Les travaux rapportés ici ont été pris en charge par des subventions de l&#39;Université d&#39;Auburn AUDFS et USAF CRADA 07-277-60MDG-01. Les opinions exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas la politique ou la position officielle de l&#39;Armée de l&#39;Air des États-Unis, ministère de la Défense ou le gouvernement américain.

1. Préparer le terrain <ol><li> Obtenir souche de type S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 et Bacillus subtilis ATCC 6051. Souches résistantes à la méthicilline de S. aureus - MRSA1, le SARM 2, le SARM 5, 13 SARM, le SARM 26, 34 SARM, le SARM 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Le phage lytique 12600. </li><li> Obtenir PBP 2a anticorps billes de latex conjuguées. </li><li> Préparer NZY moyen comme décrit 21. </li><li> Procurez-phosphate solution saline tamponnée (PBS). </li><li> Préparez de l&#39;eau déminéralisée comme sous-phase de Langmuir-Blodgett (LB) de dépôt de la monocouche. </li></ol> 2. Propagation de bactériophages et la titration <ol><li> Incuber 5 ml de culture de nuit de S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 unités formant colonies (UFC) / ml) avec 500 pi de phage (3 x 10 9 &lt;/ Sup&gt; UFP / ml) dans 500 moyen de NZY ml à 2 L Flack sur agitateur-incubateur à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Centrifugeuse culture à 4,424 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Surnageant re-centrifugé à 11.325 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Surnageant filtrer à travers un filtre Millipore 0,22 um. </li><li> Centrifuger le filtrat à 75 395 g pendant 1,5 heures. </li><li> Dissoudre le culot dans 100 ul d&#39;eau distillée. </li><li> Préparer des dilutions de 10 fois de suspension de phages dans le milieu NZY. </li><li> Plaque 1 ml de culture de la nuit (ON) de S. aureus ATCC 12600 sur chacun des 2 plaques avec de l&#39;agar NZY pour s&#39;assurer que toute la surface est couverte. Enlevez l&#39;excédent de la culture et de laisser sécher la surface pendant 30 min. </li><li> Détecter un échantillon (10 ul) de la dilution appropriée de phage sur la surface de la plaque et incuber à 37 ° C pendant 18 à 24 h. </li><li> Examiner la formation de plaques et de calculer le titre des phages. Les titres bactériophages (T) sont estimés sur la base du nombre de pLaques (N) formé par le volume 10 ul (v) de la suspension de phages et le facteur de dilution (F). Le titre a été calculé par la formule:. T = N / (vxf) Par exemple, pour le nombre de plaques 75 à la dilution 10 -7 et le volume de 10 pi (10 x 10 -3 ml), le titre est égal 75 / (10 x 10 -3 x 10 -7) = 7,5 x 10 10 unités formant des plages (pfu) par ml de suspension. </li></ol> 3. Phage or immobilisé <ol><li> Morceaux de quartz revêtues d&#39;or propre (60 mm 2) par gravure plasma à l&#39;argon pendant 10 min, puis stériliser pendant 6 heures sous la lumière UV dans une armoire stérile. </li><li> Ajouter 50 microlitres de 1 x 10 9 PFU / ml suspension de phages à la surface d&#39;or de chaque pièce dans une boîte de Pétri stérile, puis incuber pendant la nuit dans une chambre humide à température ambiante. </li><li> Retirez et titrer la suspension de phages restant. </li><li> Lavez morceaux avec phages liés 5 fois avec du PBS pour éliminer non liéephage. </li></ol> 4. Test de Immobilisé infectiosité du phage sur une surface sèche <ol><li> Étaler une culture de la S. Aureus ATCC 12600 O / N sur une plaque de gélose NZY et laisser sécher. </li><li> Placer une pièce