Ce travail a été soutenu par l&#39;AZM Profileringsfonds (PF245).

PARTIE I: identification des agents pathogènes 1. Préparation de l&#39;échantillon Note: Le flux de production moléculaire est décrite dans le protocole suivant doit être effectuée conformément aux recommandations pour l&#39;assurance qualité dans le diagnostic moléculaire 3. <ol><li> Ajouter une fraction aliquote de 0,1 ml de culture de sang à 0,9 ml de NaCl 0,9% dans un tube réactionnel de 1,5 ml à devenir un échantillon dilué 1:10. (Diluer afin d&#39;empêcher l&#39;inhibition qPCR). </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 13 400 xg pendant 5 min pour obtenir un culot de l&#39;ADN bactérien. </li><li> Remettre en suspension le culot bactérien dans 100 ul stérile déminéralisée H 2 O. </li><li> Conserver l&#39;échantillon d&#39;ADN à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li></ol> 2. Essai d&#39;identification: en temps réel de PCR ADNr 16S <ol><li> Préparer les mélanges de réaction comme suit. Le dosage se compose de quatre réactions séparées par échantillon. Chaque mélange comprend 12,50 maître ulmélange, 0,9 uM Amorce (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, amorce 0,6 uM inverse (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 et un panel de sondes. La quantité de sondes est donnée pour chacune des quatre réactions séparées dans ci-dessous. </li><li> La première réaction comprend: <ul><li> 0,2 um sonde universelle (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8 </li><li> 0,2 p uM sonde aeruginosa (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> La seconde réaction comprend: <ul><li> 0,2 E. uM sonde coli (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1) </li><li> 0,2 um Pseudomonas spp. la sonde (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ) </li></ul></li><li> La troisième réaction comprend: <ul><li> 0,2 um Staphylococcus spp. la sonde (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ) </li><li> 0,2 uM S. sonde aureus (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1) </li><li> 0,2 um Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> La quatrième réaction comprend: <ul><li> 0,2 um sonde universelle (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) </li><li> 0,3 pM Streptococcus spp. la sonde (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ) </li><li> 0,2 uM S. pneumoniae sonde (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1) </li></ul></li><li> Ajouter stérile déminéralisée H 2 O pour atteindre un volume total de 20 pi. Ajouter 20 ul de chaque mélange réactionnel pour les puits d&#39;une plaque de 96 puits PCR. </li><li> Ajouter 5 ul d&#39;échantillon dans chaque puits. </li><li> Utilisez un film adhésif pour sceller la plaque de 96 puits PCR. </li><li> Exécutez la plaque sur le ABI PRISM 7900HT Système temps réel PCR en utilisant les suivantes conditions optimales de cyclage thermique: <ul><li> Préchauffage à 50 ° C pendant 10 min </li><li> Dénaturation initiale à 95 ° C pendant 15 min </li><li> 42 cycles de <ul type="circle"><li> Dénaturation à 95 ° C pendant 15 s </li><li> Recuit à 60 ° C pendant 1 min </li></ul></li></ul></li></ol> 3. Analyse des résultats <ol><li> Régler le seuil de l&#39;analyse Ct à 0,1 dans les paramètres d&#39;analyse de tabulation. Cibler les configurations de base pour démarrer (Cycle): 6 et Fin (cycle): 15. </li><li> Enregistrez le cycle seuil (Ct) la valeur pour tous les échantillons. La valeur de coupure d&#39;envisager un résultat PCR positif que peut être réglé à une valeur Ct de 35 ans. La quantité de bactéries présentes dans les cultures de sang variait de 10 7 à 10 11 UFC / ml, générant les valeurs Ct-dessous de 35. </li></ol> PARTIE II: antibiogramme 4. Isolement de bactéries à partir d&#39;hémocultures positives 9 <ol><li> Aspirer 5 ml de bouillon à partir d&#39;un flacon d&#39;hémoculture positive et le transférer dans un tube séparateur de sérum. </li><li> Centrifuger le tube séparateur de sérum à 2000 xg pendant 10 min. </li><li> Éliminer le surnageant du tube de séparation du sérum. </li><li> Transfert bactères de la couche de gel du tube avec un écouvillon stérile dans une solution saline à 0,9% jusqu&#39;à 0,5 McFarland une norme de suspension est obtenue. </li></ol> 5. L&#39;inoculation des plaques Objectives Micro <ol><li> Diluer la suspension à 0,5 McFarland en double concentré de bouillon de Mueller-Hinton II pour former une suspension de 5 x 10 5 UFC / ml. </li><li> Ajouter cette suspension dans les puits d&#39;une plaque de micro titre contenant une sélection des antibiotiques (tableau 1). </li><li> Incuber la plaque de titrage micro à 37 ° C pendant 6 h. </li><li> Conserver une partie aliquote de la suspension à 4 ° C (comme régulation de croissance négative). </li><li> Après 6 h d&#39;incubation, transférer le contenu de chaque puits dans un tube stérile, ainsi que l&#39;échantillon de croissance négatif de contrôle qui a été stocké à 4 ° C. </li><li> Centrifuger les