Nous remercions les ingénieurs et les étudiants du Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. Pour avoir contribué à la conception, à l’usinage et à l’automatisation du système expérimental, nous remercions Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin et le Dr Sudong Shu. Nous remercions Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu et Katarzyna Kuliga pour leur aide dans la mise à l’essai des protocoles expérimentaux et la collecte de données. Nous remercions les Drs Anne E. Carpenter et Mark-Anthony Bray de la plateforme d’imagerie du Broad Institute de Harvard et du MIT pour leur aide dans le développement de la routine d’analyse d’images dans CellProfiler. Le projet décrit a été soutenu en partie par les prix R21AI079474 et 1R01AI101446 de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses ou des Instituts nationaux de la santé. Le projet a également été soutenu par Fraunhofer USA.

1. Créer la couche PDMS (Figure 1)
<ol><li>Mélanger vigoureusement le PDMS et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Pour éliminer les bulles, dégaz le mélange visqueux dans une chambre à vide pendant 1 heure à température ambiante.</li>
	<li>Sur une balance, versez le PDMS lentement sur le moule en aluminium. Versez du centre et maintenez le moule nivelé. Assurez-vous de laisser les broches à découvert. Arrêtez de verser une fois que le poids cible est atteint. Notre moule nécessite 4 g de PDMS et 0,4 g de réactif de durcissement.
</li>
	<li>Niveler le moule à l’intérieur d’un four et durcir à 37 °C pendant la nuit. Les temps de durcissement alternatifs sont de 2 h à 60 °C ou de 1 h à 90 °C.
</li>
	<li>Disséquer la couche PDMS durcie le long du bord du moule et la décoller soigneusement de la surface du moule avec une paire de pinces. Nettoyez la surface du moule avec 70% d’éthanol et une Q-tip.</li>
</ol>2. Assemblez la cellule d’écoulement selon la figure 2
L’assemblage standard de PDMS avec des lames de verre se fait par traitement au plasma d’oxygène des deux surfaces, ce qui garantit une liaison sans fuite entre le PDMS et la lame de verre du microscope. Dans le protocole présenté, le traitement au plasma détruirait le revêtement chimique sur la lame de verre. Par conséquent, la lame est scellée sous pression plutôt que traitée au plasma.
<ol><li>Placez la fenêtre en verre dans la poche de la cellule d’écoulement.</li>
	<li>Posez une lame de verre enduit sur la fenêtre en verre à l’intérieur de la poche de la cellule d’écoulement avec le côté actif vers le haut, et placez la couche PDMS avec des canaux orientés vers le bas sur le dessus. Placez la glissière PDMS de manière à ce que les entrées de canal s’alignent sur les trous traversants de la plaque métallique. Poussez doucement l’air entre les couches.</li>
	<li>Retournez l’assemblage PDMS/lame de verre afin que le PDMS fasse face à la fenêtre en verre. Superposez les entrées du canal PDMS avec les trous traversants de la plaque métallique.</li>
	<li>Placez la plaque de pression sur le dessus et serrez les vis.</li>
	<li>Placez la cellule d’écoulement assemblée sous le microscope. Réglez le grossissement du microscope sur 60X et préalignez les positions du canal.</li>
</ol>3. Préparer les bactéries de la phase logarithmique
<ol><li>Jour avant l’expérience : Inoculer 50 ml de bouillon Mueller Hinton contenant 2 % de NaCl (MH2) avec une colonie bactérienne. Agiter à 250 tr/min pendant la nuit à 37 °C. Une ou deux souches bactériennes peuvent être étudiées dans une expérience pour la configuration décrite.
</li>
	<li>Avant l’expérience : Mélanger 50 μl de culture bactérienne pendant la nuit dans 50 ml de milieu MH2. Agiter à 250 tr/min pendant 3 h à 37 °C pour s’assurer que les bactéries sont en phase logarithmique.</li>
</ol>4. Réchauffer les composants de la solution expérimentale au moins 10 minutes avant qu’ils ne soient nécessaires
<ol><li>Décongeler le colorant fluorescent (5 mM de stock) et la lysostaphine (10 μg/ml de stock) à température ambiante.</li>
	<li>Réchauffer la poudre d’oxacilline à température ambiante.</li>
</ol>5. Préparer et charger la suspension bactérienne