d&#39;or avec des phages immobilisés sur la face de la plaque vers le bas. </li><li> Respecter une zone de lyse après 12 heures d&#39;incubation à 37 ° C qui indique infectiosité. </li><li> Utilisez des morceaux couverts d&#39;or sans phage dans des expériences de contrôle. </li></ol> 5. Test de l&#39;activité lytique du phage libre et liée en liquide <ol><li> Ajoutez une culture de S. ON aureus ATCC 12600 à 10 ml de NZY dans tous les 300 ml de quatre flacons arme de poing (6 x 10 6 UFC / ml dans chaque flacon). </li><li> Ajouter dans deux fioles 2 x 10 6 pfu / ml de phage libre. </li><li> Utilisez les deux autres ballons comme témoins. </li><li> Surveiller l&#39;évolution temporelle de S. la lyse des cellules de Staphylococcus à 570 min par la mesure de la densité optique (OD 600) à intervalles de 30 min pour toutes les fioles.</li><li> Prendre une mesure finale à 24 h. </li><li> Répétez les étapes 5.1 à 5.5, mais utiliser des pièces d&#39;or avec des phages liés au lieu de phages libres, et des pièces d&#39;or sans phage dans des flacons de contrôle. </li></ol> 6. Perte de phages liés pendant l&#39;incubation <ol><li> Ajouter 50 pi de 1 x 10 9 PFU / ml phage sur la surface de pièce d&#39;or stérile dans une boîte de Pétri qui est placé dans une chambre humide pendant la nuit à température ambiante. </li><li> Retirez la suspension de phage non lié à la surface d&#39;or et le titre. </li><li> Laver la pièce d&#39;or avec phages liés 5 fois avec du PBS et les placer dans une solution à 1 NZY ml dans 15 ml tube dans un shaker-incubateur à 37 ° C pendant 8 heures. </li><li> Déterminer le titre du phage détaché comme décrit dans 2. </li></ol> 7. Phage Spheroids Préparation <ol><li> La combinaison de 400 pi de stock phage 12600 suspension (10 11 PFU / ml) avec un volume égal de chloroforme qualité spectrophotométrique dans 1 ml flaconà la température ambiante. </li><li> Doucement vortex la suspension de phages chloroforme 5-6 fois (intervalles de 5 secondes) sur une durée minute. </li><li> Laisse la suspension se stabiliser pendant 30 secondes et ensuite la pipette de la phase supérieure contenant sphéroïdes a été prélevée à la pipette pour la préparation de la monocouche. </li><li> Prendre quelques microlitres de la suspension des sphéroïdes pour la transmission et la microscopie électronique à balayage. </li><li> Utilisez une suspension sphéroïde restant pour la fabrication de biocapteurs. </li></ol> 8. Préparation biocapteur <ol><li> Nettoyer les capteurs QCM-D par gravure plasma à l&#39;argon pendant 10 min PDC-32G Harrick propre plasma. </li><li> Rincer capteur avec de l&#39;hexane pour éliminer les impuretés organiques. </li><li> Préparer et nettoyer une goulotte de l&#39;équilibre du film tel que décrit dans 22. </li><li> Remplissez creux LB avec une solution sous-phase et nettoyez-le avec une barrière de creux et de stabiliser le bac à 20 ± 0,1 ° C </li><li> Étaler 300 aliquote de phage 12600 en suspensi aqueusele (10 11 PFU / ml) sur subphase LB. </li><li> Préparer monocouche de phage sur une solution de sous-phase de LB en permettant à 300 aliquote de phage suspension aqueuse 12600 (10 11 PFU / ml) de descendre une tige de verre mouillable inclinée qui est partiellement immergé dans la sous-phase 22,23. </li><li> Stabiliser la monocouche préparé pendant 10 min, et ensuite le comprimer à une vitesse de 30 mm / min (45 cm 2 / min), jusqu&#39;à ce qu&#39;une pression constante de 19 N / m est atteinte. </li><li> Effectuer un dépôt de film sur la verticale