Notre méthode répond à des questions clés, telles que la charge globale de bactéries résistantes aux antibiotiques dans l’échantillon d’eau? Quelle est l’identité de ces bactéries et quels sont les différents types de caractères et de gènes résistants aux antibiotiques qu’elles portent? L’avantage de notre protocole est qu’il peut détecter même les bactéries qui ne peuvent pas être cultivées en laboratoire, qui constituent une proportion importante du total des bactéries dans l’échantillon d’eau.
Par conséquent, théoriquement, aucune bactérie ou ses traits résistants ne sont laissés de côté. Cette technique combinatoire impliquant à la fois des techniques basées sur la culture et indépendantes de la culture peut être reproduite et personnalisée pour tout échantillon obtenu à partir d’eaux usées, d’effluences pharmaceutiques ou hospitalières, de milieux cliniques et non cliniques, etc. En plus de Devika, Harshali Shinde et Maitri Mishra, deux chercheurs principaux de mon laboratoire, feront la démonstration des procédures expérimentales.
Pour commencer, traitez l’échantillon d’eau de manière aseptique en le filtrant à travers un chiffon de mousseline stérile pour éliminer toute particule. Ensuite, diluez en série l’échantillon d’eau filtrée pour une analyse plus approfondie. Pour déterminer la charge bactérienne totale, placer 100 microlitres des dilutions appropriées de l’échantillon d’eau filtrée sur les plaques de gélose R2A solidifiées et les duplicatas, et répartir uniformément.
Incuber toutes les plaques d’étalement de l’échantillon à 35 à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Après la période d’incubation, compter les colonies et exprimer la charge bactérienne totale en unités formant colonie par millilitre. Pour déterminer le nombre de bactéries résistantes aux antibiotiques, ajoutez les antibiotiques séparément dans des tubes contenant 20 millilitres de gélose R2A fondue stérile modifiée approximativement à 40 degrés Celsius.
Remuer pour mélanger uniformément et verser sur des plaques de Petri stériles avant que la gélose ne se solidifie. Pour le contrôle de la qualité et pour vérifier l’efficacité des antibiotiques, étaler 100 microlitres de suspension bactérienne sur leur antibiotique respectif contenant des plaques modifiées de gélose R2A. Incuber les plaques à 35 à 37 degrés Celsius pendant 48 heures, puis déterminer le nombre de bactéries.
Pour préparer le modèle d’ADN à partir des isolats pour la PCR, à l’aide d’un cure-dent stérile, prélever une seule colonie pure isolée de l’isolat en croissance sur une plaque de Petri. Suspendre la colonie bactérienne dans 100 microlitres d’eau distillée double stérile dans un tube de microcentrifugeuse et faire bouillir dans un bain-marie bouillant ou un bain sec pendant 10 minutes à 100 degrés Celsius. Centrifuger la suspension à 10 000 g pendant deux minutes pour enduire les débris et transférer le surnageant dans un tube microcentrifuge frais et stérile pour l’utiliser comme matrice d’ADN brut.
Pour amplifier la région V3 du gène de l’ARNr 16S par PCR, préparer 40 microlitres du mélange réactionnel dans un tube de PCR. Placez le tube dans le bloc thermique et exécutez le programme approprié dans le cycleur thermique PCR. Pour résoudre et visualiser les amplicons de PCR, mélanger 10 microlitres du produit PCR amplifié dans deux microlitres de tampon de chargement de gel 6x et charger ce mélange dans les puits d’un gel d’agarose à 1,5% avec une échelle d’ADN appariée de 100 bases pour estimer la taille des amplicons.
Effectuer l’électrophorèse du gel dans le tampon du réservoir TAE à 80 à 100 volts jusqu’à ce que le colorant de suivi fonctionne aux 3/4 du gel. Visualisez ensuite les bandes d’amplicon sous un transilluminateur UV. Pour préparer l’inoculum, inoculer de manière aseptique une seule colonie de résistance aux antibiotiques purifiée isolée à l’aide d’une boucle stérile dans deux millilitres de bouillon Luria-Bertani, ou LB, sans antibiotique et incuber à 37 degrés Celsius à 80 tr / min pendant la nuit.
