Ce travail est parrainé par l&#39;Institut de recherche Lupus (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 et NIH UL1-TR00165. Nous remercions le Dr Robert P. Kimberly pour son soutien continu.

Tous les donneurs recrutés pour cette étude ont donné leur consentement éclairé écrit et l&#39;étude a été approuvé par l&#39;Université de l&#39;Alabama à Birmingham Institutional Review Board. 1. HUVEC Culture initiale et Subculture <ol><li> Culture veine cellules endotheliales ombilicales humaines (HUVEC) in vitro dans un milieu de croissance complet qui est composé de cellules endotheliales milieu basai (voir la liste des matériaux) additionné de facteurs de croissance des cellules endothéliales. Remarque: Les facteurs de croissance utilisés dans cette étude sont les suivantes: 5 ng / ml recombinant humain facteur de croissance épidermique (hEGF), 1,0 mg / ml d&#39;hydrocortisone, 50 mg / ml de gentamicine et 50 ng / ml d&#39;amphotéricine-B (AG-1000), 2 % de sérum bovin fœtal (FBS), 0,5 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), 10 ng / ml Fibroblast Growth Factor-base avec de l&#39;héparine (hFGF-B), 20 ng / ml de facteur humain recombinant humain de l&#39;insuline-like Growth ( R3-IGF-1), 1 ug / ml d&#39;acide ascorbique, et 22,5 pg / ml d&#39;héparine. Le milieu completOn prépare d&#39;abord à 37 ° C et peut ensuite être conservée à 4 ° C pour une utilisation dans les 1 mois de préparation. </li><li> Pour préparer un flacon de cellules, le milieu de croissance complet est ajouté à un flacon de 75 cm2 pour culture de tissus (1 ml / 5 cm 2), puis le flacon est laissé s&#39;équilibrer à 37 ° C / 5% de CO2 dans un incubateur humidifié pour au moins 30 min. HUVEC humain sera ensemencé directement dans ce flacon de culture équilibrée à une densité de 2,500-5,000 cellules / cm 2. </li><li> Alors que les médias s&#39;équilibre, décongeler rapidement la cryovial stock HUVEC dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. Disperser les cellules dans le flacon de stockage d&#39;origine par vortex, puis les ajouter directement dans le ballon de culture contenant le milieu de croissance complet pré-équilibré HUVEC pour obtenir une densité de 2,500-5,000 cellules / cm 2. Agitez doucement le flacon afin de répartir uniformément les cellules, puis retourner le ballon à l&#39;incubateur. Ces cellules représentent maintenant le passage 1 er. </li> &lt;li&gt; moyen doit être changé tous les deux jours jusqu&#39;à ce que les cellules sont 70-80% de confluence. </li><li> L&#39;HUVEC peut maintenant être récoltée à partir du flacon de culture avec de la trypsine / EDTA. Le milieu de culture est aspiré à partir des flacons de culture, suivie d&#39;un rinçage du PBS pour éliminer toute protéine résiduelle et du calcium à partir des cellules. Une solution de trypsine-EDTA à 0,25% est ajouté à l&#39;intérieur et le détachement des cellules 2-6 min devrait être évident évaluée par microscopie optique. </li><li> Quand 90% des cellules sont arrondis vers le haut hors de la plaque, arrêter le traitement à la trypsine en ajoutant un volume égal d&#39;inhibiteur de trypsine de 2x. Afin de faciliter la récolte des cellules, ajouter une autre quantité égale de milieu de croissance complet. Transférer les cellules individuelles de 15 ml tube à centrifuger stérile. </li><li> Centrifuger les cellules détachées à 225 xg pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant, puis remettre en suspension les cellules dans 2-3 ml de milieu de croissance complet. Déterminer la concentration et la viabilité cellulaire en utilisant un hémacytomètre et bleu Trypan. </li><li> Pour utiliser ee cellules pour étude, réensemencer supplémentaire de 75 cm 2 flacons avec des cellules à une densité de 10 000 cellules / cm 2 récolté et passez à l&#39;étape 2.2. Alternativement, les cellules peuvent être congelés à ce