tubes à 16000 xg pendant 5 min. </li><li> Retirez délicatement le surnageant, sans perturber le culot bactérien. </li><li> Reprendre le culot dans H déminéralisée stérile <sub&gt; 2 O. </li><li> Diluer les échantillons de 10 fois stérile déminéralisée H 2 O. </li></ol> 6. En temps réel de PCR ADNr 16S 10 <ol><li> Préparer le mélange de PCR comme suit: <ul><li> 12,50 pi iQ SYBR Green Supermix </li><li> 0,5 pM avant amorce 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11 </li><li> 0,25 um 16S-2 amorce inverse (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11 </li><li> stérile déminéralisée H 2 O à un volume total de 20 pi </li></ul></li><li> Ajouter 20 ul du mélange PCR pour les puits d&#39;une plaque de 96 puits PCR. </li><li> Ajouter 5 ul d&#39;échantillon dans chaque puits. </li><li> Utilisez un film adhésif pour sceller la plaque de 96 puits PCR. </li><li> Exécutez la plaque sur le MyiQ unique couleur en temps réel système de détection par PCR, en utilisant les suivantes conditions optimales de cyclage thermique: <ul><li> Dénaturation initiale à 95 ° C pendant 4 min </li><li> Initiale de recuit à 65 ° C pendant 30 s </li><li> 35 cycles de <ul><li> Dénaturation à 95 ° C pendant 15 s </li><li> Recuit à 60 ° C pendant 1 min </li></ul></li><li> Faire fondre analyse de la courbe (à partir de 60-95 ° C en 20 minutes avec des incréments de 0,57 ° C) </li></ul></li></ol> 7. Analyse des résultats <ol><li> Calculer la valeur de coupure Ct en utilisant l&#39;une des formules suivantes (selon le type d&#39;antibiotique). <ul><li> En général: Cut-off valeur Ct = valeur de Ct la croissance de contrôle positif + 0,5 x (valeur de Ct à contrôler la croissance négative - la valeur Ct de croissance de contrôle positif) </li><li> La pipéracilline, pipéracilline / tazobactam et la ceftazidime dans bacilles Gram-négatifs; Amoxicilline, oxacilline et le triméthoprime / sulfaméthoxazole dans S.aureus; Amoxicilline chez Enterococcus spp:. Cut-off valeur Ct = valeur de Ct la croissance de contrôle positif + 0,25 x (croissance Ct valeur négative de contrôle - la valeur Ct de croissance de contrôle positif) </li></ul></li><li> Utilisez l&#39;échantillon incubé avec stérile déminéralisée H 2 O comme régulation de croissance positive.</li><li> Selon le micro-organisme, utilisez le contrôle de la croissance négative appropriée: <ul><li> Gram-négatif échantillon tiges incubées avec un mélange d&#39;antibiotiques </li><li> Enterococcus spp. Échantillon stocké à 4 ° C </li><li> Exemple de S.aureus conservés à 4 ° C </li></ul></li><li> Déterminer la sensibilité (S) ou de la résistance (R) de la souche de l&#39;antibiotique effectué comme suit: <ul><li> Une valeur Ct supérieur à la valeur de coupure Ct indique la sensibilité </li><li> Une valeur Ct inférieure à la valeur de coupure Ct indique la résistance </li></ul></li></ol> 8. Les résultats représentatifs Deux organismes modèles, à savoir un E. Gram négatif coli et un S. Gram-positif Staphylococcus, sont choisis de visualiser la procédure combiné pour la détection et l&#39;identification de bactéries pathogènes et la détermination de son profil antimicrobien. La première partie du protocole comprend l&#39;identification des agents pathogènes. Spesondes spécifiques sont conçus pour la détection de micro-organismes huit cliniquement pertinentes. En présence d&#39;une cible inclus dans le panneau bactérienne, les courbes d&#39;amplification sont générés et les valeurs de Ct sont calculés (Figure 2). La valeur de coupure d&#39;envisager un résultat positif de PCR comme est fixé à une valeur Ct de 35 ans. Figure 2A, le profil d&#39;identification d&#39;une culture de sang E. coli-infectée est représenté. La sonde 16S universel est inclus dans deux mélanges réactionnels distincts et génère par conséquent deux courbes d&#39;amplification (Ct de 25,20 et 25,95). Le troisième signal est dérivé de la sonde spécifique pour E. coli (Ct de 27,04). L&#39;identification d&#39;un S. Staphylococcus infecté par hémoculture est montré dans la figure 2B. La sonde 16S universel comporte des signaux d&#39;amplification de 33,35 et 33,71. Les deux signaux restants sont dérivées à partir des sondes spécifiques pour Staphylococcus spp. et S. aureus (Ct de 32,48 et 30,59). La figure 3 est un exemple d&#39;un complot d&#39;amplification tests de sensibilité aux antibiotiques, ce qui représente la souche E. coli qui a été également montré la figure 2A. Chaque ligne représente un antibiotique que l&#39;échantillon bactérien a été incubé avec. Un échantillon avec une faible valeur Ct est un échantillon dans lequel la croissance a lieu en présence d&#39;un antibiotique, une résistance à l&#39;antibiotique indiquant testée. Au contraire, une valeur élevée Ct représente un échantillon dans lequel aucune croissance s&#39;est produite en raison du fonctionnement efficace de l&#39;antibiotique, la sensibilité à l&#39;antibiotique indiquant testée. Le tableau 1 illustre la détermination du profil de l&#39;antimicrobien E. coli et S. aureus. Toutes les valeurs Ct sont signalés et, en utilisant les formules mentionnées dans le texte du protocole (7.1), deux seuils sont calculés les valeurs de Ctréglementée à la distinction entre résistance et la sensibilité. La souche est résistante à l&#39;antibiotique si la valeur déclarée Ct est inférieure à la calcule la valeur seuil Ct (et vice versa). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig1.jpg" /> Diagramme Figure 1. De l&#39;identification des agents pathogènes et d&#39;antibiotiques procédure des tests de sensibilité à l&#39;aide en temps réel ADNr 16S par PCR. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig2.jpg" /> Figure 2 test d&#39;identification:. Parcelles d&#39;amplification et des valeurs seuils de cycle (les valeurs de Ct) Une hémoculture positive est détectée par le sonde universelle ADNr 16S, tandis que les sondes spécifiques sont utilisés pour l&#39;identification de l&#39;agent pathogène.. Parcelle d&#39;amplification A. de la culture du sang contenant E. coli; parcelles d&#39;amplification de la culture B. sang contenant S. aureus; Pseudomonas ae, Pseudomonaeruginosa; uni, 16S sonde universelle; Ecoli, Escherichia coli sonde; Pseudomonas sp, Pseudomonas spp. sonde; S. pneumoniae, Streptococcus pneumoniae sonde; Strep sp, Streptococcus spp. sonde; Entero, Enterococcus spp. sonde; S. aureus, Staphylococcus aureus sonde; Staph sp, Staphylococcus spp. Sonde. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig3.jpg" /> Amplification parcelle Figure 3. Des tests de sensibilité aux antibiotiques d&#39;un E. coli isoler (échantillon 1). Chaque courbe représente un antibiotique que la souche a été incubé avec. Un signal de début est provoquée par une charge bactérienne élevée, ce qui signifie que la souche a cultivé en présence de l&#39;antibiotique testé et n&#39;est donc résistant à l&#39;antibiotique. Signaux en retard indiquent que la souche a pas cultivées en présence de l&#39;antibiotique, en d&#39;autres termes, il est sensible. <table border="1"><tbody&gt; <tr><td> Exemple 1: E. coli </td><td></td><td></td><td> Exemple 2: S. Staphylococcus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AST </td><td> Ct </td><td> R / S </td><td> AST </td><td> Ct </td><td> R / S </td></tr><tr><td> L&#39;amoxicilline 8 mg / L </td><td> 16,83 </td><td> R </td><td> Amoxicilline 0,25 mg / L </td><td> 21,03 </td><td> R </td></tr><tr><td> L&#39;amoxicilline-acide clavulanique 8/4 mg / L </td><td> 17,36 </td><td> R </td><td> Oxacilline 2 mg / L </td><td> 25,80 </td><td> S </td></tr><tr><td> Pipéracilline 16 mg / L </td><td> 16,67 </td><td> R </td><td> La vancomycine 2 mg / L </td><td> 25,20 </td><td> S </td></tr><tr><td> Pipéracilline-tazobactam 16 /4 mg / l </td><td> 24,15 </td><td> S </td><td> Gentamicine 4 mg / L </td><td> 25,86 </td><td> S </td></tr><tr><td> La ciprofloxacine 1 mg / L </td><td> 29,72 </td><td> S </td><td> Le triméthoprime-sulfaméthoxazole 2/38 mg / L </td><td> 24,62 </td><td> S </td></tr><tr><td> Ceftazidime 1 mg / L </td><td> 24,03 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ceftazidime 8 mg / L </td><td> 26,58 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gentamicine 4 mg / L </td><td> 29,83 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le triméthoprime-sulfaméthoxazole 2/38 mg / L </td><td> 27,60 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Contrôle de la croissance négative (mélange d&#39;antibiotiques) </td><td> 30,41 </td><td></td><td> Contrôle de la croissance négative (échantillon stocké à 4 ° C) </td><td> 27,42 </td><td></td></tr><tr><td> Contrôle de la croissance positive </td><td> 16,90 </td><td></td><td> Contrôle de la croissance positive </td><td> 20,22 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cut-off valeur Ct 1 * </td><td> 21,76 </td><td></td><td> Cut-off valeur Ct 1 *** </td><td> 23,82 </td><td></td></tr><tr><td> Cut-off valeur Ct 2 ** </td><td> 18,75 </td><td></td><td> Cut-off valeur Ct 2 **** </td><td> 22,02 </td><td></td></tr><tr><td> * Pour l&#39;amoxicilline, l&#39;amoxicilline-acide clavulanique, la ciprofloxacine, gentamicdans, le triméthoprime-sulfaméthoxazole ** Pour pipéracilline, pipéracilline-tazobactam, la ceftazidime </td><td></td><td></td><td> *** Pour la vancomycine et la gentamicine Pour l&#39;amoxicilline ****, oxacilline et le triméthoprime-sulfaméthoxazole </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Détermination des tests de sensibilité aux antibiotiques des deux échantillons (E. coli et S. aureus). Les valeurs de Ct de la PCR-test ont été copiés dans ce fichier Excel, que ce qui peut calcule automatiquement les deux cut-off aleurs Ct de la régulation de croissance positive et négative, en utilisant les formules indiquées dans le texte du protocole. Si un antibiotique montre une valeur Ct inférieure à la valeur de coupure Ct, la souche est résistante à l&#39;antibiotique, si la valeur Ct est plus élevé que le seuil, la souche est sensible.