Le lendemain, ajoutez 100 à 150 microlitres de la culture cultivée pendant la nuit à deux millilitres de bouillon LB frais non sélectif et incuber pendant deux à quatre heures jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 0,4 à 0,5. Diluer la suspension de culture fraîchement cultivée à l’aide d’une solution saline stérile à 0,85 % et mélanger doucement pour répartir les cellules uniformément afin d’atteindre une densité de culture équivalente à la norme McFarland de 0,5. Dans les 15 minutes suivant la dilution, tremper un coton-tige stérile dans l’inoculum et retirer l’excès de suspension pour éviter une inoculation excessive des plaques.
Ensuite, étalez la culture uniformément sur la plaque de gélose Mueller Hinton préparée, en commençant par le haut et en allant et venant d’un bord à l’autre. Ensuite, tournez la plaque de 60 degrés et recommencez à frotter. Pour placer les disques antibiotiques, utilisez une pince stérilisée à la flamme et transférez de manière aseptique les disques antibiotiques sur les plaques de gélose inoculée.
Appuyez doucement sur les disques pour assurer un niveau complet de contact avec l’agar-agar. Placer le nombre approprié de disques d’antibiotiques sur la plaque de gélose en tenant compte de l’organisme utilisé et de la taille de la plaque pour éviter le chevauchement des zones d’inhibition. Dans les 15 minutes suivant l’application du disque antibiotique, inverser les plaques et les incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, mesurez le diamètre de la zone d’inhibition en millimètres et interprétez-le en fonction des valeurs de seuil données par EUCAST. La charge bactérienne totale dans l’échantillon d’eau s’est avérée être de 3,0 x 10 à la neuvième UFC/mL, et la charge bactérienne résistante aux antibiotiques s’est avérée élevée. Les isolats culturels de résistance aux antibiotiques séquencés appartenaient à la famille des Enterobacteriaceae, la plupart étant Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae.
En outre, des bactéries opportunistes rares ont également été identifiées. Les tests de sensibilité aux antibiotiques par la méthode de diffusion discale ont montré un indice de résistance multiple aux antibiotiques d’environ 0,2 pour huit isolats, indiquant un degré élevé de résistance. Cependant, les espèces Comamonas et Arthrobacter n’ont montré de résistance à aucun des antibiotiques testés.
Les isolats cultivables ont révélé la présence de gènes de résistance aux antibiotiques codant pour les facteurs contre les bêta-lactamines, le triméthoprime et les aminoglycosides. L’analyse métagénomique de l’ADN pour la diversité bactérienne totale a conduit à l’identification de 50 phylums, indiquant la grande diversité bactérienne où Proteobacteria était le phylum le plus dominant, composé des classes Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria et Gammaproteobacteria. Au niveau de l’ordre, Burkholderiales était le plus répandu, appartenant à la classe des Betaproteobacteria.
Au niveau général, Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium et Comamonas étaient quelques-unes des bactéries abondantes. L’analyse métagénomique de l’ADN a également révélé davantage de gènes de résistance aux antibiotiques. Dans cette méthode, l’étape de dilution en série est critique car toute erreur peut conduire à une mauvaise interprétation de l’UFC totale et de la charge bactérienne résistante aux antibiotiques.
En outre, le diamètre de la zone d’inhibition doit être mesuré avec soin pour interpréter correctement si l’isolat est résistant ou sensible. En utilisant ces protocoles, outre l’échantillon d’eau, tout autre échantillon, qu’il soit environnemental, alimentaire ou clinique, peut être étudié. De plus, outre les bactéries, d’autres populations microbiennes dans n’importe quel écosystème peuvent également être étudiées en utilisant des approches similaires.