positionnée perpendiculairement capteur QCM-D à une vitesse de 4,5 mm / min en trempant successivement capteur dans et hors de la monocouche sept fois. La microscopie électronique de dépôt de monocouches de phages avant l&#39;exposition à des échantillons bactériens ont montré que les couches étaient continu, homogène et uniforme (données non présentées). </li><li> Répétez les étapes 4,5-4,8 avec une suspension sphéroïde phage qui est préparé en 3. </li><li> Utilisez biocapteurs de phages fabriqués pour la détection de SARM, d&#39;électronsmicroscopie et ellipsométrie. </li></ol> 9. Test biocapteur, la discrimination de résistant à la méthicilline et bactéries Staphylococcus sensibles <ol><li> Dans ce protocole, les biocapteurs avec phage non modifié et modifié et sphéroïdes de phages sont préparés. Une microbalance à cristal de quartz avec les quatre chambres d&#39;écoulement de capteur est utilisé pour surveiller la liaison de bactéries au phage immobilisé sur la surface du capteur QCM. PBP 2a anticorps billes de latex conjugués sont utilisés pour discriminer entre résistant à la méthicilline (SARM) et les bactéries de staphylocoque sensibles. Toutes les mesures sont effectuées en mode de débit (50 l / min) à 5 MHz. </li><li> Établir une fréquence de résonance de ligne de base du capteur QCM dans l&#39;eau (~ 30 min). </li><li> Dessiner une suspension de cellules vivantes sensibles à la méthicilline staphylococcus bactériens dans l&#39;eau (10 9 UFC / ml) à travers la cellule d&#39;essai. </li><li> Continue de surveiller les changements dans la fréquence de résonance des capteurs et de la dissipation de l&#39;énergie pour la première harmonique, using le logiciel Q-Soft. </li><li> Lorsque les changements dans la fréquence de résonance des capteurs et de la dissipation atteint des niveaux de saturation, ajouter la suspension de PBP anticorps billes de latex conjuguées (6,77 x10 10 billes / ml) à la circulation au cours de la surveillance continue de la fréquence et de la dissipation. </li><li> Répétez les étapes 9.2-9.5 pour résistant à la méthicilline cellules bactériennes méthicilline (SARM). </li><li> Définir un changement de fréquence à travers la variation de la masse dues à des bactéries de liaison par l&#39;équation Sauerbrey 24,25 Af = xn-Δm / C, où C est la sensibilité masse constante (C = 17,7 ng x cm -2 x -1 Hz à 5 MHz ), m est la masse, et n est le nombre d&#39;harmonique (n = 1). </li><li> Définir un changement de dissipation d&#39;énergie (Δ D) à partir de l&#39;enregistrement de la décroissance exponentielle de l&#39;oscillation (la fréquence et de l&#39;amplitude d&#39;amortissement, ce qui a permis la quantification de l&#39;énergie dissipée et stockée pendant une période d&#39;oscillation,E dissipée et E stocké, respectivement: Δ D = E dissipée / 2 πE stocké. Δ D est mesuré en unités de dissipation (UA), l&#39;un = 10 -6 unités relatives UA). </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Plating+Methods.">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Il est bien connu que les phages peuvent être utilisés comme sondes de biocapteurs pour les bactéries pathogènes 28. Il est démontré dans ce travail que phage avec des anticorps 2a PBP peut être utilisé pour résoudre le vieux problème: les souches résistantes et sensibles aux antibiotiques discrimination rapides. Il a été constaté cependant ces phages de staphylocoques non modifiés normales ne sont pas adaptés pour la détection des bactéries avec des dispositifs ...