<ol>
	<li>Wallet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+clinical+study+using+a+multiplex+real-time+PCR+test+for+the+detection+of+bacterial+and+fungal+DNA+directly+in+blood.">Preliminary clinical study using a multiplex real-time PCR test for the detection of bacterial and fungal DNA directly in blood.</a> Clin. Microbiol. Infect. 16, 774 (2010).</li><li>Beekmann, S. E., Diekema, D. J., Chapin, K. C., Doern, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rapid+detection+of+bloodstream+infections+on+length+of+hospitalization+and+hospital+charges.">Effects of rapid detection of bloodstream infections on length of hospitalization and hospital charges.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3119 (2003).</li><li>Raymaekers, M., Bakkus, M., Boone, E., de Rijke, B., Housni, H. E. l., Descheemaeker, P., De Schouwer, P., Franke, S., Hillen, F., Nollet, F., Soetens, O., Vankeerberghen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diagnostics+working+group.+Reflections+and+proposals+to+assure+quality+in+molecular+diagnostics.">Molecular Diagnostics working group. Reflections and proposals to assure quality in molecular diagnostics.</a> Acta. Clin. Belg. 66, 33 (2011).</li><li>Peters, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+the+diagnosis+of+bloodstream+infections.">New developments in the diagnosis of bloodstream infections.</a> Lancet Infect. Dis. 4, 751 (2004).</li><li>Hansen, W. L., Beuving, J., Bruggeman, C. A., Wolffs, P. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+MicroSeq+system+for+identification+of+mycobacteria+by+16S+ribosomal+DNA+sequencing+and+its+integration+into+a+routine+clinical+mycobacteriology+laboratory.">Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1447 (2003).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Le protocole décrit ici permet l&#39;identification rapide des agents pathogènes et fournit un profil fonctionnel antimicrobien qui pourrait conduire à l&#39;administration précoce d&#39;antibiotiques adéquats, améliorant ainsi le pronostic des patients atteints d&#39;infections sanguines. En fonction des conditions demandées d&#39;un test, à savoir faible coût, un débit élevé, de demi-tour minimale de temps, les conditions de test peut être ajustée. Toute la procédure peut être effectuée dans un jour ouvrable. En outre, les deux parties du protocole peut être effectuée simultanément, ce qui réduit le temps de demi-tour sensiblement. Tel que présenté ici, le panneau d&#39;identification est une sélection des bactéries les plus cliniquement pertinente dans notre hôpital. Depuis le principe est le ciblage de la région du gène 16S, des sondes spécifiques pour d&#39;autres microorganismes peuvent être conçus et ajoutés à l&#39;essai. Le test complet a été à l&#39;origine destiné à l&#39;analyse rapide des cultures de sang, mais peut aussi être utilisé pour le traitement des odes échantillons de matériaux Ther. C&#39;est aussi le cas pour les antibiotiques qui ont été utilisées pour les tests de sensibilité aux antibiotiques: les antibiotiques plus ou autre peut être ajoutée, basée sur les profils de résistance locaux et des lignes directrices.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium (NaCl) </td><td> Merck Chemicals </td><td> 106404 </td><td> 0,9% dans l&#39;eau </td></tr><tr><td> Vacutainer SST Tube séparateur de sérum 5 ml </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 367986 </td><td></td></tr><tr><td> Mueller-Hinton II bouillon </td><td> BD Diagnostic Dystems </td><td> 212322 </td><td> 44 g / L dans l&#39;eau </td></tr><tr><td> Centrifuger Rotixa 50 RS </td><td> Andreas Hettich GmbH &amp; Co. KG </td><td> 4910 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuger 5415 D </td><td> Eppendorf </td><td> Supprimé </td><td></td></tr><tr><td> Primaires </td> &lt;td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> na </td><td></td></tr><tr><td> Sondes </td><td> Sigma-Aldrich/Applied Biosystems </td><td> na </td><td></td></tr><tr><td> TaqManEnvironmental master mix 2.0 </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr><tr><td> iQ SybrGreen Supermix </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 170-8880 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp optique Plaque de réaction de 96 puits </td><td> Applied Biosystems </td><td> N8010560 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp Film adhésif optique </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> iQ plaques à 96 puits PCR </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 223-9441 </td><td></td></tr><tr><td> Microseal B joints adhésifs </td><td> Bio-Rad travailatories BV </td><td> MSB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> En temps réel système de détection par PCR </td><td> Applied Biosystems </td><td> ABI PRISM 7900HT </td><td></td></tr><tr><td> Real-Time PCR Detection System </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> MyiQ unique couleur </td><td></td></tr></tbody></table>

