39;imagerie. Évitez les embryons à l&#39;intérieur du ver pour obtenir les meilleurs images. </li><li> Utilisation du commutateur logiciel à un plus fort grossissement (40x à 100x) et la résolution (NA 0,9 à 1,4) pour l&#39;imagerie objective. </li><li> Ajustez Nomarski Optique DIC (Les sites Web suivants contiennent des explications utiles de l&#39;optique DIC et la terminologie; <a href="http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html">http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html</a> http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html) <ol class="lalpha"><li> Sur notre Olympus BX61 les éléments importants sont: <ol><li> Polarisant - le curseur en bas du condenseur </li><li> Condenseur de Wollaston Prism - tourelle sur le condenseur, juste en dessous de la scène. </li><li> Objectif Wollaston Prism - curseur ci-dessous les cubes de filtre </li><li> 2 ème Polarisant (Analyzer) - cube de filtre dans la position DIC </li></ol></li><li> Commutateur Cube filtre pour DIC à la position de l&#39;analyseur (2 polariseur sd) dans le trajet de la lumière (le logiciel doit faire au démarrage). </li><li> Assurez-vous que les deux polariseurs sont correctement alignés (croisé). Lorsque les deux prismes de Wollaston sont hors du trajet de la lumière du champ de vision doit être sombre. Si nécessaire, faites tourner le polariseur dessous du condenseur jusqu&#39;à ce que ce sont correctes. </li><li> Insérez l&#39;objectif (supérieur) prisme de Wollaston dans le chemin de la lumière. </li><li> Rotation de la tourelle sur le condenseur pour sélectionner le prisme de Wollaston qui correspond à l&#39;objectif que vous utilisez. </li><li> Ajustez le curseur en bas de cette tourelle pour correspondre NA de la lentille. </li><li> Focus du condenseur pour Koehler éclairage optimal. </li><li> Ajustez la partie supérieure de Wollaston PriSM pour obtenir un contraste optimal en tournant le bouton du curseur. </li><li> Autres paramètres contrôlés par le démarrage du logiciel incluent gain de la caméra (à 0) et passer à l&#39;enregistrement des fichiers de 8 bits pas des fichiers TIFF 16-bit. </li></ol></li><li> Ajuster le niveau de lumière pour donner belle image. (Généralement l&#39;utilisation 4,7 volts) (via le logiciel). Nous préférons pour éclairer l&#39;échantillon de sorte que les pixels les plus clairs sont juste en dessous des niveaux de saturation. Bonne DIC résultats optiques dans une image avec un regard en 3 dimensions où les granulés jaunes dans l&#39;embryon se détachent nettement. Autrement cela peut être décrite comme si la lumière éclairant l&#39;échantillon semble briller d&#39;un angle de sorte qu&#39;un côté de l&#39;échantillon (ou des caractéristiques de l&#39;échantillon) est bien éclairée et la face opposée est dans l&#39;ombre et apparaît plus sombre. </li><li> Sélectionnez une région d&#39;intérêt (ROI) pour y inclure les embryons que vous voulez à l&#39;image, cliquez sur le bouton SET ROI pour réduire la fenêtre. </li><li> Ouvrez la fenêtre d&#39;acquisition multi-dimensionnelle. Sélectionnez Z-piles (tranches) et points de temps. </li><li> Utilisez le bouton concentrer microscope pour trouver le fond de l&#39;embryon (dernière plan focal avec quelques granules jaunes au point). Cliquez sur Sélectionner en bas. Répéter à identifier et à définir le haut de l&#39;embryon. Nous utilisons habituellement une taille de pas micron et se retrouver avec environ 20 plans focaux. En général, nous recueillons de multiples plans focaux à chaque point de temps, car les embryons et les cellules sont relativement épais. De plus particulièrement lorsque les cellules commencent à se diviser dans des orientations différentes, ils peuvent déplacer d&#39;autres cellules dans l&#39;embryon en les déplaçant dans ou hors du plan focal d&#39;origine. Si votre microscope n&#39;a pas de moteur de mise, vous pouvez régler manuellement la mise au point de suivre la cellule ou le processus qui vous intéresse. </li><li> Certain nombre de points d&#39;entrée du temps et l&#39;intervalle de temps nécessaire. Nous utilisons habituellement 15 secondes d&#39;intervalle et a fixé un maximum de 500 points de temps. Nous commençons par les points de temps plus que nous aurons besoin et d&#39;arrêter l&#39;acquisition si désiré. Si vous êtes d&#39;imagerie multiples plans focaux, s&#39;assurer qu&#39;il ya suffisamment de temps pour acquérir la totalité des plans focaux dans l&#39;intervalle entre les points de temps. </li><li> Sélectionner ou créer un emplacement pour enregistrer les données. Assurez-vous que le logiciel est paramétré pour afficher la dernière image seulement. Donnez un nom au fichier et cliquez sur Acquérir. Surveiller l&#39;acquisition automatique d&#39;images pour les premiers points peu de temps pour s&#39;assurer qu&#39;il fonctionne correctement. </li><li> Cliquez sur Stop lorsque vous souhaitez arrêter l&#39;acquisition, l&#39;objectif de passer à 10x et de préparer la diapositive suivante. </li><li> Quand c&#39;est fait enlever des composants d&#39;imagerie DIC à partir du chemin de lumière. Nettoyez l&#39;objectif d&#39;huile si nécessaire. Tournez le tout hors tension à partir de la caméra. </li></ol> Films GFP <ol start="20"><li> Démarrer microscope et trouver des embryons comme ci-dessus. Utiliser le fichier de configuration qui inclut le contrôle du logiciel de l&#39;obturateur fluorescentes. </li><li> Assurez-vous que le prisme supérieure DIC (slider) n&#39;est pas dans le chemin de lumière. </li><li> Commutateur Cube Filtre à FITC / GFP (automatiquement au démarrage) </li><li> Changer gain de la caméra à 255 et le fichier image à 16 bits Tiff (automatiquement au démarrage avec ce