Souches résistantes à la méthicilline de Staphylococcus aureus ont été suggérés comme un facteur dans les infections et les épidémies nosocomiales essentielles 4-8. Les moyens ordinaires de la reconnaissance de la résistance à la méticilline, comme la diffusion test de disque d&#39;oxacilline d&#39;agar écran, ou microdilution, s&#39;appuient sur des conditions de culture adaptées pour améliorer l&#39;expression de la résistance. Les modifications comprennent l&#39;utilisation de l&#39;oxacilline, incubation à 30 ou 35 ° C plutôt qu&#39;à 37 ° C, et l&#39;ajout de NaCl dans le milieu de croissance. En outre, pour la détection correcte par ces types de techniques, une longue période d&#39;incubation de 24 heures au lieu de 16 à 18 heures est nécessaire. Techniques rapides avec le niveau approprié (&gt; 96%) de la sensibilité pour l&#39;identification de la résistance à la méticilline comprennent des techniques de microdilution automatisés tels que le Vitek carte GPS-SA, le système Rapid ATB Staph, et le système de panneau Microscan rapide qui produisent des résultats après 3-11 h 9-11. The Crystal MRSA système ID est une méthode rapide basée sur la reconnaissance de la croissance de S. aureus, en présence de 2% de NaCl et 4 mg d&#39;oxacilline par litre avec un détecteur de fluorescence sensible à l&#39;oxygène. Sensibilités réclamés varient entre 91 à 100% après 4 h d&#39;incubation 12-14. Ces méthodes phénotypiques sont limités dans leurs exactitudes par l&#39;impact des souches prévalentes qui expriment la résistance hétérogène. Par conséquent, les méthodes les plus largement acceptée pour la reconnaissance de la résistance à la méticilline est l&#39;hybridation du gène mecA 15 PCR ou de l&#39;ADN. Cependant cette technique nécessite l&#39;ADN purifié et est extrêmement sensible à divers adjuvants (impuretés), qui comprennent 16 débris cellulaires. En outre, ces techniques ont besoin de temps pour réaliser. Stratégies pour la reconnaissance du produit du gène mecA, la protéine PBP 2a, pourraient être utilisés pour déterminer la résistance et peuvent être plus fiable par rapport aux techniques de test standard 17. de Staphylococcus aureus, y compris ceux ayant une résistance à la méthicilline 1,2,18. Dans ce travail, nous avons proposé une nouvelle technique dans la détection et l&#39;identification spécifique de SARM, comme la reconnaissance des bactéries avec conformation du SARM en temps réel. A cet effet, un spécifique S. bactériophage aureus avec un large spectre d&#39;hôtes (y compris les souches de SARM) combiné avec un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine (PBP 2a) ont été utilisés. PBP 2a est une protéine de paroi cellulaire et elle est la cause de la résistivité de l&#39;antibiotique SARM. Cependant anticorps 2a PBP n&#39;est pas spécifique à S. aureus depuis quelques autres bactéries ont des protéines de liaison aux antibiotiques avec une similarité de séquence PBP 2a 19,20. Par conséquent, dans ce travail, S. bactériophage aureus et des anticorps contre la protéine PBP 2a ont été utilisées. Pour être en mesure de développer un biocapteur de spécificationquement détecter et identifier SARM un dispositif à deux temps, a été utilisée. La première étape a utilisé un S. aureus bactériophage monocouche en tant que sonde de détection, tandis que la seconde étape utilise PBP 2a anticorps spécifiques. Par conséquent, la première étape comprendra S. la bactérie Staphylococcus, comme l&#39;autre seront sensibles à la protéine antibiotique contraignant. Lorsque les signaux reçus des deux étapes sont positifs, cela indique la détection spécifique de SARM.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) </td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P4417 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>spectrophotometric-grade chloroform </td>
			<td>Sigma-Aldrich, 
				St. Louis, MO </td>
			<td>154733 </td>
			<td>(99.8% A.C.S.) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hexane-Anhydrous </td>
			<td>Sigma-Aldrich, 
				St. Louis, MO</td>
			<td>29609-0</td>
			<td>(95%)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethyl Alcohol </td>
			<td>Pharmco products Inc. Brookfield, CT </td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>190 Proof</td>
		 </tr>	
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBP 2a antibody conjugated latex beads</td>
			<td>Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>The MRSA-Screen test</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from </td>
			<td>American Type Culture Collection (Manassas, VA);</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 </td>
			<td>The culture collection of Auburn University, Auburn, AL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K
				Ultra Centrifuge</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>KSV 2200 LB film balance</td>
			<td>KSV Chemicals, Finland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Light microscope optical system </td>
			<td>CitoViva Technology Inc., Auburn, AL </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>QCM-D</td>
			<td>Q-Sense AB, V&auml;stra Fr&ouml;lunda, Sweden </td>
			<td>E4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Scanning electron microscope (SEM)</td>
			<td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td>
			<td>JEOL-7000F SEM </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Transmitting electron microscopy (TEM)</td>
			<td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td>
			<td>JEOL, JEM 2010 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stericup, Presterilized</td>
			<td>Millipore Corporation, Billerica, MA</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>0.22 &mu;m, GP Express PLUS membrane</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bio-Assay dish</td>
			<td>NUNC A/S, Denmark</td>
			<td>240835</td>
			<td>Dimensions(mm), 245 x 245 x 25</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Gilson, Pipetman, France</td>
			<td>P100, P200, P1000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>C24 Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, CT</td>
			<td>Classic C24</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gold-coated quartz pieces</td>
			<td>Auburn University, AL</td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Brand, USA</td>
			<td>0875713</td>
			<td>100 mmX15 mm </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SterilGard III Advance</td>
			<td>The Baker Company, ME</td>
			<td>SG403</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Culture Growing Flasks</td>
			<td>Corning Incorporated, NY</td>
			<td>4995</td>
			<td>PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optical Spectrometer</td>
			<td>Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.</td>
			<td>4001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, USA</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Millipore water purification system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Direct-Q</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaging Ellipsometer</td>
			<td>Accurion, USA</td>
			<td>nanofilm_ep3se
			</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software </td>
			<td>Q-Sense AB, Sweden</td>
			<td>QSoft, QTools</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

