Cette étude a été financée en partie par le Programme du Gouvernement de l&#39;époque victorienne OIS, la National Health and Medical Research Council du programme de subventions et de projets en Australie (JPF Chin-époussetage) et bourse d&#39;études supérieures (D Michell).

1. Isoler les artères carotides <ol><li> Euthanase10 semaine anciens rats Sprague-Dawley par l&#39;intermédiaire de CO 2 / O 2 asphyxie. </li><li> Accise gauche et à droite des artères carotides communes avec l&#39;aorte et le coeur assurant un minimum d&#39;étirement des vaisseaux. </li><li> En glacée tampon Krebs séparer les artères carotides de l&#39;aorte et le coeur et effectuer la dissection proche. </li><li> Gardez les bateaux isolés dans Krebs sur la glace avant le montage. </li></ol> Env. temps = 45 min 2. Amorçage de la chambre de cuve <ol><li> Au connecteurs proximales et distales de la chambre de cuve affleurant tampon Krebs maintenue à pH physiologique en infusant de gaz carbogène (95% d&#39;O 2, 5% CO 2) grâce à la mémoire tampon à 37 ° C. </li><li> Assurez-tubes et canules sont vidées complètement et sont alignés. </li><li> Rincer tampon Krebs par la P1 (proximale) et P2 (distale) transducteurs. Fermer les robinets afin de s&#39;assurer qu&#39;aucune bulle d&#39;air dans les transducteurs. </li><li> Connectez les capteurs aux connecteurs correspondants et encore plus ras tampon Krebs assurant aucune bulle d&#39;air. Fermer les robinets de la chambre. </li></ol> Env. temps = 15 minutes 3. Pressurisation de la chambre de cuve <ol><li> Allumez l&#39;équipement sous pression: la pression d&#39;asservissement, de contrôler la pression, pompe péristaltique (Figure 1). </li><li> Avec la pompe péristaltique sur la pression et la pression sur les servo-automatiques fonctionner tampon Krebs à travers le tube à 20 mmHg (cadran à 1), garantissant aucune bulle d&#39;air. </li><li> Relier les tubes du capteur P2 fermé. La pression sera devenue stable. </li><li> Ouvrir le robinet de P2 à la chambre des navires pour évacuer les bulles, puis fermer. </li><li> Remplissez le bain avec tampon de Krebs (5 - 7 ml). </li></ol> Env. temps = 10 min 4. Montage du navire <ol><li> En vertu d&#39;une dissection liens endroit en polyester noir sur microscope à chaque canule (figure 2). </li><li> Déplacer les canules et les détenteurs de la canule en dehors et monter des navires (¼ arc aortique fin) sur la canule P1. Assurez-vous de ne pas déchirer le navire. </li><li> En utilisant une seringue remplie de tampon Krebs doucement rincer l&#39;excès de sang hors de la cuve par sonde P1. Fermez P1 à la chambre. </li><li> Navire sécurisé à la canule P1 avec la cravate en polyester. </li><li> Déplacer canules / détenteurs canule plus pour le montage sur la canule P2. </li><li> Mont extrémité distale du vaisseau (~ ¼ de la longueur) sur la canule distale. Fixez avec cravate en polyester. </li></ol> Env. temps = 20 min 5. Pressurisation du navire <ol><li> Ajuster les détenteurs canule afin de s&#39;assurer qu&#39;aucun plier ou étirer dans le vaisseau. </li><li> Avec P1 et P2 fermée de la chambre de changer le servo de pression automatique au mode manuel. Vérifiez la pression sur le servo il n&#39;ya pas de baisse continue de la pression dans les 10 secondes. S&#39;il ya une fuite se produit et les connexions et les capteurs doivent être fixés en place. </li><li> Ajuster le servo-pression à P2 puis ouvrez automatique à la Chambre. Sous le microscope, d&#39;observer le navire se dilatent lorsque le robinet est ouvert à la chambre. </li><li> Mettre le servo pression manuelle. Encore une fois vérifier diminution continuelle de la pression dans les 10 secondes. S&#39;il ya une fuite, alors le système n&#39;est pas étanche à la pression et il est susceptible d&#39;être un trou dans le bateau. </li><li> Revenez à P1 ouverte automatiquement à la chambre. Sur le réglage manuel vérifier que la pression reste stable. </li><li> Si aucune fuite, sur le cadran de réglage manuel pour augmenter 2 (40 mmHg). </li><li> Régler sur automatique et d&#39;observer le navire sous le microscope. Si nécessaire, ajuster le titulaire canule afin de s&#39;assurer qu&#39;aucun coude de la vessel.Check des fuites sur le réglage manuel. </li><li> Répétez les étapes 5.6 à 5.7 augmente le cadran