fichier de configuration). </li><li> Eteignez la lumière blanche. </li><li> Cliquez sur Live imagerie à l&#39;image de prévisualisation. Travaillez rapidement pour minimiser l&#39;exposition lumineuse. Sinon, utiliser l&#39;image Aligner à recueillir seule image. </li><li> Ajuster la puissance ampoule au mercure / filtres de densité neutre, durée d&#39;exposition pour obtenir une bonne image. En général, vous devez utiliser la lumière arrivant sur l&#39;échantillon minimale pour acquérir les données que vous voulez réduire le photovieillissement de la cellule et photoblanchiment des signaux de fluorescence. </li><li> Mettre en place intervalle de temps, le nombre de points dans le temps et le nombre de plans focaux. Nous utilisons souvent de 50 à 10 secondes d&#39;intervalle et 1-3 plan focal. </li><li> Sélectionnez le ROI et de définir les paramètres d&#39;acquisition d&#39;images tel que décrit plus tôt dans les étapes 13-19. </li></ol> Films Analyse <ol start="29"><li> Les données seront sauvegardées dans le dossier avec le nom que vous avez entré et contiennent une série de fichiers TIFF pour chaque image de la pile de 4D, un fichier texte et un fichier XML contenant les métadonnées telles que les niveaux d&#39;exposition et des intervalles de temps. </li><li> Les images TIFF peuvent être ouverts par ImageJ par deux méthodes. La première (méthode a) est le plus simple et sera également lire les métadonnées de chaque fichier. La seconde (méthode b) est capable d&#39;utiliser la mémoire virtuelle à ouvrir les fichiers qui sont plus grandes que la quantité de mémoire allouée à ImageJ, mais il n&#39;inclut pas les métadonnées. <ol class="lalpha"><li> Utilisant des micro-Plugin Manager <ol><li> Micro-Manager est construit sur et utilise ImageJ (il installe une nouvelle version d&#39;ImageJ qui sera différent de toute autre version que vous pouvez avoir préalablement installé) et inclut un plugin pour ouvrir les données. Sinon, vous pouvez copier le contenu du dossier dans le dossier Micro-Manager-1.3/plugins plugins pour une autre version d&#39;ImageJ. </li><li> Aller au menu Plugins, sélectionnez Micro-Manager, puis Open File Micro-Manager. </li><li> Sélectionnez le dossier contenant les données que vous souhaitez afficher et cliquez sur OK. </li><li> Jouez à travers les dimensions Z et T. </li></ol></li><li> Utiliser LOCI plugiN pour ouvrir des films avec l&#39;importateur BioFormats. <ol><li> Transfert des données XML et les fichiers txt du dossier contenant les fichiers TIFF, et renommer les deux fichiers pour correspondre au nom de l&#39;ensemble des données. </li><li> Dans ImageJ, aller à la Plugins menu déroulant, sélectionnez LOCI puis Data Browser soit ou Bio-formats importateur. </li><li> Trouver le dossier avec vos piles TIFF. Cliquez sur le premier fichier TIFF, puis ouvrez. </li><li> Voir la pile avec HyperStack. Sous l&#39;organisation Dataset: Sélectionnez les fichiers de groupe avec des dimensions similaires Swap noms, et ouvert toute la série. Sous la gestion de la mémoire: Sélectionnez: Utiliser pile virtuelle (surtout pour les grands ensembles de données). Cliquez sur OK </li><li> Le plugin va déterminer les dimensions de l&#39;ensemble des données (nombre de points de temps et de plans focaux) et afficher la gamme entre un ensemble de &lt;&gt; entre parenthèses. Cliquez sur OK ou modifier le nombre de points de temps et / ou plans focaux pour l&#39;ouvrir. </li><li> Confirmer quelle dimension correspond à chaque série. </li><li> Jouez à travers les dimensions Z et T. </li></ol></li></ol></li></ol> Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Stills Figure 1. Partir d&#39;un film illustrant DIC Nomarski normale événements cellulaires au cours début C. développement de l&#39;embryon elegans: migration pronucléaire (0-5:45), asymétrique première division (06 heures 45-14h45) et asynchrones de deuxième division (14:45-27:00). Les données ont été recueillies avec une lentille de 60x 1,35 NA. 20 plans focaux à intervalles de 1 micron ont été recueillies toutes les 15 secondes d&#39;exposition avec 40 ms. Les images ont été tourné de telle sorte que postérieur est à la raison et ventrale vers le bas. Barre d&#39;échelle représentent 10 microns. <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Stills partir d&#39;un film illustrant les fluorescents mouvements dynamiques d&#39;un sous-GFP-étiquetée du complexe passagers chromosome (AIR-2) présents sur les chromosomes de métaphase anaphase au début (A à C) avant d&#39;apparaître sur la zone médiane de la broche de l&#39;anaphase jusqu&#39;à ce cytokinèse complète (C à F). Les données ont été recueillies avec une lentille de 60x 1,35 NA. Un seul plan focal a été recueilli toutes les 10 secondes d&#39;exposition avec 50 microsecondes. Les images ont été tourné de telle sorte que postérieur est à la droite. Barre d&#39;échelle représentent 10 microns. Film 1 Film Nomarski de type sauvage d&#39;embryon. Film correspondant à la figure 1. Postérieure est au fond à droite et ventrale est de la partie inférieure gauche. Affiche un seul plan focal de données originales. L&#39;image a été recueilli toutes les 15 secondes et le jeu est de retour fixé à 14 images par seconde. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie1.mp4">Cliquez ici pour voir la vidéo</a> Film 2 Film fluorescent de type sauvage embryons exprimant la GFP:: AIR-2. Film correspondant à la figure 2. Postérieur est à la droite supérieure. Film a été recueillie dans un seul plan focal. L&#39;image a été recueilli toutes les 10 secondes et le jeu est de retour fixé à 14 images par seconde. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie2.mp4">Cliquez ici pour voir la vidéo</a>