biosensor for detection of antibiotic resistant staphylococcus bacteria

Un bactériophage lytique structurellement transformée ayant un large spectre d&#39;hôte des souches de Staphylococcus aureus et une protéine liant à la pénicilline (PBP 2a) anticorps billes de latex conjuguées ont été utilisées pour créer un biocapteur conçu pour discrimination résistant à la méthicilline (SARM) et sensible (SASM) S . espèces de Staphylococcus 1,2. Les phages lytiques ont été transformés en sphéroïdes phages par le contact avec l&#39;interface eau-chloroforme. Phage monocouches sphéroïde ont été déplacés sur une surface du biocapteur par Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. Les biocapteurs créés ont été examinés par une microbalance à cristal de quartz avec un suivi de dissipation (QCM-D) pour évaluer les interactions bactéries-phages. Interactions bactéries-sphéroïde conduit à la fréquence de résonance réduite et une augmentation de la dissipation d&#39;énergie pour les deux souches de SARM et SASM. Après la liaison bactérienne, ces capteurs ont été plus exposées à l&#39;anticorps protéine liant à la pénicilline perles de latexs. Capteurs analysés par le SARM ont répondu à PBP 2a perles d&#39;anticorps, bien capteurs inspectés avec MSSA donné aucune réponse. Cette distinction expérimentale détermine une discrimination claire entre résistant à la méthicilline et S. sensible souches de Staphylococcus. Également liées et non liées bactériophages supprimer la croissance bactérienne sur les surfaces et dans les suspensions de l&#39;eau. Une fois phages lytiques sont changés en sphéroïdes, ils conservent leur activité lytique forte et montrent une grande capacité de capture bactérienne. Les phages et les phages sphéroïdes peuvent être utilisés pour les essais et la stérilisation des micro-organismes résistant aux antibiotiques. D&#39;autres applications peuvent inclure l&#39;utilisation en thérapie bactériophage et surfaces antimicrobiennes.

Le phage a démontré une activité lytique contre toutes les souches testées de S. aureus, y compris les souches de SARM, comme indiqué par le test de la goutte de phage. tailles de plaque variaient généralement de 5 à 15 mm. Aucune activité n&#39;a été trouvée contre les autres-cultures d&#39;essai (tableau 1). Une croissance normale de S. aureus ATCC 12600 dans un milieu NZY sur agitateur-incubateur à 37 ° C est représenté en figure ...

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Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biocapteurs de phages lytiques et des perles d&#39;anticorps sont capables de discriminer entre résistant à la méthicilline (SARM) et les bactéries de staphylocoque sensibles. Les phages ont été immobilisés par une méthode de Langmuir-Blodgett sur une surface d&#39;un capteur à microbalance à cristal de quartz et a travaillé comme Large gamme des sondes de staphylocoque. perles d&#39;anticorps reconnaissent SARM.

Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

biosensor-for-detection-antibiotic-resistant-staphylococcus

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.9K vues.  Auburn University. Biocapteurs de phages lytiques et des perles d'anticorps sont capables de discriminer entre résistant à la méthicilline (SARM) et les bactéries de staphylocoque sensibles. Les phages ont été immobilisés par une méthode de Langmuir-Blodgett sur une surface d'un capteur à microbalance à cristal de quartz et a travaillé comme Large gamme des sondes de staphylocoque. perles d'anticorps reconnaissent SARM.