<ol><li>Après la fin de la sous-culture de 3 heures: Prendre 10 ml de culture de bactéries et centrifuger à 1 650 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Retirer le surnageant et la remise en suspension des bactéries dans 1 ml de milieux frais MH2.</li>
	<li>Fixez un tube de courte longueur à une seringue Luer lock de 1 ml. Rincer le tube de la seringue avec 1 ml de support. Laissez un peu de support dans le tube pour éviter les bulles d’air lors de l’étirage dans la suspension bactérienne.</li>
	<li>Chargez 0,7 ml de bactéries de type 1 dans la seringue. Remplissez deux canaux de la cellule d’écoulement avec des bactéries de type 1. Surveillez l’apparition du liquide de l’autre côté du canal après ca. 150 μl. La transparence du canal change à mesure qu’il est rempli de bactéries.
</li>
	<li>Si vous expérimentez avec plusieurs types de bactéries, répétez la procédure de chargement pour les bactéries de type 2 dans les deux canaux restants de la cellule d’écoulement.</li>
	<li>Placez la cellule d’écoulement à l’intérieur de l’incubateur à 37 °C pendant 45 min pour permettre la décantation bactérienne et sa fixation à la surface de la glissière.</li>
</ol>6. Préparer et charger les solutions expérimentales
<ol><li>Préparer 140 μl de solution de colorant fluorescent à 0,5 mM en mélangeant 14 μl de colorant fluorescent (5 mM) et 126 μl de milieux MH2.</li>
	<li>Diluer 10 mg d’oxacilline dans 40 ml de MH2 pour obtenir une concentration finale de 250 μg/ml d’oxacilline.</li>
	<li>Préparer 130 ml de solution témoin avec des concentrations finales de colorant fluorescent de 0,25 μM et de 0,7 ng/ml de lysostaphine. Pour ce faire, mélanger 65 μl de colorant fluorescent (0,5 mM), 9,12 μl de stock de lysostaphine (10 μg/ml) et 130 ml de milieux MH2.</li>
	<li>Préparer 130 ml de solution antibiotique avec des concentrations finales de colorant fluorescent de 0,25 μM, de 0,7 ng/ml de lysostaphine et de 50 μg/ml d’oxacilline. Pour ce faire, mélanger 65 μl de colorant fluorescent (0,5 mM), 9,12 μl de stock de lysostaphine (10 μg/ml), 26 ml d’oxacilline (250 μg/ml) et 104 ml de milieux MH2.</li>
	<li>Remplissez deux seringues de 60 ml avec une solution de contrôle et deux seringues de 60 ml avec une solution antibiotique. Conservez les solutions enveloppées dans du papier d’aluminium pour éviter la dégradation des réactifs induite par la lumière. Remplissez trop les seringues pour tenir compte de la perte due au rinçage du tube.
</li>
	<li>Retirez les bulles d’air des seringues en feuilletant. Fixez et remplissez le tube d’entrée à la pointe avec la solution expérimentale.</li>
	<li>Montez des seringues sur la pompe. Placez d’abord la seringue avec le plus petit volume, puis verrouillez la position du piston. Placez le reste des seringues sur la pompe, en serrant leurs pistons si nécessaire.</li>
	<li>Réglez la vitesse de la pompe à 1 ml/min et le volume de la pompe à 60 ml. Faites un flush avec la pompe jusqu’à ce qu’un flux constant de liquide soit vu de toutes les seringues.</li>
</ol>7. Configurez la cellule d’écoulement au microscope
<ol><li>Retirez la cellule d’écoulement de la centrifugeuse et montez-la sur l’étage du microscope(Figure 3).</li>
	<li>Connectez le tube d’entrée/sortie à chacun des canaux de cellule d’écoulement (une entrée/une sortie par canal). La collecte de la sortie dans quatre conteneurs différents permet de mesurer des volumes de sortie de canal individuels.</li>
</ol>8. Exécutez l’expérience de 60 minutes
<ol><li>Vérifiez les positions préalignées de l’étape 2.5. Si le champ de vision du microscope n’est pas centré sur le canal et/ou n’est pas mis au point, ajustez les paramètres et enregistrez les nouvelles positions. Une mise au point précise peut ne pas être possible avant le début de l’écoulement en raison de la forte densité de bactéries chargées.
</li>
	<li>Réglez le temps d’acquisition du contraste de phase à 10 ms et le temps d’acquisition de la fluorescence à 1 600 ms.</li>
	<li>Obtenir des images de contraste de phase et de fluorescence pour chaque position avant d’initier le flux. Cela donne une estimation qualitative de la densité bactérienne chargée.
