Ce protocole présente une méthode à plusieurs niveaux, à la fois pour la détection de l’EST et pour la figure du phage. Il a également introduit un grand indice pour les sauvegardes afin de comparer les niveaux de DME de différentes technologies de contrôle. Cette technique économique est intelligente, à haut débit et multifonctionnelle.
Il a permis la mise en place du VAMS, un réseau de surveillance vétérinaire qui a collecté 20 000 gènes épidémiques et phages analytiques. Cette méthode peut également être utilisée pour surveiller et contrôler les bactéries pathogènes en médecine, en agriculture, en batterie cardiaque animale et en pêche. Ce protocole et ce document d’entreprise devraient prévoir d’être un.
Nous avons un guide de formation technique. Le suivre aiderait n’importe qui à maîtriser la technique en peu de temps. Commencez par incuber l’organisme de contrôle de la qualité E. coli et 93 souches de salmonelles d’essai sur des plaques de gélose Mueller-Hinton.
Ensuite, diluez 10 fois l’inoculum préparé de chaque souche. Transférez 200 microlitres de solution saline normale stérile dans le puits a-1 d’une plaque à 96 puits comme témoin négatif. Ensuite, pipeter deux suspensions d’E. coli dans les puits a-2 et a-3 en tant que contrôles positifs et de qualité respectivement.
Aux 93 puits restants, ajouter 200 microlitres de la souche d’essai diluée. Pour la préparation des plaques de gélose antimicrobienne. Tout d’abord, définissez les plages de concentration pour les différents agents antibactériens testés, selon l’indice LAR.
Effectuer un schéma de dilution de doublement log-deux pour la solution d’antibiotique en suivant la méthode de dilution de gélose standard CLSI. Ajoutez maintenant deux millilitres de solution antimicrobienne dans une bouteille en verre stérilisée contenant 18 millilitres de gélose Mueller-Hinton fondue. Après avoir bien mélangé, verser dans des assiettes à l’intérieur d’une armoire de sécurité bio.
Laissez la gélose se solidifier à température ambiante. Assurez-vous de laisser un espace sous le couvercle des plaques pour permettre le séchage de la surface de la gélose. Étiquetez les types d’agents antimicrobiens et leurs concentrations respectives sur la face inférieure des plaques incubées.
Disposez les multiples plaques incubées pour chaque agent antimicrobien dans une pile disposée en log deux en doublant l’ordre de dilution. Enfin, préparez deux plaques de gélose sans médicament pour servir de témoins pour chaque agent. Installez une plaque d’inoculation stérilisée sur le support d’un inoculateur à matrice de 96 points à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique.
Ensuite, disposez le bloc de graines préparé avec des souches testées et une plaque incubée d’agar sur le support mobile. Poussez le support mobile jusqu’à ce que le bloc de semences se trouve sous la plaque de broches d’inoculation. Appuyez maintenant sur la poignée de commande et abaissez la plaque de broches d’inoculation, en guidant les 96 broches vers l’inoculum dans les 96 puits du bloc de semences.
Relâchez la poignée de commande de manière contrôlée et réinitialisez automatiquement la plaque de goupille d’inoculation pour bien remuer chaque inoculum et tremper, appuyez sur la poignée de commande deux à trois fois. Ensuite, déplacez et positionnez la plaque de support de manière à ce que la plaque d’incubation se trouve sous la plaque de broches d’inoculation. Appuyez sur la poignée de commande, abaissez la plaque de la broche d’inoculation et laissez-la pendant une à deux secondes pour assurer un contact complet avec la surface de la plaque incubée.
Relâchez la poignée de commande pour terminer un cycle d’inoculation. Replacez la plaque incubée et répétez le processus jusqu’à ce que le lot de plaques de gélose antimicrobienne soit terminé. Passez à une nouvelle plaque d’inoculation et à un nouveau bloc de graines pour inoculer un autre groupe de souches testées.
Incuber les plaques de gélose antimicrobienne inoculées à température ambiante jusqu’à ce que l’humidité des taches d’inoculum soit complètement absorbée par la gélose. Après l’incubation, inversez les plaques et poursuivez l’incubation pour permettre aux bactéries non inhibées de former des colonies. Pour effectuer l’acquisition d’images et les statistiques de données, commencez par cliquer sur le système d’acquisition d’images AST à matrice de 96 points pour lancer le programme.