point pour des études futures. Pour la congélation de cellules, un culot de cellules par centrifugation à 225 xg pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans du FBS contenant 10% de DMSO à une concentration de 1 x 10 6 cellules / ml. La suspension cellulaire est ensuite transféré dans des cryotubes et stocké à -80 ° C après congélation des cellules dans un récipient de congélation de cellules. </li></ol> 2. Préparation HUVEC Layer <ol><li> L&#39;utilisation de surgelés HUVECs 2ème passage: renouveau et de la culture. Si l&#39;utilisation de cellules en croissance active, passez à l&#39;étape 2.2. <ol><li> Décongeler la cryovial contenant 2 HUVECs e de passage de l&#39;étape 1.8 rapidement dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. Transférer les cellules du tube cryogénique à un tube à centrifuger stérile de 15 ml et ajouter 10 ml de mé croissanceum. </li><li> Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant pour éliminer le DMSO résiduel. </li><li> Remettre en suspension le culot de cellules avec du milieu de croissance complet et transférer les cellules dans un flacon de 75 cm 2. Ajouter un milieu de croissance à un volume total d&#39;environ 20 à 25 ml et incuber à 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol></li><li> Examiner visuellement la culture cellulaire pour confluence chaque jour avec les changements des médias tous les deux jours. Habituellement dans les 2-4 jours, les cellules atteignent 80-90% de confluence au moment où ils seront prêts pour une utilisation dans l&#39;analyse de la chambre d&#39;écoulement. </li><li> Pour préparer le plat de la culture qui sera utilisé dans la chambre de circulation (voir la section 5), ajouter 1 ml de 10 ug / fibronectine ml et 0,05% (p / v) de gélatine à une boîte de culture tissulaire de 35 mm et la pipette plusieurs fois pour faire que la surface de la plaque tout est enrobé. Retirer la solution et de l&#39;air de la fibronectine et de la gélatine excessive sécher la plaque pendant au moins 30 min afin d&#39;optimiser la formation de la matrice de protéine. Le fsolution de ibronectin et la gélatine peut être réutilisée jusqu&#39;à 10 fois. </li><li> Récolter les cellules HUVEC à partir de l&#39;étape 2.2 en utilisant de la trypsine-EDTA comme décrit dans les étapes 01.05 à 01.07. Ensemencer 500 000 cellules dans chaque boîte de culture de tissu enduit. Ajouter 2 ml de milieu de croissance dans chaque boîte et incuber à 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Permettent aux cellules de croître jusqu&#39;à la confluence comme dans l&#39;étape 2.2. Les cellules doivent être inspectés visuellement tous les jours avec changement de milieu tous les deux jours. Avant le dosage de la chambre d&#39;écoulement, le premier HUVEC avec 20 le TNF-α humain ng / ml pour 4-6 heures pour réguler à la hausse et à stimuler l&#39;expression des molécules d&#39;adhérence. </li></ol> 3. Purifiée de ligand de revêtement <ol><li> Tracez un cercle de 0,5 cm de diamètre avec un marqueur ou un stylo au centre d&#39;une boîte de culture tissulaire de 35 mm. </li><li> Plate 20 pi de 20 pg / ml de protéine A dans la zone marquée. Utilisez la pointe de la pipette pour répandre la protéine Une solution pour couvrir toute la zone à l&#39;intérieur du cercle de 0,5 cm de diamètre. Il est important de ne pas toucher ou rayer la surface de la dish. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Laver les protéine A la plaque 3x revêtues avec 1 ml de PBS (pH 8,0). </li><li> Planche 50 pi 1% de BSA dans la zone marquée à bloquer la liaison non-spécifique sur la plaque. Incuber pendant 2 heures à 4 ° C. </li><li> Laver la plaque 3x les bloqués avec 1 ml de PBS que dans l&#39;étape 3.3. </li><li> Préparer les solutions de protéines chimères ligand-récepteur Fc d&#39;adhérence pour le revêtement. Dans cette expérience, une solution ICAM-1/Fc chimère à 25 pg / ml et une chimère P-Selectin/Fc à 0,5 ug / ml dans du PBS (pH 8,0) a été utilisé. </li><li> Manteau de la zone marquée avec 50 ul de substrat. Incuber pendant une nuit à 4 ° C. Le plat doit être utilisé dans les deux jours et la surface revêtue ne devrait pas être autorisé à sécher. Ajouter PBS si nécessaire pour maintenir la solution de 50 ul sur la plaque. </li></ol> 4. Séparation des neutrophiles (Tous les étapes réalisées à température ambiante) <ol><li> Après obtention du consentement éclairé, recueillir le sang des participants par la saignée dans unn anticoagulant tube de collecte de sang ou Vacutainer (EDTA ou de l&#39;héparine). Après la collecte de sang, diluer le sang de 1:01 avec du PBS avant la séparation. </li><li> Préparer une à deux couches de Ficoll pour séparer PBMC et des neutrophiles dans 50 ml tubes de centrifugation. Première ajouter 15 ml de Ficoll lourd (voir la liste des matériaux, ρ = 1,118 à 1,120), et ensuite soigneusement couche 10 ml de Ficoll lumière (voir la liste des matériaux, ρ = 1,077 à 1,080) sur le dessus de la lourde Ficoll. Il devrait y avoir une frontière nette entre le Ficoll lumière et des couches de Ficoll lourds. Enfin, la couche soigneusement 25 ml de l&#39;échantillon de sang dilué sur le dessus du Ficoll lumière sans déranger la couche de Ficoll. </li><li> Centrifuger le tube à 250 g pendant 30 min à température ambiante. Remarque: Le frein de rotor de centrifugeuse doit être éteint pour ces rotations afin de minimiser la perturbation potentielle de la séparation des cellules au cours de la décélération du rotor à la fin de la centrifugation. Après centrifugation, les couches suivantes (de haut en bas) sont présents: la couche supérieure est la sui plasmamené par la couche de PBMC sur le dessus de la couche de Ficoll lumière, la couche de neutrophiles avec peu de globules rouges (RBC) est comprise entre la lumière et Ficoll lourde suivie de la couche de globules rouges et de Ficoll lourde au fond du tube. </li><li> Récolte et transférer la couche de cellules neutrophiles dans un nouveau tube de 50 ml avec une pipette de transfert, ajouter du PBS pour un volume final de 50 ml et centrifuger à 225 g pendant 10 min à température ambiante. <ol><li> Après centrifugation, il peut toujours y avoir des globules rouges mélangés avec les neutrophiles. Aspirer le surnageant jusqu&#39;à la marque de 10 ml. Reprendre le culot neutrophiles RBC par agitation douce du tube (ou une brève vortex à basse vitesse), puis lavez à nouveau avec 50 ml de PBS. </li></ol></li><li> Après le second lavage, aspirer le surnageant. Pour enlever les globules rouges contaminants, remettre en suspension le culot cellulaire dans le PBS résiduelle par agitation (ou court vortex), ajouter 25 ml H 2 O et doucement vortex pendant 10 secondes à la lyse RBC. <ol><li> Ajouter 25 ml de NaCl 1,8% et immédiatement mélangerpar centrifugation à 225 xg pendant 10 min à température ambiante. La RBC contamination devrait maintenant être lysée laissant un neutrophiles blanc culot cellulaire. </li></ol></li><li> Laver le culot cellulaire des neutrophiles avec de la PBS. </li><li> Remettre en suspension les cellules neutrophiles isolés dans du milieu RPMI avec 10% de FBS et de déterminer la concentration de cellules au microscope optique avec un hémocytomètre. </li><li> Ajuster la densité cellulaire à 500 000 cellules / ml avec du milieu RPMI complet, 10% de milieu FBS. </li></ol> 5. Chambre de circulation Essai d&#39;adhésion <ol><li> Assemblez la chambre d&#39;écoulement. Placer le plat de 35 mm contenant les HUVEC confluentes ou des ligands de récepteurs d&#39;adhérence purifiées sur la table de microscope. Relier la chambre d&#39;écoulement à plaques parallèles avec une pompe à seringue, le système de vide et de laisser une ligne ouverte pour l&#39;entrée des neutrophiles. Insérer la chambre d&#39;écoulement au-dessus de la plaque et fixer l&#39;ensemble formant chambre d&#39;écoulement 13. (Voir Figure 1) </li><li> Démarrez le programme d&#39;enregistrement vidéo sur l&#39;ordinateur connecté to le microscope. Réglez le champ et du microscope jusqu&#39;à ce que le champ libre avec des cellules HUVEC à maturité ou un champ dans la région de revêtement de ligand est visible. </li><li> Utilisation de la pompe à seringue, rincer la chambre d&#39;écoulement avec du milieu RPMI. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air dans la chambre ou la ligne d&#39;entrée des neutrophiles. </li><li> Si vous le souhaitez, les neutrophiles peuvent être apprêtées avec une faible dose (10 -8 M) fMLP pendant 10 min. Cela permettra une adaptation du niveau basal de l&#39;activation des neutrophiles entre 14 donneurs différents. </li><li> Utiliser la pompe à seringue pour injecter des neutrophiles dans la chambre d&#39;écoulement à des vitesses déterminées (une vitesse de 350 ul / min, ce qui correspond à une contrainte de cisaillement de 1,5 dynes / cm 2 est utilisé dans la présente étude). Enregistrer de la vidéo. Étant donné que l&#39;adhésion des neutrophiles peut se produire rapidement, une vidéo d&#39;une longueur de 4 à 5 min est généralement suffisante pour quantifier des événements d&#39;adhésion pour l&#39;analyse. </li><li> Une cellule adhérente est définie comme une cellule qui se déplace de moins d&#39;un diamètre de celluledans les 5 secondes sur la HUVEC ou ligand surface revêtue 15,16. Compter le nombre total de cellules adhérentes dans le champ présent dans la vidéo enregistrée à l&#39;aide de cette règle. Par l&#39;enregistrement de vidéos de longueur similaires avec des neutrophiles de différents bailleurs de fonds, on peut calculer la adhérente cellules / min pour comparer les propriétés d&#39;adhérence entre les différents bailleurs de fonds. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Ce protocole oriente la séparation et l&#39;isolement des neutrophiles peu activés pour la quantification attention de l&#39;adhésion des neutrophiles dans des conditions de stress abruptes. L&#39;adhésion des neutrophiles est un processus critique dans l&#39;inflammation. Étant donné que des variants génétiques dans de multiples molécules dans ce processus ont été démontrées pour prédisposer au développement de la maladie auto-immune 1,2, un système de dosage capable d&#39;évaluer quantitativement l&#39;adhésion ferme des neutrophiles humaine n&#39;est nécessaire. La méthode décrite dans ce protocole permet la détermination minutieuse et quantitative du potentiel adhésif cabinet de neutrophiles dans un environnement contrôlé in vitro sous contrainte de cisaillement. Cette méthode permet ainsi la comparaison directe de quantitative adhésion des neutrophiles entre les individus génotypés pour déterminer l&#39;importance de la variation génétique dans des molécules d&#39;adhésion 14. Plusieurs étapes de cette méthode méritent un examen attentif de achievles résultats quantitatifs et e hautement reproductibles. Dans la préparation des cellules HUVEC, il est essentiel d&#39;atteindre 100% de confluence des cellules avant de les utiliser dans la chambre d&#39;écoulement. Pour l&#39;utilisation de surfaces revêtues de ligand purifié, la région de revêtement de substrat ne doit jamais être laissé à sécher pour éviter la dénaturation du ligand. En outre, la préparation des neutrophiles humains est critique pour le succès de l&#39;expérience. Les questions clés à isoler les neutrophiles du sang incluent la manutention en douceur en minimisant vortex pour éviter l&#39;activation, en gardant les cellules à température ambiante (c&#39;est à dire le sang ne doit pas être stocké sur glace et étapes de centrifugation doit être effectuée à la température ambiante) et