</li>
	<li>Démarrez le flux de liquide et vérifiez immédiatement que le microscope est focalisé sur le bas des canaux.</li>
	<li>Prenez des images de contraste de phase et de fluorescence des zones cibles dans la première minute d’écoulement.</li>
	<li>Acquérir des images toutes les 2 minutes après le premier ensemble d’images jusqu’à ce que 60 min de flux se soit produite. Recentrez-vous au besoin.</li>
</ol>9. Désinfecter la cellule d’écoulement
<ol><li>Faire une solution d’eau de Javel à 10% dans un bécher (100 ml). Remplissez 4 seringues de 20 ml avec 10 ml du mélange. Déblocez les seringues et fixez-les à la cellule d’écoulement. Il faudra ~ 1-2 min pour que les canaux soient débraux des bactéries.
</li>
	<li>Réglez la vitesse de la pompe à 1 ml/min et le volume de la pompe à 3 ml. Courir pendant 3 min.</li>
	<li>Remplissez 4 seringues de 60 ml avec 60 ml d’eau DI. Déblocez les seringues et fixez-les à la cellule d’écoulement.</li>
	<li>Régler la vitesse de la pompe à 1 ml/min et le volume de la pompe à 30 ml. Courir pendant 30 min.</li>
	<li>Surveillez le nettoyage du canal au microscope.</li>
	<li>Désassemblez la cellule d’écoulement. Jetez la lame époxy utilisée. Faire tremper les composants de la cellule d’écoulement dans de l’eau DI pendant 20 min. Sécher à l’air.</li>
</ol>10. Analyser les images et générer des données
<ol><li>Comptez le nombre de bactéries dans chaque image. Le logiciel en libre accès, CellProfiler est utilisé pour effectuer le traitement d’image par lots16. Un aperçu général de la routine CellProfiler est résumé dans le tableau 1. Le nombre de bactéries présentes dans l’image de contraste de phase (Np)donne le nombre total de bactéries. Le nombre de bactéries visibles dans l’image de fluorescence (Nf)donne le nombre de bactéries mortes.
</li>
	<li>Calculer le pourcentage normalisé de mort cellulaire bactérienne en fonction du temps.<ol>
<li>Importez Nf et Np pour des images individuelles dans le logiciel d’analyse de données.</li>
		<li>Calculer la fraction de bactéries mortes dans chaque canal à un point de temps spécifique donné par la fraction (Nf / Np) à t = T.</li>
		<li>Soustrayez la fraction de bactéries mortes présentes au début de l’expérience (t = 1 min) pour les canaux témoins et expérimentaux.</li>
		<li>Soustrayez la fraction de bactéries mortes présentes dans le canal témoin de celle présente dans le canal expérimental à chaque point temporel avec l’équation suivante : <img alt="Data Analysis Equation" fo:content-width="6in" height="217" src="/files/ftp_upload/50828/Data_analysis_equation.png" width="620">
</li>
		 <li>Graphenorme DP vs t pour le cours de l’expérience. Il est à noter qu’un échantillon dont le pourcentage de mort cellulaire est supérieur à 1 % est considéré comme réceptif, tandis que moins de 0,5 % de décès indique une résistance. Les pourcentages qui se situent entre ces deux seuils sont considérés comme indéterminés et l’échantillon doit être testé de nouveau.
</li>
		<li>Utilisez une feuille de calcul pour résumer et analyser les résultats de différentes expériences.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+systems+for+pathogen+sensing:+a+review.">Microfluidic systems for pathogen sensing: a review.</a> Sensors. 9, 4804-4823 (2009).</li><li>Yager, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+diagnostic+technologies+for+global+public+health.">Microfluidic diagnostic technologies for global public health.</a> Nature. 442, 412-418 (2006).</li><li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics.">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+toxicological+complexity+by+multi-dimensional+screenings+in+microsegmented+flow:+modulation+of+antibiotic+interference+by+nanoparticles.">Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles.</a> Lab Chip. 12, 474-484 (2012).</li><li>Chen, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+of+cellular+death+induced+by+bactericidal+antibiotics.">A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics.</a> Cell. 130, 797-810 (2007).</li></ol>