one-day workflow scheme for bacterial pathogen detection and antimicrobial resistance testing from blood cultures

Les bactériémies sont associées à des taux élevés de mortalité en raison de la manifestation probable de sepsis, sepsis sévère et du choc septique 1. Par conséquent, l&#39;administration rapide d&#39;une antibiothérapie adéquate est de première importance dans le traitement des infections sanguines. L&#39;élément essentiel dans ce processus est le timing, qui dépend fortement sur les résultats de l&#39;identification bactérienne et d&#39;antibiogramme. Ces deux paramètres sont couramment obtenus par la culture basée sur des tests, ce qui prend beaucoup de temps et prend en moyenne 24-48 heures 2, 4. L&#39;objectif de l&#39;étude était de développer basées sur l&#39;ADN des essais pour l&#39;identification rapide des infections sanguines, ainsi que les tests rapides de sensibilité aux antimicrobiens. Le premier essai est un 16S ADNr eubactériennes-temps réel basé sur la PCR complétées par espèce ou du genre des sondes spécifiques 5. L&#39;utilisation de ces sondes, bactéries à Gram négatif, y compris Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosaet Escherichia coli, ainsi que les bactéries Gram-positives, y compris Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., et Streptococcus pneumoniae peuvent être distinguées. L&#39;utilisation de ce test multisonde, une première identification de l&#39;agent causal micro-organisme a été donné après 2 h. Deuxièmement, nous avons développé un test moléculaire pour semi-tests de sensibilité aux antibiotiques de S. aureus, Enterococcus spp. et (facultatif) aérobies Gram-négatifs 6. Cet essai a été basée sur une étude dans laquelle la PCR a été utilisée pour mesurer la croissance des bactéries 7. Les bactéries récoltées directement à partir d&#39;hémocultures sont incubées pendant 6 h avec une sélection d&#39;antibiotiques, et suite à une SYBR Green-temps réel basé sur la PCR détermine l&#39;inhibition de la croissance. La combinaison de ces deux méthodes pourraient orienter le choix d&#39;une thérapie appropriée aux antibiotiques, le même jour (figure 1). En conclusion, L&#39;analyse moléculaire de l &#39;identification et la sensibilité aux antibiotiques offre une alternative plus rapide pour la détection des agents pathogènes et pourrait améliorer le diagnostic des septicémies.