en complétant l&#39;isolement et l&#39;expérience dans le moins de temps possible. Il existe des méthodes d&#39;isolement des neutrophiles supplémentaires qui peuvent également être utilisés pour préparer des cellules pour ces dosages 17,18. D&#39;un point de vue pratique essais, adhérence par les neutrophiles humains fraîchement isolés<html> doit être initié dans les 3-6 heures après la saignée participant. Que les neutrophiles sont extrêmement sensibles à la manipulation, temps prolongées entre la prise de sang et l&#39;utilisation pourrait affecter les résultats du dosage. Attention, la détermination de la concentration cellulaire des neutrophiles avant le dosage de la chambre d&#39;écoulement est également nécessaire pour obtenir des résultats précis et reproductibles. Au cours de l&#39;essai de la chambre d&#39;écoulement, il est important de surveiller l&#39;enregistrement vidéo avec soin pour s&#39;assurer que la vitesse d&#39;écoulement est uniforme et il n&#39;y a pas de turbulence sur toute la longueur de l&#39;expérience. Les variations de vitesses d&#39;écoulement ou de la présence de turbulences qui nécessiteraient l&#39;expérience répétée. Après l&#39;expérience, il est également important d&#39;évaluer les neutrophiles restants au microscope pour s&#39;assurer que les neutrophiles sont pas agglutination. Agglutination à ce stade d&#39;indiquer que les neutrophiles sont devenus activé qui pourraient modifier de manière significative la densité des neutrophiles au cours de l&#39;expérience. contenu &quot;&gt; La chambre d&#39;écoulement crée une contrainte près homogène pure dans la chambre (τ = 6Qμ / (wh 2), où Q = débit, μ = viscosité dynamique, et w = largeur de la chambre d&#39;écoulement, h = hauteur de la la chambre 15 d&#39;écoulement). Dans nos études, nous avons utilisé un débit de 350 ul / min pour l&#39;adhésion des neutrophiles, ce qui crée une contrainte de cisaillement de 1,5 dynes / cm 2 (p = 0,25 cm, h = 0,01 pouce, la viscosité de l&#39;eau à 37 ° C (0,007 équilibre) a été utilisée comme une approximation de la viscosité de l&#39;IPMB médias). Pour une chambre de flux spécifique, on peut changer le débit pour atteindre différents niveaux de contrainte de cisaillement pour imiter différentes conditions physiologiques. contrainte de cisaillement physiologique typique dans les vaisseaux sanguins humains est comprise entre 0,5-5,0 dynes / cm 13,16. peuvent Contrainte de cisaillement dans d&#39;autres vaisseaux sanguins et d&#39;autres animaux ont été énumérés dans le tableau 1 113,16,19 20. Bien que notre méthode a porté sur l&#39;étude de l&#39;adhésion de neutrophi humainels, ce procédé n&#39;est pas limité aux neutrophiles et peut être facilement appliquée à l&#39;adhérence ou des études de roulement d&#39;autres types de cellules avec des modifications simples. De plus, les substrats de ce procédé peuvent être modifiés à des fins différentes. Bien que ce protocole est facilement adaptable à différentes études, il existe certaines limites. Le protocole mis en œuvre ici nécessite grand nombre de cellules primaires pour l&#39;analyse. Cela peut empêcher l&#39;analyse des cellules primaires de petits animaux. En outre, la nécessité d&#39;immobiliser les ligands d&#39;adhésion purifiées dans une conformation active / disponible peut limiter la gamme de ligands. L&#39;utilisation de protéines de fusion Fc améliore grandement les chances de réaliser la conformation du ligand approprié sur la surface de la plaque. Néanmoins, notre procédé présente une grande souplesse pour permettre l&#39;analyse quantitative des événements d&#39;adhésion. Ces études permettra d&#39;améliorer grandement notre compréhension de paires récepteur-ligand adhérence, et l&#39;importance de la fonction potentiel de variants génétiquesdans ces protéines, dans la pathogenèse de maladies humaines.