La méthode microfluidique est en instance de brevet : Sauer-Budge A, Sharon A, Kalachnikov M, Wirz H, inventeurs ; Procédé et dispositif de détection rapide de la résistance bactérienne aux antibiotiques/sensibilité au brevet PCT/US10/33523.

Le protocole présenté a été validé et optimisé dans un ensemble d’expériences avec des souches de Staphylococcus aureus sensibles à la méthicilline et résistantes à la méthicilline10. Par conséquent, ce protocole sans modification devrait être directement applicable à d’autres souches de S. aureus et à d’autres antibiotiques avec des mécanismes d’action affectant la biosynthèse bactérienne de paroi cellulaire. Les types de bactéries autres que S. aureus pe...

L’augmentation de la résistance bactérienne intensifie le besoin de tests de sensibilité aux antibiotiques rapides basés sur le phénotype afin de protéger nos médicaments de dernier recours. Les tests de sensibilité standard sont basés sur l’inhibition de la croissance bactérienne en présence d’antibiotiques qui prennent plusieurs (8-24) heures à compléter. Nous avons développé un nouveau test de sensibilité aux antibiotiques sur une plateforme microfluidique qui s’appuie sur l’activation du stress des voies biosynthétiques pour accélérer l’action des antibiotiques.
Les tests de sensibilité aux antibiotiques à l’échelle microfluidique ont l’avantage d’une utilisation efficace des échantillons, car ils nécessitent un petit nombre de bactéries. En outre, les dispositifs microfluidiques peuvent être multiplexés afin de tester plusieurs échantillons dans plusieurs conditions1,2. Récemment, un certain nombre de méthodes microfluidiques pour les tests de sensibilité aux antibiotiques ont été signalées3-9. Dans ces procédés, les bactéries sont cultivées à l’intérieur des gouttelettes nano- et picolitres3,7,dans le volume total du canal microfluidique4-6,8,ou sous forme de bactéries uniques localisées électriquement à la surface inférieure du canal9. Bien que ces tests soient effectués dans des canaux microfluidiques, ils surveillent tous la croissance microbienne en présence et en l’absence d’antibiotiques similaires aux méthodes traditionnelles. Les mesures de croissance sont prises via la densité optique, les colorants sensibles au pH ou le contraste de champ /phase lumineux ou des images de fluorescence. Bien que certains de ces tests soient plus rapides que les méthodes traditionnelles, ils détectent chacun passivement la résistance aux antibiotiques. En d’autres termes, ces méthodes nécessitent toujours que l’utilisateur attende la croissance bactérienne comme lecture finale.
En revanche, nous avons développé une méthode qui utilise une combinaison de cisaillement et de stress enzymatique pour activer les voies biochimiques sensibles aux antibiotiques10. La remise en question des bactéries stressées avec ces antibiotiques crée un test de susceptibilité plus rapide. Les bactéries résistantes à l’antibiotique sont capables de résister aux conditions stressantes. Les bactéries sensibles, d’autre part, sont rapidement tuées par les contraintes combinées. Le pourcentage de mort cellulaire après une heure, mesuré par microscopie à l’aide d’une coloration fluorescente des cellules mortes, définit le phénotype de la bactérie (résistante vs sensible).
Pour une mise en œuvre réussie de notre méthode, les bactéries doivent être immobilisées sur la surface inférieure du canal microfluidique. De cette façon, les bactéries peuvent être soumises à divers stress et simultanément esso repérées au microscope dans un seul plan. Une lame de verre de microscope revêtue est utilisée pour l’immobilisation des bactéries. La lame est pré-revêtue par le fabricant avec des groupes époxydes pour la liaison aux protéines non spécifiques. La liaison non spécifique de ces époxydes aux protéines de surface bactériennes fixe de manière covalente les bactéries à la surface de la lame.
Les souches sont testées dans des conditions identiques (cisaillement + stress enzymatique) en l’absence (contrôle) et en présence (expérience) d’antibiotique. Les photos de contraste de phase et de microscope à fluorescence de chaque canal sont prises automatiquement toutes les deux minutes pendant une heure. Les désignations de résistance sont ensuite faites en comparant le pourcentage de bactéries mortes dans le canal expérimental à celles présentes dans le canal témoin. Après une heure, un échantillon dont le pourcentage de mort cellulaire est supérieur à 1 % est considéré comme réceptif, tandis que moins de 0,5 % de décès indique une résistance. Les pourcentages qui se situent entre ces deux seuils sont considérés comme indéterminés et l’échantillon doit être testé de nouveau.
Les canaux microfluidiques sont définis dans PDMS, qui est un matériau de choix pour les dispositifs microfluidiques11. Pdms est optiquement transparent dans une large gamme de longueurs d’onde, biocompatible, inerte, perméable aux gaz et a une faible perméabilité aux liquides; par conséquent, il est bien adapté à ces expériences.
La contrainte mécanique/de cisaillement est créée par l’écoulement des milieux à température ambiante sur les bactéries immobilisées. (Remarque : Le réchauffement du support à 37 °C n’a pas d’effet significatif sur les résultats de l’essai.) Les pompes automatisées de seringue forcent les milieux (contenant une coloration des cellules mortes +/- antibiotique, ainsi que des facteurs de stress enzymatiques facultatifs) à travers les canaux microfluidiques (200 μm x 400 μm) à un débit de 1 ml/min pour donner 6,25 kPa de force de cisaillement ou un taux de cisaillement de 6 000 sec-1. Ce taux est égal ou supérieur aux contraintes de cisaillement précédemment étudiées sur les staphylocoques.
L’enzyme, la lysostaphine, a été choisie pour des expériences préliminaires parce qu’elle cause des dommages directs à la paroi cellulaire de Staphylococcus. La concentration de lysostaphin (0,7 ng/ml) était suffisante pour causer des dommages bactériens de paroi cellulaire, mais pas suffisante pour causer la mort cellulaire bactérienne sans antibiotique dans la période de l’expérience. La lysostaphine n’est pas requise pour la désignation correcte de la susceptibilité bactérienne, mais elle augmente le résultat, conduisant à une augmentation de la mort cellulaire chez les souches sensibles. En revanche, la contrainte de cisaillement est essentielle pour la fonction d’essai. Lorsque des souches de Staphylococcus aureus sensibles à la méthicilline sont traitées avec de la lysostaphine et de l’oxacilline en l’absence d’écoulement, aucune mort cellulaire n’est enregistrée au cours de l’expérience.