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Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them good candidates for high sensitivity biosensors. When a charged molecule binds to such a sensor surface, it alters the carrier density5 in the sensor, resulting in changes in its DC conductance. However, in an ionic solution a charged surface also attracts counter-ions from the solution, forming an electrical double layer (EDL). This EDL effectively screens off the charge, and in physiologically relevant conditions ~100 millimolar (mM), the characteristic charge screening length (Debye length) is less than a nanometer (nm). Thus, in high ionic strength solutions, charge based (DC) detection is fundamentally impeded6-8.
We overcome charge screening effects by detecting molecular dipoles rather than charges at high frequency, by operating carbon nanotube field effect transistors as high frequency mixers9-11. At high frequencies, the AC drive force can no longer overcome the solution drag and the ions in solution do not have sufficient time to form the EDL. Further, frequency mixing technique allows us to operate at frequencies high enough to overcome ionic screening, and yet detect the sensing signals at lower frequencies11-12. Also, the high transconductance of SWNT transistors provides an internal gain for the sensing signal, which obviates the need for external signal amplifier.
Here, we describe the protocol to (a) fabricate SWNT transistors, (b) functionalize biomolecules to the nanotube13, (c) design and stamp a poly-dimethylsiloxane (PDMS) micro-fluidic chamber14 onto the device, and (d) carry out high frequency sensing in different ionic strength solutions11.

We describe the device fabrication and measurement protocol for carbon nanotube based high frequency biosensors. The high frequency sensing technique mitigates the fundamental ionic (Debye) screening effect and allows nanotube biosensor to be operated in high ionic strength solutions where conventional electronic biosensors fail. Our technology provides a unique platform for point-of-care (POC) electronic biosensors operating in physiologically relevant conditions.

Fabrication de nanotubes de carbone à haute fréquence Nanoélectronique biocapteur pour détecter en haute force ionique

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Recherche

Bio-ingénierie

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Détection optique de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérie par mésoporeux Silicon biocapteurs

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria survive these stressful conditions. The hypothesis behind this method is new: stress activation of biochemical pathways, which are targets of antibiotics, can accelerate antibiotic susceptibility testing. As compared to standard antibiotic susceptibility testing methods, the rate-limiting step -&#160;bacterial growth -&#160;is omitted during antibiotic application. The technical implementation of the method is in a combination of standard techniques and innovative approaches. The standard parts of the method include bacterial culture protocols, defining microfluidic channels in polydimethylsiloxane&#160;(PDMS), cell viability monitoring with fluorescence, and batch image processing for bacteria counting. Innovative parts of the method are in the use of culture media flow for mechanical stress application, use of enzymes to damage but not kill the bacteria, and use of microarray substrates for bacterial attachment. The developed platform can be used in antibiotic and nonantibiotic related drug development and testing. As compared to the standard bacterial suspension experiments, the effect of the drug can be turned on and off repeatedly over controlled time periods. Repetitive observation of the same bacterial population is possible over the course of the same experiment.

We have developed a microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria can survive these stressful conditions.

Tests de sensibilité aux antibiotiques induits par le stress sur une puce

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Haut-débit Identification des bactéries Polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

L’utilisation d’un test de base de β-lactamase conductimétriques biocapteur pour détecter des Interactions biomoléculaires

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Développement d’un Biocapteur électrochimique ADN pour détecter un pathogène d’origine alimentaire

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

Stratégie d&apos;analyse biopanning et bioinformatique à haut débit basée sur biocapteur pour la validation globale des interactions médicament-protéines