Variants génétiques dans les deux β 2 intégrines et de ligands ICAM sont maintenant reconnus pour être associés à l&#39;élaboration de 1,2 maladie auto-immune. La détermination des conséquences fonctionnelles de ces variantes dans les cellules provenant d&#39;individus avec ces variantes est nécessaire à notre compréhension de la façon dont ces variantes contribuent à la pathogenèse de la maladie auto-immune. Ces études fonctionnelles permettent la détermination des mécanismes par lesquels des variants génétiques d&#39;origine naturelle forment la réponse immunitaire à la fois dans la santé et la maladie. Dans l&#39;exemple spécifique du lupus érythémateux disséminé, nous savons maintenant que les variantes dans ITGAM (CD11b) et son ligand, ICAM-1, fortement associons avec le développement de la maladie 1,2. Parce que les neutrophiles sont essentielles dans les réponses inflammatoires, l&#39;étude quantitative de l&#39;adhésion des neutrophiles peut fournir des idées sur la façon dont mécanistes variants génétiques dans ITGAM / ICAM modifient inflammation. NeutropHil ferme adhésion aux cellules endothéliales (CE) est un processus très réglementé et joue un rôle essentiel dans les réponses inflammatoires 3,4. L&#39;adhésion ferme de neutrophiles suit roulement des neutrophiles initiale et la capture à la CE et, finalement, peut entraîner la transmigration in vivo. Ces processus impliquent de nombreux types différents de molécules d&#39;adhésion, y compris ICAM-1, ICAM-2, P-sélectine, E-sélectine sur les cellules endothéliales et β 2 intégrines sur la neutrophiles 5-9. Ainsi, la quantification attention de l&#39;adhésion des neutrophiles des bailleurs de fonds avec différentes variantes alléliques de molécules d&#39;adhésion sera important de comprendre les conséquences fonctionnelles et pathologiques de ces variantes génétiques. Utilisation expérimentale d&#39;une chambre d&#39;écoulement peut créer un environnement in vitro avec une contrainte de cisaillement de fluide semblable à celle observée dans l&#39;environnement d&#39;un vaisseau sanguin in vivo de 10 à 12. En effet, une analyse de la chambre de flux couplé à ombilicale humainecal cellule endothéliale de la veine (HUVEC) peut imiter l&#39;environnement in vivo d&#39;un vaisseau sanguin. En utilisant cette méthode, on peut étudier les propriétés adhésives cellulaires globales à l&#39;égard des cellules endotheliales. En outre, l&#39;environnement hautement contrôlé de la chambre d&#39;écoulement permet également l&#39;évaluation des cellules de liaison à des ligands d&#39;adhésion purifiées telles que ICAM-1, afin de faciliter l&#39;étude des interactions récepteur-ligand spécifiques. Nous présentons ici une méthode utilisant un système de dosage de la chambre d&#39;écoulement d&#39;adhérence pour étudier les propriétés d&#39;adhérence des neutrophiles du sang périphérique humain pour les cellules HUVEC et de substrats de ligand purifié. En utilisant cette méthode avec des cellules provenant de donneurs exprimant différentes variantes molécule d&#39;adhésion alléliques nous permet d&#39;évaluer comment ces variantes génétiques peuvent modifier l&#39;adhésion de l&#39;entreprise neutrophile humaine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="677">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:677px;">Table of Reagents Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Name of reagent</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:268px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">25200-056</td>
			<td style="width:268px;">with Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">2X Trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">R-002-100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">35mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430165</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:192px;">75cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430641</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Dage-MTI</td>
			<td style="width:111px;">Model 300T-RC</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Cell freezing container&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Biocision</td>
			<td style="width:111px;">BCS-045</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-3156</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EGM-2 Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc</td>
			<td style="width:111px;">CC-4176</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth factors for basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">FBS</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">10082-147</td>
			<td style="width:268px;">Certified, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Gelatin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G9391</td>
			<td style="width:268px;">from bovine skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:107px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-671-51B&#160;</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F2006</td>
			<td style="width:268px;">from human plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:107px;">Glyco Tech</td>
			<td style="width:111px;">31-001</td>