La viabilité cellulaire est surveillée avec une coloration fluorescente des cellules mortes12. Le choix du colorant était basé sur sa capacité à colorer sélectivement seulement les cellules endommagées, sa nontoxicité aux cellules vivantes, et sa faible fluorescence de fond, qui a permis son ajout direct au milieu cellulaire sans étapes supplémentaires. Le choix d’une concentration de colorant fluorescent de 0,25 μM visait à atteindre des niveaux de signal acceptables pendant un temps d’exposition de 1,6 s à la lumière d’excitation de fluorescence.
Le bêta-lactamine, oxacilline, a été employé dans nos études préliminaires. Les espèces de S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) sont résistantes à l’oxacilline et ne présenteront aucune mort cellulaire appréciable au cours de l’expérience. La concentration de 50 μg/ml a été déterminée dans les études préliminaires. Des concentrations plus faibles d’antibiotiques ont donné moins de séparation entre les souches résistantes et sensibles, tandis que des concentrations plus élevées n’ont pas entraîné de différence appréciable dans les résultats expérimentaux.
Nous avons précédemment rendu compte du développement réussi d’un test qui combine des contraintes mécaniques et enzymatiques qui affectent directement la paroi cellulaire bactérienne13 avec un antibiotique qui inhibe la biosynthèse de la paroi cellulaire14,15. Ces expériences de démonstration de principe ont été réalisées sur un panel de SARM et de S. aureus (MSSA), sensible à la méthicilline. Cependant, avec la sélection des paramètres expérimentaux appropriés, notre méthode devrait être applicable à plusieurs espèces de bactéries et à plusieurs classes d’antibiotiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">SYTOX Green</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Invitrogen Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S7020</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Dead cell fluorescence stain</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">A9418-5G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Sodium Acetate</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S8750-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td dir="LTR" height="98" style="height:98px;width:195px;">Lysostaphin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Cell Sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">CRL309A</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 &#181;g/ml &#160;lysostaphin for storage&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Oxacillin salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">28221-1G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Mueller Hinton Broth</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">DF0757-17-6</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrixh</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S3014-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">1 ml, Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">14-823-2F</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">2 oz, Luer-lock syringe</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">309653 - 60 mL</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Overfill to ~65 ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Cambridge Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">9349</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">60X, Fluorescence/Phase contrast objective</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Olympus Corp.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Retiga 12-bit monochrome CCD camera</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">QImaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">RET-4000R-F-M-12-C&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope automation</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Shutters phase contrast/fluorescence</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H204/H202</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">X/Y Stage&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H107AENN</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Focus motor</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H122</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Joystick for XYZ control</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">CS152EF</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Proscan Controller</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H3-XY2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Image Acquisition Software</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Flow Cell Assembly and PDMS</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Flow Cell</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1044</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">Glass window</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1054</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:269px;">Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Edmund Optics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">NT48-543</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Sealing plate</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1045</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Epoxide glass slide</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Arrayit Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">SuperEpoxy 2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td dir="LTR" height="45" style="height:45px;width:329px;">PDMS master</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">PDMS slide design</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Tubing</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-644-03</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-657</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-255</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-259</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Fits Luer-lock adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">1520G</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-658</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stress-induced antibiotic susceptibility testing on a chip