à 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) et ainsi de suite jusqu&#39;à la pression désirée est atteinte. </li></ol> Env. le temps = 15 - 30 min 6. L&#39;incubation de la cuve sous pression <ol><li> Connectez l&#39;ensemble régulateur de température à 37 ° C. </li><li> Avec une deuxième pompe péristaltique perfuser tampon Krebs (1 mL / min) dans le bain de la chambre du navire. </li><li> Connectez aspiration à la chambre de s&#39;assurer que la couche supérieure du bain est enlevé. </li><li> Incuber récipient sous pression à 37 ° C pendant 1 heure à la pression réglée sur automatique. </li><li> Vérifiez la pression ne fuit pas (passer à manuel) périodiquement. </li><li> Les effets de diverses interventions pharmacologiques peuvent être observés en ajoutant simplement le composé dans le bain pendant l&#39;incubation. </li></ol> Env. temps = 1 heure 7. Perfusant le récipient sous pression avec du sang total <ol><li> Durant l&#39;incubation d&#39;obtenir au moins 7,5 mL de sang total humain / navire recueillies dans 40 héparine U / ml de sang. Incuber dans un falcon de 50 ml à 37 ° C. </li><li> 10 minutes avant la fin de tIl sanguins étiquette incubation avec VybrantDil (1:1000) pendant 10 minutes à 37 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Après 10 minutes, prélever du sang dans une seringue de compensation des bulles et de fixer sur un pousse-seringue avec une veste thermique fixée à 37 ° C. </li><li> Fermez capteur P1 à la chambre / navire et les raccorder la seringue et la tubulure de déchets. </li><li> Purge du sang à 1000 ul / min à travers la tubulure de déchets à éliminer les bulles. </li><li> Ouvrez P1 à la chambre. Le servo de pression pour régler automatiquement pour maintenir la pression désirée. </li><li> Perfuser le sang à 100 ul / min. </li><li> En utilisant un microscope à fluorescence couplé à un appareil photo numérique d&#39;enregistrer deux champs de la cuve perfusé pendant 15 secondes à 1, 3, 5, 7,5 et 10 minutes. </li><li> L&#39;intégrité de perfusion et de la fonction endothéliale message peut être évaluée par des techniques pharmacologiques comme myographe et d&#39;expression des molécules d&#39;adhésion peut être déterminé par immunohistochimie pour valider davantage la réponse inflammatoire. </li></ol> Env. temps = 15 minutes 8. Les résultats représentatifs: Un diagramme schématique de la configuration de la chambre de pression est montré dans la figure 1. Avec un appareil photo numérique couplé à un microscope à fluorescence des résultats peuvent être visualisés instantanément via des enregistrements vidéo en direct. Images vidéo représentant sont vus dans la figure 3 où les leucocytes sont considérés comme des adhérents à l&#39;endothélium, si elles sont restées stationnaires pendant 10 secondes. Avec les enregistrements vidéo sur les cellules boucle continue respectées peut être compté comme un champ moyen par. Bien que les deux bas (figure 3A) et élevé (figure 3B) la pression va causer une certaine quantité d&#39;adhérence une augmentation significative de l&#39;adhérence des leucocytes à la pression plus élevée intraluminale est vu et cela est également démontré quantitativement (figure 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" /> Figure 1. Pressurisée ex vivo navire schématiques chambre. Un navire canulées connecté à un proximale (P1) et un capteur distal (P2) qui permet aux capteurs de pression sanguine pour être manipulés dans le vaisseau. La perfusion est à travers le transducteur P1 et la pression est maintenue par l&#39;intermédiaire du transducteur P2. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" /> Figure 2. Cannuala avec des liens. Liens polyester noir sont attachés à chaque canule. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" /> Figure 3. Images vidéo représentant. Adhérence des cellules dynamiques (flèche rouge) sous la fluorescence à 80 mmHg (A) et 120 mmHg (B) après 10 minutes de la perfusion. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" /> Figure 4. Adhérence des leucocytes dans les Sprague-Dawley carotide artères après 1 heure d&#39;incubation à basse (80 mmHg) et haute pression (120 mmHg). *** P &lt;0,001, analysé par deux voies à mesures répétées ANOVA en utilisant le test post hoc de Bonferroni.