			<td style="width:268px;">Circular flow chamber for 35mm dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">47729</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Histopaque-11191</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">11191</td>
			<td style="width:268px;">Heavy ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">HUVEC</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-2517A</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">ICAM-1</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">720-IC</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Lymphocyte separation medium</td>
			<td style="width:107px;">Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:111px;">25072CV</td>
			<td style="width:268px;">Light ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:111px;">Axiovert 100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875</td>
			<td style="width:268px;">with L-Glutamine and Phenol Red&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Protein A</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6031</td>
			<td style="width:268px;">resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">P-Selectin</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">137-PS</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:107px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:111px;">KDS270</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">TNF-a</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">PHC3015</td>
			<td style="width:268px;">Recombinant Human Protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human neutrophil flow chamber adhesion assay

cabinet d&#39;adhésion des neutrophiles aux cellules endothéliales joue un rôle crucial dans l&#39;inflammation dans la santé et la maladie. Le processus d&#39;adhésion des neutrophiles entreprise implique de nombreuses molécules d&#39;adhésion différents, y compris les membres de la famille des intégrines β 2 et leurs contre-récepteurs de la famille de la GIZC. Récemment, d&#39;origine naturelle variants génétiques dans les deux intégrines β 2 et ICAM sont rapportés pour être associée à une maladie auto-immune. Ainsi, la capacité d&#39;adhésion des neutrophiles quantitative de personnes ayant différentes formes alléliques de ces molécules d&#39;adhérence est important d&#39;étudier en ce qui concerne les mécanismes sous-jacents au développement de l&#39;auto-immunité. études d&#39;adhérence dans les systèmes de la chambre d&#39;écoulement peut créer un environnement avec une contrainte de cisaillement de fluide semblable à celle observée dans l&#39;environnement d&#39;un vaisseau sanguin in vivo. Ici, nous présentons une méthode utilisant un système d&#39;analyse de la chambre de flux pour étudier les propriétés adhésives quantitatives de neutrophiles périphériques humains de sangs à ombilicale humaine cellule endothéliale de la veine (HUVEC) et à des supports de ligands purifiés. Avec cette méthode, les capacités adhésives neutrophiles provenant de donneurs avec différentes variantes alléliques dans des récepteurs d&#39;adhésion peuvent être évalués et comparés. Cette méthode peut également être modifiée afin d&#39;évaluer l&#39;adhésion des autres types de cellules primaires ou de lignées cellulaires.

Des exemples de neutrophiles se lier à un ligand purifié (ICAM-1/P-Selectin) chambre d&#39;écoulement revêtu (figure 2) ou de se lier à un essai de HUVEC revêtu chambre d&#39;écoulement (figure 3) sont représentées des neutrophiles. Comme représenté sur les figures, les neutrophiles continuent à s&#39;accumuler / adhérer à la surface revêtue ou les cellules HUVEC dans des conditions d&#39;écoulement continu. Dans nos conditions expérimentales typiques, nous pouvons observer 50-70 neutrophiles humains qui adhère fermement à la surface revêtue ou HUVEC au cours d&#39;une période d&#39;enregistrement de quatre minutes. Cependant, les variants alléliques des molécules d&#39;adhésion des neutrophiles, ou des variants alléliques dans le substrat (ligand purifié ou HUVEC), pourraient modifier sensiblement l&#39;adhésion des neutrophiles quantitative 14. Nous avons également évalué la dépendance temporelle des événements d&#39;adhésion des neutrophiles observés dans nos études. Bien que nous maintenons conditions de débit constant, il est possible que les propriétés adhésives des cellules changent au fil du temps. Houtefois, sur les cours de temps relativement courts dans nos études, nous n&#39;avons pas observé de différences constantes dans le taux d&#39;adhérence au fil du temps. Par exemple, l&#39;évaluation de l&#39;adhérence au niveau des points de temps de 1 à 2 minutes par rapport à l&#39;adhérence observée entre les points de temps de 3 à 4 min ne sont pas systématiquement différents. Bien sûr, si les cellules sont stimulées pendant l&#39;expérience de l&#39;adhérence, puis change de propriétés adhésives au fil du temps on pourrait s&#39;attendre. Dans nos études, nous avons contrôlé pour l&#39;isolement activation des neutrophiles induite par amorçage intentionnellement les cellules à faible dose fMLP (10 -8 M) pendant 10 minutes avant d&#39;étudier. Les cellules endothéliales (HUVEC dans nos études) exigent également l&#39;activation avant upregulate molécule d&#39;adhésion expression optimale cabinet d&#39;adhésion des leucocytes. En l&#39;absence de pré-traitement, les cellules endothéliales (HUVEC) appuieront très peu d&#39;adhérence des neutrophiles. Dans nos études, nous avons utilisé 10 ng / ml de TNFa pour un traitement de 4 à 6 heures avant l&#39;utilisation. IL-1β (10 ng / ml) et<html> LPS (0,5 à 1 pg / ml) peuvent également être utilisés pour pré-activer les cellules endothéliales. Fait important, non traité HUVEC peut être utilisé comme témoin négatif pour faire en sorte que l&#39;adhésion des cellules est provoquée par des interactions spécifiques de cellules neutrophiles-endothélial (médiés par le récepteur). En variante, des anticorps anti-récepteurs peuvent être utilisés pour bloquer les récepteurs spécifiques pour évaluer la spécificité de l&#39;adhérence. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> Figure 1. Configuration de la chambre de flux sur la platine du microscope. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; Coups Figure 2 de l&#39;écran à partir d&#39;un échantillon vidéo de neutrophiles adhérant à ICAM-1/P-Selectin surface revêtue à des moments différents (A:. 0 point de temps, B: 1 point de temps min, C: 2 point de temps min et D: 4 min point de temps). La concentration de ICAM-1 est de 25 pg / ml et de P-sélectine est de 0,5 ug / ml. la vitesse d&#39;écoulement de neutrophiles est de 350 ul / min avec une densité de cellules neutrophiles à 500 000 cellules / ml. <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> Coups Figure 3 de l&#39;écran à partir d&#39;un échantillon vidéo de neutrophiles adhérant à surface revêtue HUVEC à différents points de temps (A: 0 point de temps, B: 1 min point de temps, C: 2 points de temps min et D: 4 min point de temps)..la vitesse d&#39;écoulement de neutrophiles est de 350 ul / ml avec une densité de cellules neutrophiles à 500 000 cellules / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> Espèce </td><td > Emplacement </td><td > La contrainte de cisaillement (dynes / cm 2) </td></tr><tr ><td> Humain </td><td> Artère caroid commune </td><td> 11.6 </td></tr><tr ><td> Humain </td><td> Artère branchiale </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> Humain </td><td> Artère fémorale commune </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> Humain </td><td> Aorte surrénale </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> Humain </td><td> Aorte supracœliaque </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> Humain </td><td> Artère fémorale superficielle </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> Humain </td><td> Veinules </td><td> 0,5-5,0 </td></tr><tr ><td> Humain </td><td> Rétiniennes premiers artérioles </td><td> 40,2 </td></tr><tr ><td> Humain </td><td> Deuxième artérioles rétiniennes </td><td> 0,001 </td></tr><tr ><td> Humain </td><td> Rétiniennes premiers veinules </td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td> Humain </td><td> Deuxième veinules rétiniennes </td><td> 0,43 </td></tr><tr ><td> Chien </td><td> Artère caroid commune </td><td> 15,8 </td></tr><tr ><td> Lapin </td><td> Artère caroid commune </td><td> 23,3 </td></tr><tr ><td> Rat </td><td> Artère caroid commune </td><td> 46,6 </td></tr><tr ><td> Souris </td><td> Artère caroid commune </td><td> 64,8 </td></tr><tr ><td> Chien </td><td> Artère fémorale commune </td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td> Lapin </td><td> Artère fémorale commune </td><td> 156,8 </td></tr><tr ><td> Rat </td><td> Artère fémorale commune </td><td> 65,9 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Exemple de cisaillement dans les différents organes et les différentes espèces. * Résumé de références 13, 16, 19 et 20.

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Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Un procédé de quantification de l&#39;adhésion des neutrophiles est rapporté. Cette méthode permet de créer un environnement dynamique d&#39;écoulement semblable à celle rencontrée dans un vaisseau sanguin. Il permet à l&#39;enquête de l&#39;adhésion des neutrophiles soit à des molécules purifiées d&#39;adhésion (ligand) ou substrat de cellules endothéliales (HUVEC) dans un contexte similaire à l&#39;environnement in vivo avec contrainte de cisaillement.

Human neutrophiles Chambre flux Essai d&#39;adhésion

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K vues.  University of Alabama at Birmingham.  Un procédé de quantification de l'adhésion des neutrophiles est rapporté. Cette méthode permet de créer un environnement dynamique d'écoulement semblable à celle rencontrée dans un vaisseau sanguin. Il permet à l'enquête de l'adhésion des neutrophiles soit à des molécules purifiées d'adhésion (ligand) ou substrat de cellules endothéliales (HUVEC) dans un contexte similaire à l'environnement in vivo avec contrainte de cis...

Vidéo: Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Homme In Vitro</emRépression> comme outil de dépistage pour la reconnaissance d&#39;un Etat précoce de déséquilibre immunitaire

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

Simplifié droits de neutrophiles extracellulaires Piège (NET) Isolement et Manipulation

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l&#39;étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Dosage d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle des thérapies contre les adhérences dans la maladie intestinale inflammatoire

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...