Nous avons développé une méthode microfluidique rapide pour les tests de sensibilité aux antibiotiques dans un environnement basé sur le stress. Le fluide est passé à grande vitesse sur les bactéries immobilisées au fond d’un canal microfluidique. En présence de stress et d’antibiotiques, les souches sensibles de bactéries meurent rapidement. Cependant, les bactéries résistantes survivent à ces conditions stressantes. L’hypothèse derrière cette méthode est nouvelle : l’activation du stress des voies biochimiques, qui sont des cibles des antibiotiques, peut accélérer les tests de sensibilité aux antibiotiques. Par rapport aux méthodes standard d’essai de sensibilité aux antibiotiques, l’étape limitant le taux - la croissance bactérienne - est omise lors de l’application de l’antibiotique. La mise en œuvre technique de la méthode se fait dans une combinaison de techniques standard et d’approches innovantes. Les parties standard de la méthode comprennent des protocoles de culture bactérienne, la définition de canaux microfluidiques dans le polydiméthylsiloxane (PDMS), la surveillance de la viabilité cellulaire avec fluorescence et le traitement d’images par lots pour le comptage des bactéries. Les parties innovantes de la méthode sont l’utilisation du flux de milieux de culture pour l’application de contraintes mécaniques, l’utilisation d’enzymes pour endommager mais pas tuer les bactéries et l’utilisation de substrats de microréseaux pour la fixation bactérienne. La plate-forme développée peut être utilisée dans le développement et l’essai de médicaments antibiotiques et non antibiotiques. Par rapport aux expériences de suspension bactérienne standard, l’effet du médicament peut être activé et désactivé à plusieurs reprises sur des périodes de temps contrôlées. L’observation répétitive de la même population bactérienne est possible au cours de la même expérience.