Dans la barre des tâches, sélectionnez Informations de test. Cliquez sur Nouveau pour créer une nouvelle tâche de test et renseignez les informations requises. Appuyez ensuite sur la collecte de données, puis sur la photo et l’élément de test pour sélectionner la tâche nouvellement créée.
Choisissez antibiotiques pour sélectionner le nom de l’antibiotique et gradient pour sélectionner la concentration initiale de l’antibiotique. Enfin, cliquez sur connecter pour établir une connexion avec le convertisseur d’acquisition d’images. Ensuite, placez les plaques incubées sur la base de la plaque de détection et insérez-les dans le convertisseur d’acquisition d’images.
Cliquez sur collection pour capturer des images des plaques. Appuyez sur antibiotiques et sélectionnez le prochain jeu de plaques. Choisissez le dégradé pour identifier le dégradé de départ, puis passez à la prochaine série de collecte d’images.
Finalisez la procédure en cliquant sur Soumettre pour déterminer la formation de colonies et convertir les images en concentrations inhibitrices minimales, c’est-à-dire les valeurs CMI. Cliquez sur la requête pour accéder à tous les résultats du MIC. Commencez par utiliser la méthode de gélose à double couche pour produire différents phages.
Diluez les phages à une concentration parallèle appropriée et ajoutez 200 microlitres d’inoculum de phages dans le bloc de semences à 96 puits. Ensuite, préparez une plaque incubée à double couche pour chaque souche à examiner. Laissez un espace sous le couvercle de l’assiette à double couche pour permettre le séchage.
Placez le bloc de graines de phage préparé et la plaque à double couche sur le support mobile de l’inoculateur à matrice à 96 points. Transférez tous les phages inoculaires sur la surface semi-gélosée. Laissez les plaques rester à température ambiante jusqu’à ce que toute l’humidité inoculaire ait été absorbée par la gélose semi-gélose.
Maintenant, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pour les souches testées pendant quatre à six heures. Utilisez le convertisseur d’acquisition d’images pour obtenir et enregistrer l’image du résultat expérimental de chaque plaque double couche. Enregistrez le nombre et les morphologies des différentes formes de taches dans un tableur à partir des images obtenues et calculez les proportions respectives des différents types de phages.
L’étude morphologique de la croissance de la salmonelle sur des plaques contenant de l’ampicilline a montré que le témoin négatif dans a-1 ne présentait aucune croissance. La CMI de la souche de salmonelle dans a-4 était de 64 microgrammes par millilitre, tandis que celle de a-5 était de 16 microgrammes par millilitre. Les valeurs de résistance en pourcentage de l’ampicilline, de la ciprofloxacine et de l’amoxicilline-acide clavulanique étaient supérieures à 50 %Alors que celles de la doxycycline, du florfénicol, du céfotaxime et de l’enrofloxacine étaient de 30 % à 50 %La gentamicine, l’amikacine et le méropénème présentaient des valeurs de résistance en pourcentage inférieures à 30 %Les indices LAR de la ciprofloxacine et de l’amoxicilline-acide clavulanique différaient de manière significative.
Des analyses morphologiques de la croissance de salmonelles sur des plaques à double couche ont montré que quatre taches principales ont été observées dans la morphologie des phages. La tache lytique claire et ronde provenait d’un phage qui pouvait tuer de manière fiable l’hôte sur la plaque, mais qui peut ou non se répliquer avec succès aux dépens de cet hôte. La collection de plaques a été formée par de vraies plaques.
La tache lytique trouble résultait d’un phage qui ne tuait pas de manière fiable l’hôte sur la plaque, et qui peut ou non se répliquer avec succès aux dépens de cet hôte. La tache non lytique indiquait une nature non lytique. Cette technique permet de transférer efficacement 96 lentilles de gélose à la fois et les instruments reconnaissent automatiquement les images, puis calculent les dés de ligne.
Cette technologie devrait promouvoir la recherche et l’industrialisation des phages et l’application des phages est l’un des moyens étonnants de réduire et de résoudre le problème de la résistance aux antimicrobiens.
