Ce travail a été financé par une subvention de la National Science Foundation (numéro de subvention MCB-0447750).

<ol>
	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode calotte présentée ici permet à un chercheur pour recueillir des échantillons de tissus provenant de centaines, voire des milliers, des plantes individuelles en une seule journée et efficace d&#39;extraire l&#39;ADN génomique à partir de ces échantillons pour une utilisation dans les réactions de génotypage. En donnant un scientifique de la capacité de déterminer le génotype des milliers de plants dans un court laps de temps, la méthode la calotte glaciaire a le potentiel pour faciliter un certain nombre d&#39;expériences génétiques qui autrement ne seraient pas pratiques à réaliser. Plusieurs exemples sont fournis ci-dessous. <ol><li> Cartographie génétique. Beaux échelle de cartographie génétique peut être accéléré si le chercheur est en mesure d&#39;identifier les événements de recombinaison dans un intervalle précis le long du chromosome 3. Si cet intervalle implique une très courte distance génétique, puis les événements de recombinaison sera relativement rare dans la population de cartographie de ségrégation. Pour cette raison, il peut être nécessaire à des milliers d&#39;écran de plantes individuelles pour trouver le nouveau désiréCombinant les individus. Ce processus pourrait être grandement accéléré par l&#39;utilisation de la calotte glaciaire. Même à l&#39;ère du génome entier de re-séquençage, il est encore nécessaire de démontrer que directement une mutation donnée est directement responsable d&#39;un phénotype d&#39;intérêt. Dans ces cas, il sera nécessaire de séparer la mutation d&#39;intérêt au détriment d&#39;autres mutations étroitement liées, afin de prouver une mutation candidat est effectivement responsable. Dans ces situations, la calotte glaciaire pourrait fournir une méthode efficace pour briser lien entre une paire de mutations étroitement liées. </li><li> Multi-mutants. Il est devenu commun pour les chercheurs qui étudient Arabidopsis pour combiner des allèles mutants de plusieurs loci distincts en un seul individu, afin de surmonter la redondance fonctionnelle 4-6. À titre d&#39;exemple, considérons un cas où l&#39;on souhaite combiner des allèles mutants de quatre loci différents dans une seule plante par croisement génétique. Pour ce projet, il sera nécessaire de générer uneParticulier N qui est hétérozygote à ces quatre loci dans le cadre du régime de passage. Lorsque cette graine quadruple hétérozygote ensembles, l&#39;homozygote quadruple est prévu d&#39;être présent à un taux de un sur 256 dans la population résultant de la descendance. Préalable de cette personne rare par les méthodes traditionnelles serait très laborieux. Par comparaison, en utilisant la calotte glaciaire pour ce projet permettrait au scientifique une stratégie efficace pour identifier les homozygotes rares quadrupler en une seule génération. </li><li> iTILLING. Notre laboratoire a récemment décrit une nouvelle approche pour le dépistage de la présence de mutations induites dans les gènes d&#39;intérêt dans 7 Arabidopsis. Cette méthode est une variation sur une technique bien établie appelée TILLING qui est utilisé pour trouver des mutations dans des populations commandé des individus traités avec un mutagene chimique 8-10. Nous avons nommé notre méthode iTILLING parce qu&#39;il s&#39;agit d&#39;une version personnalisée de TILLING qui permet une indchercheur ividual pour accomplir quelque chose qui a traditionnellement exigé une grande équipe de recherche à compléter. Ice-Cap fait partie intégrante de la méthode iTILLING 7, tel que décrit ci-dessous. </li></ol> L&#39;idée derrière iTILLING est de produire une population éphémère mutant, qui est en contraste avec les populations durables mutant créé pour les projets traditionnels TILLING. Pour iTILLING, les graines d&#39;une population en vrac M2 sont semées en 50 100 blocs Ice Cap, et l&#39;ADN est extrait en utilisant la méthode des calottes glaciaires. Plants d&#39;Arabidopsis sont ensuite placés à 4 ° C, alors que le dépistage de mutation est réalisée en utilisant l&#39;ADN calotte glaciaire preps. Plants de tomates sont conservés à 12 ° C. Une fois les plantules présentant des mutations désirées ont été identifiés, ils sont récupérés à partir des plaques de glace-Cap et transféré au sol. iTILLING n&#39;est pas destiné à fournir une population durable mutantes pour une communauté de recherche entier à l&#39;écran. Au lieu de cela, iTILLING fournit une stratégie par laquelleun scientifique peut filtrer une population mutante personnalisées pour des mutations dans une poignée de gènes rapidement, efficacement et à un coût relativement faible. Nous avons trouvé calotte glaciaire d&#39;être une méthode efficace pour la croissance et le génotypage d&#39;Arabidopsis, la tomate et du riz. Nous prévoyons que d&#39;autres espèces de plantes devraient également se prêter à calotte glaciaire. Une limite à la variété des espèces qui peuvent être logés par Ice-Cap est la taille des graines. Seules les plantes avec des graines assez petit pour tenir dans le puits d&#39;une plaque de 96 puits sera compatible avec la calotte glaciaire dans sa configuration actuelle.