Les données présentées à la figure 4 montrent la réponse d’une souche sensible de Staphylococcus aureus au fil du temps dans un canal microfluidique contenant des antibiotiques. Les images de contraste de phase acquises à 1 min et à la fin de l’expérience 1 heure sont représentées sur les figures 4A et B. Les données analysées sur 1 heure sont présentées à la figure 4C avec les bactéries surlignées en rouge (5 828 ...

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Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Nous avons développé une plateforme microfluidique pour des tests rapides de sensibilité aux antibiotiques. Le fluide est passé à grande vitesse sur les bactéries immobilisées au fond d’un canal microfluidique. En présence de stress et d’antibiotiques, les souches sensibles de bactéries meurent rapidement. Cependant, les bactéries résistantes peuvent survivre à ces conditions stressantes.

Tests de sensibilité aux antibiotiques induits par le stress sur une puce

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

stress-induced-antibiotic-susceptibility-testing-on-a-chip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.3K vues.  Fraunhofer USA Center for Manufacturing Innovation. Nous avons développé une plateforme microfluidique pour des tests rapides de sensibilité aux antibiotiques. Le fluide est passé à grande vitesse sur les bactéries immobilisées au fond d’un canal microfluidique. En présence de stress et d’antibiotiques, les souches sensibles de bactéries meurent rapidement. Cependant, les bactéries résistantes peuvent survivre à ces conditions stressantes.

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Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

Lensless microscopie à fluorescence sur une puce

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Recherche

Bio-ingénierie

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

On-Chip phénotypage endothélium inflammatoire

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

Procédure à suivre pour le développement de la multi-profondeur circulaire transversale endothélialisées microcanaux-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Feuil sec axée sur la résine photosensible de biocapteurs microfluidiques électrochimiques plate-forme : Fabrication de dispositifs, préparation de dosage sur puce et fonctionnement du système

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabrication et Validation d’un système d’orgue-on-chip avec électrodes intégrées à quantifier directement transendothéliale résistance électrique

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical environment. During this process, mechanosensitive osteocytes regulate the opposing responses between the catabolic osteoclasts and anabolic osteoblasts. To better understand the highly intricate signaling pathways that regulate this process, our lab has developed a foundationary lab-on-a-chip (LOC) platform for analyzing functional outcomes (formation and resorption) of bone remodeling within a small scale system. As bone remodeling is a lengthy process that occurs on the order of weeks to months, we developed long-term cell culturing protocols within the system. Osteoblasts and osteoclasts were grown on functional activity substrates within the LOC and maintained for up to seven weeks. Afterward, chips were disassembled to allow for the quantification of bone formation and resorption. Additionally, we have designed a 3D printed mechanical loading device that pairs with the LOC platform and can be used to induce osteocyte mechanotransduction by deforming the cellular matrix. We have optimized cell culturing protocols for osteocytes, osteoblasts, and osteoclasts within the LOC platform and have addressed concerns of sterility and cytotoxicity. Here, we present the protocols for fabricating and sterilizing the LOC, seeding cells on functional substrates, inducing mechanical load, and disassembling the LOC to quantify endpoint results. We believe that these techniques lay the groundwork for developing a true organ-on-a-chip for bone remodeling.