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M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+actin+cytoskeleton+and+homotypic+membrane+fusion+in+ER+dynamics+in+Caenorhabditis+elegans.">Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).</li><li>Bianchi, L., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+embryonic+C.+elegans+cells+for+electrophysiological+and+pharmacological+analyses.">Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses.</a> WormBook. , 1-15 (2006).</li></ol>

Une considération importante pour vivre imagerie time-lapse est de préserver l&#39;intégrité et la viabilité de la cellule et l&#39;organisme. Microscopie DIC offre l&#39;avantage que l&#39;échantillon n&#39;est pas exposée à la lumière ultraviolette et chauffage excessif de la source d&#39;éclairage. Microscopie DIC est bien adapté pour détecter la migration cellulaire et les changements de forme cellulaire telles que la cytocinèse et d&#39;identifier certaines structures subcellulaires, tels que le fuseau mitotique et la membrane nucléaire. L&#39;imagerie de fluorescence des protéines reporters complète de microscopie DIC en identifiant d&#39;autres compartiments subcellulaires et permettant la visualisation des protéines spécifiques. Pour atténuer les risques de phototoxicité et de dommages à l&#39;embryon lors de l&#39;imagerie de fluorescence, nous avons l&#39;habitude d&#39;augmenter le gain de la caméra numérique pour compenser la réduction de l&#39;intensité des UV la lumière et la durée d&#39;éclairement. Pour faibles fluorescentes journalistes transgéniques, les algorithmes de déconvolution pour réaffecter hors-focus algorithmes lumière ou déconvolution de réduire de fond peut améliorer la qualité des images capturées. Alors que les microscopes de pointe comme les systèmes confocale ou multiphotonique sont parfois nécessaires, nous avons constaté que de nombreux journalistes fluorescente peut être imagée en utilisant cette configuration microscope à épifluorescence, produisant des images de haute qualité. Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), en plus d&#39;être gratuit, enregistre les fichiers directement au format TIFF au lieu de formats de fichiers propriétaires de nombreux logiciels commerciaux. Cela simplifie considérablement l&#39;analyse de nos données en éliminant l&#39;étape de conversion de fichiers nécessaires pour lire les fichiers image dans ImageJ, Photoshop et autres logiciels de retouche d&#39;image.