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / Grinder </td><td> Machine pour secouer Plaques racine pour l&#39;extraction d&#39;ADN </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Scelleur </td><td> ABgene Unis </td><td> AB-0384 </td><td> Machine manuelle thermoscellage utilisée à des plaques de Racine avant de désorganisation tissulaire </td></tr><tr><td> Centrifugeuse équipée des supports de microplaques balancer </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Toute centrifugeuse avec des supports de microplaques balancer serait approprié </td></tr><tr><td> MicroFill microplaques Distributeur </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Automated distributeur de liquide pour microplaques remplissant </td></tr><tr><td> Bialetti marque17x11 pouces Fiche commerciaux Cookie Grand </td><td> Target magasin </td><td> www.bialetti.com </td><td> Cette feuille de biscuit spécifique a la profondeur idéale pour la calotte glaciaire </td></tr><tr><td> Custom Made rack métallique </td><td> Quincaillerie </td><td></td><td> Voir le texte pour la description complète </td></tr><tr><td> 33 litres boîte de rangement en plastique </td><td> Target magasin </td><td> Sterilite Marque </td><td> Pour la calotte glaciaire Fontaine. Boîte de rangement en plastique assez grand pour contenir la plaque à biscuits 17x11 pouces </td></tr><tr><td> 30 gallons par heure Pompe de fontaine </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Petite pompe submersible fontaine disponible dans les magasins de fournitures de jardin </td></tr><tr><td> Tuyau pour pompe de fontaine </td><td> Toute entreprise de fournitures de laboratoire </td><td></td><td> Tuyau compatible avec pompe de fontaine </td></tr><tr><td> Pince plastique </td><td> Quincaillerie </td><td></td><td> Pince à tenir le tuyau à biscuitsFiche </td></tr><tr><td> Effacer les couvercles en plastique de Falcon Microtest fond plat de 96 puits des plaques de polystyrène </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Effacer les couvercles en plastique pour couvrir les plaques de glace semis-Cap </td></tr><tr><td> 3M Micropore ruban chirurgical </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch boules de diamètre en acier inoxydable </td><td> Technologies de Hartford, Rocky Hill, CT </td><td> 034 à 006-1K </td><td> Utilisé pour perturber les tissus des racines après la récolte </td></tr><tr><td> 3 pouces bandeaux élastique </td><td> Épicerie locale </td><td></td><td> Utilisé pour sécuriser Plate Racine à la plaque de semis </td></tr><tr><td> 4 brochettes en bois mm de diamètre </td><td> Épicerie locale </td><td></td><td> Ces brochettes sont généralement utilisés pour préparer les brochettes </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc marque de 1 ml plaques filtre sans fritte </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> Plaques de semis de 96 puits avec des trous dans le fond. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Eh bien Tall-cheminée Plaque PCR </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> Plaques 96 puits à la racine </td></tr><tr><td> Agar - culture cellulaire testée </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic acide (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige et Skoog (MS) mélange de sel basale </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> La chaleur Easy Peel étanchéité feuille </td><td> ABgene Unis </td><td> AB-0745 </td><td> Film d&#39;étanchéité pour l&#39;étanchéité thermique Plaques Racine avant de désorganisation tissulaire </td></tr><tr><td> Marque Canard bande extra large Emballage, 3,00 &quot;x 54,6 m </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Réf. 21242139 </td><td> Ruban adhésifpour microplaques d&#39;étanchéité contenant des extraits d&#39;ADN pour le stockage </td></tr><tr><td> Rouleau d&#39;étanchéité </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Hand held outil de rouler pour le pressage de bandes d&#39;étanchéité adhésif sur microplaques </td></tr><tr><td> 96 puits à bloc thermique du métal </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Utilisé pour geler les plaques pour la récolte des racines du tissu </td></tr><tr><td> Papier-filtre Whatman </td><td> Whatman international </td><td> 1002 090 </td><td> Utilisé pour les graines de la surface de stérilisation </td></tr><tr><td> Pipette Pasteur jetable </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;jetables pipette Pasteur utilisée pour le transfert de semences à l&#39;assiette des semis </td></tr><tr><td> Pyrex plat allant au four (20 cm x 30 cm) </td><td> Target magasin </td><td></td><td> Utilisé pour construire une glace sèche / éthanol bain. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