Here, we present protocols for analyzing bone remodeling within a lab-on-a-chip platform. A 3D printed mechanical loading device can be paired with the platform to induce osteocyte mechanostransduction by deforming the cellular matrix. The platform can also be used to quantify bone remodeling functional outcomes from osteoclasts and osteoblasts (resorption/formation).

Une plate-forme Lab-On-A-Chip pour stimuler la mécanotransduction ostéocyte et analyser les résultats fonctionnels du remodelage des os

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, and chemoresistance. Although several in vitro models have been developed to study hypoxia-related cancer pathology, the complex interplay of the cancer microenvironment observed&#160;in vivo has not been reproduced yet owing to the lack of precise spatial control. Instead, 3D biofabrication approaches have been proposed to create microphysiological systems for better emulation of cancer ecology and accurate anticancer treatment evaluation. Herein, we propose a 3D cell-printing approach to fabricate a hypoxic cancer-on-a-chip. The hypoxia-inducing components in the chip were determined based on a computer simulation of the oxygen distribution. Cancer-stroma concentric rings were printed using bioinks containing glioblastoma cells and endothelial cells to recapitulate a type of solid cancer. The resulting chip realized central hypoxia and aggravated malignancy in cancer with the formation of representative pathophysiological markers. Overall, the proposed approach for creating a solid-cancer-mimetic microphysiological system is expected to bridge the gap between in vivo and in vitro models for cancer research.

Hypoxia is a hallmark of tumor microenvironment and plays a crucial role in cancer progression. This article describes the fabrication process of a hypoxic cancer-on-a-chip based on 3D cell-printing technology to recapitulate a hypoxia-related pathology of cancer.

Cancer hypoxique sur puce imprimé par cellules 3D pour récapituler la progression pathologique du cancer solide

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

Génération d’un modèle tridimensionnel simplifié de peau sur puce dans une plate-forme microfluidique micro-usinée

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target joint disorders are mostly palliative. The unmet need for effective disease-modifying OA drugs (DMOADs) has been primarily caused by the absence of appropriate models for studying the disease mechanisms and testing potential DMOADs. Herein, we describe the establishment of a miniature synovial joint-mimicking microphysiological system (miniJoint) comprising adipose, fibrous, and osteochondral tissue components derived from human mesenchymal stem cells (MSCs). To obtain the three-dimensional (3D) microtissues, MSCs were encapsulated in photocrosslinkable methacrylated gelatin before or following differentiation. The cell-laden tissue constructs were then integrated into a 3D-printed bioreactor, forming the miniJoint. Separate flows of osteogenic, fibrogenic, and adipogenic media were introduced to maintain the respective tissue phenotypes. A commonly shared stream was perfused through the cartilage, synovial, and adipose tissues to enable tissue crosstalk. This flow pattern allows the induction of perturbations in one or more of the tissue components for mechanistic studies. Furthermore, potential DMOADs can be tested via either &#34;systemic administration&#34; through all the medium streams or &#34;intraarticular administration&#34; by adding the drugs to only the shared &#34;synovial fluid&#34;-simulating flow. Thus, the miniJoint can serve as a versatile in vitro platform for efficiently studying disease mechanisms and testing drugs in personalized medicine.

We provide detailed methods for generating four types of tissues from human mesenchymal stem cells, which are used to recapitulate the cartilage, bone, fat pad, and synovium in the human knee joint. These four tissues are integrated into a customized bioreactor and connected through microfluidics, thus generating a knee joint-on-a-chip.

Création d’une articulation du genou sur puce pour modéliser les maladies articulaires et tester des médicaments

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...