Olympus BX61 microscope Hamamatsu Orca-ER caméra. Plan de 10x fluorite (NA 0,3) et PlanAchromat 60x (NA 1,35) lentilles de l&#39;objectif Micro-Manager 3.1.46 (http://www.micro-manager.org) Image J 1,43 (http://rsbweb.nih.gov/ij) loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu) Agarose - biologie moléculaire / grade électrophorèse sur gel Diapositives Fisher Microscope Superfrost / Plus (catalogue # 12-550-15) Bande de Laboratoire (Fisher Catalogue # 15-901 Série) 18 mm x 18 mm # 1.5 Lamelles M9 (242 mM KH 2 PO 4, 40 mM Na 2 HPO 4, 9 mm g de NaCl, 19 mM de NH 4 Cl MgSO 4) (Http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). Egg tampon (118 mM NaCl, 48 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, MgCl2 2 mM, 25 mM d&#39;HEPES, pH 7,3) 25. Vaseline Brosse / Stick Lames de rasoir Bloc de chaleur Microscope à dissection Worms 22 Fil de platine ramasser 22 27G1 / 2 Précision Glide Needle (Beckton Dickinson) ou un scalpel avec une petite lame

imaging c. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software

Processus cellulaires, telles que l&#39;assemblage de chromosomes, la ségrégation et la cytokinèse, sont intrinsèquement dynamique. Time-lapse imagerie des cellules vivantes, en utilisant fluorescentes protéines marquées journaliste ou contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) microscope, permet à l&#39;examen de la progression temporelle de ces événements dynamiques qui est par ailleurs déduire de l&#39;analyse des échantillons 1,2 fixe. Par ailleurs, l&#39;étude de la réglementation du développement des processus cellulaires nécessite la réalisation de temps-faute des expériences sur un organisme intact pendant le développement. L&#39;embryon Caenorhabiditis elegans est transparent à la lumière et a un rapide, le programme invariant de développement avec une cellule connue lignée 3, offrant ainsi un modèle idéal pour étudier l&#39;expérience des questions de biologie cellulaire et développement 4,5 6-9. C. elegans est modifiable à la manipulation génétique par l&#39;avant génétique (basée sur la mutagenèse aléatoire 10,11) et la génétique inverse pour cibler des gènes spécifiques (basées sur l&#39;ARNi à médiation interférences et ciblées mutagenèse 12-15). En outre, les animaux transgéniques peuvent être facilement créées pour exprimer des protéines par fluorescence étiqueté ou journalistes 16,17. Ces traits se combinent pour rendre plus facile d&#39;identifier les voies génétiques de régulation de processus cellulaires fondamentaux et de développement in vivo 18-21. Dans ce protocole, nous présentons des méthodes pour l&#39;imagerie en direct de C. embryons elegans utilisant l&#39;optique DIC ou fluorescence de la GFP sur un microscope composé épifluorescence. Nous démontrons la facilité avec laquelle les microscopes facilement disponibles, généralement utilisé pour l&#39;imagerie de l&#39;échantillon fixe, peut également être appliquée pour les time-lapse analyse en utilisant des logiciels libres pour automatiser le processus d&#39;imagerie.

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Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

L&#39;<em&gt; C. elegans</emEmbryon&gt; est un système puissant pour étudier la biologie cellulaire et le développement. Nous présentons un protocole pour l&#39;imagerie en direct de<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryons en utilisant l&#39;optique DIC ou de fluorescence à l&#39;aide de microscopes à épifluorescence facilement disponibles et les logiciels open-source.

Imagerie C. elegans Les embryons en utilisant un microscope à épifluorescence et de logiciels Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

imaging-c-elegans-embryos-using-an-epifluorescent-microscope-open

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

27.7K vues.  University of Michigan. L' C. elegans est un système puissant pour étudier la biologie cellulaire et le développement. Nous présentons un protocole pour l'imagerie en direct de C. elegans Embryons en utilisant l'optique DIC ou de fluorescence à l'aide de microscopes à épifluorescence facilement disponibles et les logiciels open-source.

Vidéo: Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

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Biologie

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La préparation des Drosophile Les embryons destinés à Live-imagerie utilisant le protocole goutte suspendue

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

Assemblée, Tuning et utilisation d&#39;un microscope en champ proche infrarouge pour l&#39;imagerie Apertureless protéines

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

L&#39;utilisation de la microscopie à Time Lapse Visualisez anoxie induite Suspended Animation en<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryons

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorps coloration dans<em&gt; C. Elegans</em&gt; Utilisation de «gel-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Mesurer les effets des bactéries sur<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportement aide d&#39;un test de rétention d&#39;oeufs

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Configuration d&#39;une nappe de lumière Microscope simple pour<em&gt; En Toto</em&gt; Imagerie de<em&gt; C. elegans</em&gt; Développement

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Workflow pour haut-contenu, cellule individuelle quantification des marqueurs fluorescents de Data Universal Microscope, pris en charge par Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...