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Le protocole d&#39;étude a été approuvée par la recherche médicale et l&#39;éducation Alfred Cité éthique animale Comité et le Comité d&#39;éthique Alfred Hospital.

C&#39;est une méthode modifiée d&#39;étudier l&#39;adhésion des leucocytes à l&#39;endothélium dans les vaisseaux sanguins intacts isolés dans des conditions sous pression en temps réel. Perfusion de la chambre de récipient seul permet une validation rapide des pro-inflammatoire des souches de souris et de grands vaisseaux de rat. Manipulation de la pression d&#39;habilitation permet des interactions cellulaires dynamiques pour être observée à partir de faible à très haute pression intraluminale, et ainsi mieux imitent-tion des conditions physiologiques et physiopathologiques. Diamètre de navires peut également être mesurée en utilisant un nombre suffisant de cellules-imagerie du programme et de flux donc cisaillement et le taux peut être déterminé et donc manipulé. Grâce à ses capacités myographe, les interventions pharmacologiques placé dans le bain ajouter une autre dimension aux conditions expérimentales possibles avec ce modèle permettant des études mécanistes et des voies de signalisation. Alors que la préservation endothéliales ne peut pas être confirmé lors de la manipulation de pression, des réponses à l&#39;ACh et PE peuvent être menées 9 perfusion post. Il convient de noter que cette configuration montre les effets de la pression intraluminale sur la cellule à cellule interactions non pas les effets du flux sanguin pulsatile, ni systolique ou diastolique. Par ailleurs, si les changements de pression aiguë sur l&#39;adhérence des leucocytes ont été observés, cette configuration peut aussi être utilisé pour examiner les effets de pression chronique (augmentation du temps d&#39;incubation et en utilisant un modèle pression chronique des animaux). Sprague-Dawley des artères carotides communes sont mises en évidence dans cette mise en place, mais d&#39;autres souches et des espèces peuvent être utilisées avec les ajustements appropriés à la taille de la canule. En effet, il est important de noter que l&#39;âge et du poids des animaux affectent la taille des navires et donc que l&#39;ensemble des besoins jusqu&#39;à être individualisée pour chaque navire. Fermer une dissection minutieuse et du tissu conjonctif peut améliorer la visualisation des leucocytes immensément.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif / équipements </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Microscope </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> STEREO Discovery V.20 </td><td></td></tr><tr><td> Pompe seringue PHD 2000 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> Appareil photo numérique et le contrôleur </td><td> Hamamatsu ORCA-ER </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> Système d&#39;illumination par fluorescence </td><td> Dynamique Lumen </td><td> X-Cite 120 </td><td></td></tr><tr><td> Chambre des navires </td><td> Vivre Instrumentation Systems </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> Contrôleur de servomoteurs de pression et pompe péristaltique </td><td> Vivre Instrumentation Systems </td><td> PS - 200 </td><td></td></tr><tr><td> Surveiller la pression de perfusion </td><td> Vivre Instrumentation Systems </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 Capteur de pression x </td><td> Vivre Instrumentation Systems </td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td> Régulateur de température </td><td> Vivre Instrumentation Systems </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> Pompe péristaltique </td><td> Instech Laboratories, Inc </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil cellule étiquette de la solution </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> Utilisez 1:1000 </td></tr></tbody></table>

imaging leukocyte adhesion to the vascular endothelium at high intraluminal pressure