Il est devenu courant pour les scientifiques des plantes pour développer des projets qui nécessitent le génotypage d&#39;un grand nombre de plantes. La première étape de tout projet de génotypage est de collecter un échantillon de tissu de chaque plante. L&#39;approche traditionnelle de cette tâche est de plantes échantillon de un en un temps. Si l&#39;on veut à des centaines ou des milliers de génotypes particuliers, cependant, l&#39;utilisation de ce résultat stratégie dans un goulot d&#39;étranglement important dans le pipeline de génotypage. La méthode la calotte glaciaire que nous décrivons ici fournit une solution haut-débit à ce défi en permettant à un chercheur de collecter des tissus de plusieurs milliers de plants dans un seul jour 1,2. Ce niveau de débit est rendue possible par le fait que le tissu est récolté à partir de plantes de 96 en un temps, plutôt que d&#39;une moins-un-temps. La méthode la calotte glaciaire offre une plate-forme intégrée pour effectuer la croissance des semis, la récolte des tissus, et l&#39;extraction d&#39;ADN. La base de la calotte glaciaire est la croissance de seedliNGS dans une paire empilée de plaques à 96 puits. Les puits de la plaque supérieure contiennent les bouchons de gélose de milieu de croissance sur lequel plants individuels germer. Les racines poussent vers le bas à travers les médias d&#39;agar, sortie de la plaque supérieure par un trou, et de passer dans une eau contenant la plaque inférieure. Pour la récolte de tissus pour l&#39;extraction d&#39;ADN, de l&#39;eau dans la plaque inférieure contenant les tissus des racines est rapidement congelé alors que les semis dans la plaque supérieure rester à température ambiante. La plaque supérieure est ensuite décollé de la plaque inférieure, ce qui donne une plaque avec 96 échantillons de tissu racinaire dans la glace et une plaque avec 96 plants viables. La technique est appelée &quot;Ice-Cap», car il utilise de la glace pour capturer le tissu racinaire. La plaque 96 puits contenant les plantules peuvent ensuite enveloppés dans du papier et transférés à basse température. Ce processus suspend une nouvelle croissance des plants, mais n&#39;affecte pas leur viabilité. Une fois l&#39;analyse du génotype a été achevé, les jeunes plants avec le génotype désiré peut être transférée de la p 96 puitsfin à la terre pour la multiplication ultérieure. Nous avons démontré l&#39;utilité de la méthode de la calotte glaciaire à l&#39;aide d&#39;Arabidopsis thaliana, la tomate, et les semis de riz. Nous prévoyons que la méthode doit également être applicable à d&#39;autres espèces de plantes à graines assez petit pour tenir dans les puits de plaques à 96 puits.

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Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

La méthode calotte permet de cultiver des plantes en plaques à 96 puits et non destructive tissu racinaire de récolte de chaque plant. L&#39;ADN extrait à partir de ce tissu racinaire peut être utilisé pour des réactions de génotypage. Nous avons constaté que la calotte glaciaire fonctionne bien pour les<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, La tomate, les plants de riz.

Ice-Cap: un procédé de croissance Arabidopsis Et plants de tomates dans des plaques à 96 puits pour génotypage à haut débit

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

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22.7K vues.  University of Wisconsin-Madison. La méthode calotte permet de cultiver des plantes en plaques à 96 puits et non destructive tissu racinaire de récolte de chaque plant. L'ADN extrait à partir de ce tissu racinaire peut être utilisé pour des réactions de génotypage. Nous avons constaté que la calotte glaciaire fonctionne bien pour les Arabidopsis thaliana, La tomate, les plants de riz.