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to develop practical technologies that couple microscopic cell screening with cell isolation at high purity for downstream genetic analysis. Here, the use of photodegradable poly(ethylene glycol) hydrogels for screening and isolation of bacteria with unique growth phenotypes from heterogeneous cell populations is described. The method relies on encapsulating or entrapping cells with the hydrogel, followed by culture, microscopic screening, then use of a high-resolution light patterning tool for spatiotemporal control of hydrogel degradation and release of selected cells into a solution for retrieval. Applying different light patterns allows for control over the morphology of the extracted cell, and patterns such as rings or crosses can be used to retrieve cells with minimal direct UV light exposure to mitigate DNA damage to the isolates. Moreover, the light patterning tool delivers an adjustable light dose to achieve various degradation and cell release rates. It allows for degradation at high resolution, enabling cell retrieval with micron-scale spatial precision. Here, the use of this material to screen and retrieve bacteria from both bulk hydrogels and microfabricated lab-on-a-chip devices is demonstrated. The method is inexpensive, simple, and can be used for common and emerging applications in microbiology, including isolation of bacterial strains with rare growth profiles from mutant libraries and isolation of bacterial consortia with emergent phenotypes for genomic characterizations.

The use of photodegradable hydrogels to isolate bacterial cells by utilizing a high-resolution light pattering tool is reported. Essential experimental procedures, results, and advantages of the process are reviewed. The method enables rapid and inexpensive isolation of targeted bacteria showing rare or unique functions from heterogeneous communities or populations.

Interfaces d’hydrogel photodégradables pour le dépistage, la sélection et l’isolement des bactéries

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Measurement of the Acid-Resistant Fluorescent Reporter Protein mCherry2

Pick any colony from the MRS agar plate containing electroporated L.reuteri cells and inoculate into a 96 well microplate containing filter sterilized MRS broth per well and an appropriate selection antibiotic. Incubate aerobically for 24 hours at 37 degrees Celsius without shaking. The next day, L.reuteri will precipitate out of the media in the stationary phase.Resuspend the culture by pipetting. Add 200 microliters of culture into a flat, clear, bottom 96 well plate. Transfer the plate to a plate reader and measure the optical density and fluorescence of M cherry two and other relevant reporters.Colony morphology noticeably changes in the presence of oxygen. Under low oxygen conditions colonies appear white, opaque, smooth and round. Under partial or leaky conditions, colonies appear undulate, and umbanet.Whereas under atmospheric oxygen levels colonies always appear low bait, round and dry. In wild Type L.rueteri, growth and reporter protein expression vary between colonies making accurate deductions difficult. Plasmid curing, and re-transformation can result in more stable expression but it is an uncommon and unique occurrence reliant on more stable mutant phenotypes spontaneously occurring.

Mesure de la protéine rapporteur fluorescente résistante aux acides mCherry2

<meta charset="utf8"></head><body>Nanocomposites antibactériens d’oxyde de graphène/cuivre pour bactéries résistantes

Fabrication of Antibacterial Graphene Oxide/Copper Nanocomposites

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to antibiotics. Developing&#160;antimicrobial agents that can replace existing antibiotics is essential because antibiotic-resistant bacteria have resistance mechanisms for all current antibiotics and can promote nosocomial infections. To address this challenge, in this study, we propose graphene oxide/copper (GO/Cu) nanocomposites as antibacterial materials that can replace the existing antibiotics. GO/Cu nanocomposites are characterized by transmission electron microscopy and scanning electron microscopy. They show that copper (Cu) nanoparticles are well-grown on the graphene oxide sheets. Additionally, a microdilution broth method is used to confirm the efficacy of the antimicrobial substance against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), which are frequently implicated in nosocomial infections. Specifically, 99.8% of MRSA and 84.7% of P. aeruginosa are eliminated by 500 &#181;g/mL of GO/Cu nanocomposites. Metal nanocomposites can eradicate antibiotic-resistant bacteria by releasing ions, forming reactive oxygen species, and physically damaging the bacteria. This study demonstrates the potential of antibacterial GO/Cu nanocomposites in eradicating antibiotic-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Des nanocomposites métalliques pour éliminer les bactéries résistantes aux antibiotiques

Herein, we introduce graphene oxide/copper (GO/Cu) nanocomposites as an antibacterial nanomaterial. The antibacterial effectiveness of the GO/Cu nanocomposites was evaluated against both antibiotic-resistant gram-positive and gram-negative bacteria.

Fabrication de nanocomposites antibactériens d’oxyde de graphène et de cuivre

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to ...