Dans le monde, l&#39;hypertension est rapporté pour être dans environ un quart de la population et est le principal facteur de risque pour la mortalité dans le monde biomédical. Dans l&#39;hypertension vasculaire est associée à une dysfonction endothéliale et l&#39;inflammation accrue menant à l&#39;athérosclérose et de maladies diverses telles que la maladie rénale chronique 2, 3 temps et 4 une insuffisance cardiaque. Une première étape dans l&#39;inflammation vasculaire conduisant à l&#39;athérogenèse est la cascade d&#39;adhésion qui implique le laminage, tethering, l&#39;adhérence et la transmigration des leucocytes subséquentes à travers l&#39;endothélium. Le recrutement et l&#39;accumulation de leucocytes à l&#39;endothélium est médiée par une régulation positive des molécules d&#39;adhésion telles que l&#39;adhérence des cellules vasculaires molécule-1 (VCAM-1), molécule d&#39;adhérence cellulaire intracellulaire-1 (ICAM-1) et E-sélectine ainsi que l&#39;augmentation des la libération de cytokines et de chimiokines et une régulation positive des espèces réactives de l&#39;oxygène 5. Les méthodes in vitro tels que des dosages adhérence statique aider à déterminer les mécanismes impliqués dans la cellule à cellule d&#39;adhésion ainsi que l&#39;analyse des molécules d&#39;adhésion cellulaire. Les méthodes employées dans les précédentes études in vitro ont démontré que l&#39;augmentation de la pression aiguë sur l&#39;endothélium peut conduire à l&#39;adhésion des monocytes, une régulation positive des molécules d&#39;adhésion et de marqueurs de l&#39;inflammation 6 cependant, semblable à de nombreux tests in vitro, ces résultats n&#39;ont pas été réalisées en temps réel dans des conditions physiologiques de flux, ni avec du sang total. Par conséquent, les essais in vivo sont plus utilisés dans des modèles animaux pour démontrer l&#39;inflammation vasculaire et le développement des plaques. Microscopie intravitale est maintenant largement utilisée pour évaluer l&#39;adhérence des leucocytes, le laminage, la migration et de transmigration 7-9. Lorsque l&#39;on combine les effets de la pression sur les leucocytes à l&#39;adhésion endothéliales les études in vivo sont moins étendus. Une telle étude examine les effets en temps réel des flux et de cisaillement sur ​​la croissance des artères et des marqueurs de remodelage, mais inflammatoires étaient seulement évalués par immunohistochimie 10. Ici, nous présentons un modèle pour l&#39;enregistrement de l&#39;adhésion des leucocytes en temps réel dans intacts les vaisseaux sanguins sous pression en utilisant une perfusion de sang total. La méthodologie est une modification d&#39;un modèle de vaisseau vivo perfusion ex chambre 9 qui permet l&#39;analyse temps réel des interactions adhésives des leucocytes et l&#39;endothélium dans les vaisseaux intacts. Notre modification permet la manipulation de la pression intraluminale jusqu&#39;à 200 mmHg permettant d&#39;étudier non seulement dans des conditions physiologiques de flux mais aussi des conditions de pression. Alors que les systèmes myographie pression ont déjà été démontrée pour observer la paroi des vaisseaux et la lumière de diamètre 11 ainsi que la contraction des vaisseaux c&#39;est la première fois la démonstration des leucocytes et l&#39;endothélium des interactions en temps réel. Ici, nous montrer la technique en utilisant les artères carotides récoltés à partir de rats et de canule à une chambre de flux sur-mesure couplé à un microscope à fluorescence. La chambre de navire est équipé d&#39;une lamelle en bas grandes permettant une lentille de grand diamètre objectif avec une distance de travail de courte à l&#39;image du navire. Par ailleurs, un agoniste sélectionnés et / ou antagonistes peuvent être utilisés pour étudier plus les mécanismes contrôlant l&#39;adhésion cellulaire. Avantages de cette méthode sur la microscopie intravitale comprennent pas l&#39;implication de la chirurgie invasive et donc un débit plus élevé peut être obtenu. Cette méthode permet également l&#39;utilisation d&#39;un traitement inhibiteur de la localisées à la cuve souhaitée tandis intravitale permet seulement un traitement inhibiteur de la systémique.

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Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

C&#39;est une méthode pour visualiser l&#39;adhésion des leucocytes à l&#39;endothélium dans les vaisseaux sous pression récoltés. La technique permet l&#39;étude de l&#39;adhérence vasculaires sous flux de cisaillement avec différentes pressions intraluminale jusqu&#39;à 200 mmHg donc imitent-ment les conditions physiopathologiques de l&#39;hypertension artérielle.

Adhésion leucocytaire imagerie de l&#39;endothélium vasculaire au Haute pression intraluminale

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K vues.  Monash University. C'est une méthode pour visualiser l'adhésion des leucocytes à l'endothélium dans les vaisseaux sous pression récoltés. La technique permet l'étude de l'adhérence vasculaires sous flux de cisaillement avec différentes pressions intraluminale jusqu'à 200 mmHg donc imitent-ment les conditions physiopathologiques de l'hypertension artérielle.

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Recherche

Immunologie et infection

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Évaluer la réponse stomatique à Live cellules bactériennes en utilisant l&#39;imagerie feuilles entières

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Human neutrophiles Chambre flux Essai d&#39;adhésion

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Scalable High Throughput sélection à partir de bibliothèques d&#39;anticorps synthétiques phage

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Interactions Microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l&#39;étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...