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One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

La conception d&#39;un système de flux de travail d&#39;une journée simple pour le diagnostique des pathogènes bactériens permet la reconnaissance rapide des infections du sang. L&#39;inclusion de huit cliniquement pertinentes cibles bactériennes et leurs profils de résistance aux antibiotiques offre au clinicien un premier aperçu sur le même jour, ce qui peut conduire à un traitement plus adéquat.

Schéma de flux de travail d&#39;une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d&#39;hémocultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

one-day-workflow-scheme-for-bacterial-pathogen-detection

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JoVE Journal

Immunology and Infection

25.1K vues.  Maastricht University Medical Center. La conception d'un système de flux de travail d'une journée simple pour le diagnostique des pathogènes bactériens permet la reconnaissance rapide des infections du sang. L'inclusion de huit cliniquement pertinentes cibles bactériennes et leurs profils de résistance aux antibiotiques offre au clinicien un premier aperçu sur le même jour, ce qui peut conduire à un traitement plus adéquat.

Vidéo: One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

Une procédure de 1,5 heure pour l&#39;identification des Enterococcus Espèces directement à partir d&#39;hémocultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Recherche

Immunologie et infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

L&#39;invasion des cellules humaines par une bactérie pathogène

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

La salive, les glandes salivaires, et Collection hémolymphe de tiques Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in solution, has shown considerable potential in biochemical sensing applications with unprecedented sensitivity and specificity1-5. The drug-target interactions generate surface stress, causing the cantilever to bend, and the signal can be analyzed optically when it is illuminated by a laser. The change in surface stress measured with nano-scale precision allows disruptions of the biomechanics of model bacterial cell wall targets to be tracked in real time. Despite offering considerable advantages, multiple cantilever sensor arrays have never been applied in quantifying drug-target binding interactions.
Here, we report on the use of silicon multiple cantilever arrays coated with alkanethiol self-assembled monolayers mimicking bacterial cell wall matrix to quantitatively study antibiotic binding interactions. To understand the impact of vancomycin on the mechanics of bacterial cell wall structures1,6,7.&#160;We developed a new model1 which proposes that cantilever bending can be described by two independent factors; i) namely a chemical factor, which is given by a classical Langmuir adsorption isotherm, from which we calculate the thermodynamic equilibrium dissociation constant (Kd) and ii) a geometrical factor, essentially a measure of how bacterial peptide receptors are distributed on the cantilever surface. The surface distribution of peptide receptors (p) is used to investigate the dependence of geometry and ligand loading. It is shown that a threshold value of p ~10% is critical to sensing applications. Below which there is no detectable bending signal while above this value, the bending signal increases almost linearly,&#160;revealing that stress is a product of a local chemical binding factor and a geometrical factor combined by the mechanical connectivity of reacted regions and provides a new paradigm for design of powerful agents to combat superbug infections.

Acquired resistance to antibiotics is a major public healthcare problem and is presently ranked by the WHO as one of the greatest threats to human life. Here we describe the use of cantilever technology to quantify antibacterial resistance, critical to the discovery of novel and powerful agents against multidrug resistant bacteria.

Nanomechanics des interactions médicaments-cibles et la détection de la résistance aux antibactériens

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

PCR multiplex pour le typage des staphylocoques Cassette Chromosome Mec types I 

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

Préparation d&#39;une hémoculture Pellet pour Rapid bactérienne identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

amplification isotherme (LAMP) Essais de boucle médiation pour la détection des espèces spécifiques de<em&gt; Eimeria</em&gt; Qui infectent les poulets

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.