Ce travail a été soutenu par l&#39;Agence slovène pour la recherche (projet J2-9770, IP-0510 du centre d&#39;infrastructure et le programme P2-0249). Cette vidéo présente le matériel supplémentaire pour les &quot;électroporation basée sur les technologies et traitements&quot; atelier scientifique et cours de troisième cycle, organisé par la Faculté de génie électrique à l&#39;Université de Ljubljana, en Slovénie. Auteurs remercient également DUSA Hodžić d&#39;avoir bien voulu fournir d&#39;ADN plasmidique.

1. La culture cellulaire, un plasmide et la préparation de tampon pour l&#39;expérience <ol><li> Dans cette expérience ovariennes de hamster chinois (CHO-K1) sont utilisés. Les cellules sont cultivées dans un mélange nutritif HAM-F12 (AAP) supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 10% de sérum fœtal bovin, 400 ul / l gentamicine (tous de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Allemagne), et 1 ml / L crystacilin (Pliva, Zagreb, Croatie). Les cellules sont maintenues à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée 2 à 5% l&#39;atmosphère dans l&#39;incubateur pendant 24 heures. </li><li> Amplifier plasmide pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc, Mountain View, Californie, Etats-Unis) codant la protéine fluorescente verte (GFP) dans la souche DH5a d&#39;Escherichia coli et l&#39;isoler avec Maxi Kit HiSpeed ​​plasmidique (Qiagen, Hilden, Allemagne). Concentration de l&#39;ADN plasmidique (plasmide dissous dans un tampon TE) devrait être déterminée par spectrophotométrie à 260 nm et confirmée par électrophorèse sur gel. </li><li> Préparer isoosmolar tampon phosphate de sodium (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 1 mM de MgCl2, 250 mM de saccharose, pH 7,4). </li><li> Le jour de l&#39;expérimentation de préparer la suspension cellulaire par trypsinisation avec 0,25% de trypsine / EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Allemagne). Centrifuger les cellules pendant 5 min à 1000 rpm (180 xg) à 4 ° C (Sigma, Allemagne) et remettre le culot cellulaire dans un tampon de phosphate de sodium isoosmolar à une densité cellulaire de 5 × 10 6 cellules / ml. </li></ol> 2. L&#39;équipement matériel <ol><li> Les cellules sont exposées à des champs électriques dans la pointe de pipette (figure 1) avec des électrodes intégré connecté à un générateur de prototypes de haute tension. La pointe et la géométrie d&#39;électrodes permet l&#39;application de champ électrique relativement homogène et le générateur permet la livraison d&#39;impulsions électriques dans différentes directions. La pointe et le générateur ont été développés au Laboratoire de Biocybernétique, Faculté de Génie Electrique, Université de Ljubljana 1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3309/3309fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Verticale et horizontale (a) section transversale et la photographie (b) de la pointe de la pipette avec des électrodes intégrées. Dans la couleur grise de section est utilisé pour le boîtier en plastique noir et pour les électrodes. La pointe de la pipette avec des électrodes intégrées se compose de quatre électrodes tige cylindrique. Les électrodes sont faites d&#39;acier inoxydable; leur diamètre est de 1,4 mm, électrodes adjacentes sont de 1 mm d&#39;intervalle, et les électrodes opposées sont de 2 mm d&#39;intervalle. Les électrodes sont collées dans le bout de plastique en parallèle et leur longueur applicable est de 30 mm 2. 3. Gene électrotransfert protocole <ol><li> Ajouter plasmide pEGFP-N1 à une suspension cellulaire de la concentration de 10 ug / ml. </li><li> Incuber le mélange pendant 2-3 minutes à température ambiante, avant d&#39;appliquer des impulsions électriques. </li><li> Aspire 100 pl de suspension cellulaire dans l&#39;embout de la pipette avec des électrodes intégrées. </li><li> Pour obtenir le meilleur d&#39;efficacité électrotransfert de gènes et de maintenir la viabilité des cellules, les paramètres optimaux d&#39;impulsions électriques doivent être utilisés. Dans cette expérience, un train de 8 impulsions rectangulaires (chacune avec une durée de 1 ms, d&#39;amplitude 225 V à une fréquence de répétition Hz) est appliqué à chaque échantillon, on utilise un générateur de prototypes de haute tension. Deux protocoles différents de champ électrique (figure 2) sont utilisés: dans le premier protocole toutes les impulsions sont délivrées dans la même direction, alors que dans le second protocole impulsions sont livrés en changeant alternativement la direction du champ électrique et d&#39;orientation. Le deuxième protocole ne peut être utilisé avec le générateur d&#39;impulsions approprié, qui permet l&#39;application d&#39;impulsions électriques dans différentes directions. </li><li> Immédiatement après l&#39;application d&#39;impulsions de transférer les cellules de la pointe de pipette en 6 plaques et ajouter sérum de veau fœtal (SVF-Sigma, États-Unis) (25% du volume de l&#39;échantillon). </li><li> Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C pour permettre rescellage membrane cellulaire. </li><li> Ajouter 2 ml de HAM-F12 pour chaque échantillon dans 6 puits et incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée 2 à 5% l&#39;atmosphère dans l&#39;incubateur. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3309/3309fig2.jpg" alt="Figure 2"/> . Figure 2 protocoles de champ électrique: (a) toutes les impulsions sont délivrées dans la même direction, (b) les impulsions sont livrés en changeant alternativement la direction du champ électrique et d&#39;orientation. 4. L&#39;acquisition des images et la détermination de l&#39;efficacité du gène électrotransfert <ol><li> Efficacité du gène électrotransfert est déterminée comme le pourcentage de cellules exprimant la GFP 24h après l&#39;application d&#39;impulsions. </li><li> Les cellules sont observées en utilisant un microscope à fluorescence (dans notre cas Zeiss 200, Axiovert, ZR Allemagne) avec la lumière d&#39;excitation à 488 nm généré par un système monochromateur (polychrome IV, Visitron, Allemagne) et l&#39;émission est détectée à 507 nm. Les images sont enregistrées en utilisant le système d&#39;imagerie (imagerie MetaMorph système, Visitrle, Allemagne), mais d&#39;autres logiciels d&#39;acquisition similaire peut également être utilisé. </li><li> Acquérir au moins cinq images (contraste de phase et fluorescence verte) à un grossissement de 20x objectif. </li><li> Compter les cellules à l&#39;image de contraste de phase et les cellules qui expriment la GFP à l&#39;image de fluorescence verte. Déterminer le pourcentage d&#39;efficacité électrotransfert de gènes en divisant le nombre de cellules qui expriment la GFP avec le nombre de toutes les cellules de chaque image correspondant (figure 3). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/3309/3309fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Le pourcentage de cellules exprimant la GFP lorsque toutes les impulsions sont livrés dans la même direction et quand impulsions sont délivrées en changeant alternativement la direction du champ électrique et d&#39;orientation est présentée. Les cellules ont été exposées à un train de huit impulsions avec une amplitude 225 V, durée 1 ms et la fréquence de répétition de 1 Hz. Les résultats ont été obtenus par des moyens de microscopie à fluorescence. Chaque valeur dans le graphique représentent la moyenne de trois expériences indépendantes ± déviation standard. En changeant la direction du champ électrique et l&#39;orientation du pourcentage de cellules exprimant la GFP augmente.

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	<li>Rebersek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporator+with+automatic+change+of+electric+field+direction+improves+gene+electrotransfer+in-vitro.">Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro.</a> Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).</li><li>Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip+electrode+chamber+for+small+volume+electroporation,+electrofusion,+and+gene+transfection.">Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection.</a> 18, (2006).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-841 (1982).</li><li>Daud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+trial+of+interleukin-12+plasmid+electroporation+in+patients+with+metastatic+melanoma.">Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma.</a> J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).</li><li>Pavlin, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+conductivity+of+a+suspension+of+permeabilized+cells:+a+theoretical+analysis.">Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis.</a> Biophys J. 85, 719-729 (2003).</li><li>Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+mechanisms+of+electric+field-induced+DNA+transfection.+IV.+Effects+of+DNA+topology+on+cell+uptake+and+transfection+efficiency.">Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency.</a> Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).</li><li>Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+electrotransfection+of+mammalian+cells.">Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).</li><li>Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+synchronization+effect+on+mammalian+cell+permeabilization+and+gene+delivery+by+electric+field.">Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field.</a> Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).</li><li>Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Mg+ions+on+efficiency+of+gene+electrotransfer+and+on+cell+electropermeabilization.">Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization.</a> Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).</li><li>Rols, M., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electropermeabilization+of+mammalian+cells+to+macromolecules:+control+by+pulse+duration.">Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration.</a> Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).</li><li>Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+involved+in+gene+electrotransfer+using+high-and+low-voltage+pulses-An+in+vitro+study.">Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study.</a> Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).</li><li>Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+electrophoresis+in+gene+electrotransfer.">The role of electrophoresis in gene electrotransfer.</a> J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).</li><li>Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+electrode+orientation+improves+the+efficacy+of+electrochemotherapy+of+solid+tumors+in+mice.">Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice.</a> Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).</li><li>Faurie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-mediated+gene+transfer+and+expression+are+controlled+by+the+life-time+of+DNA/membrane+complex+formation.">Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation.</a> J Gene Med. 12, 117-125 (2010).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Gene électrotransfert est une technique de la biotechnologie polyvalent qui permet le transfert d&#39;ADN dans les cellules au moyen de l&#39;application de courtes impulsions à haute tension électrique 3 et représente une alternative plus sûre à des vecteurs viraux en raison de sa sécurité, efficacité et facilité d&#39;application. Bien électrotransfert de gènes est aujourd&#39;hui largement utilisé pour transfecter tous les types de cellules et de la première phase I des essais cliniques utili...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> HAM-F12 </td><td> AAP </td><td> E15-016 </td><td> milieu de culture </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7513 </td><td></td></tr><tr><td> sérum de veau fœtal </td><td> AAP </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> gentamicine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397 </td><td> antibiotiques </td></tr><tr><td> crystacilin </td><td> Pliva </td><td> 625110 </td><td> antibiotiques </td></tr><tr><td> pEGFP-N1 </td><td> Clontech Laboratories </td><td> 6085-1 </td><td> l&#39;ADN plasmidique </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​Maxi Kit Plasmid </td><td> Qiagen </td><td> 12662 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Merck </td><td> F640786 933 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> TKI Hrastnik </td><td> 0795 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-8266 </td><td></td></tr><tr><td> saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 16104 </td><td></td></tr><tr><td> trypsine / EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T4174 </td><td></td></tr><tr><td> pointe de la pipette </td><td> Custom made </td><td></td><td></td></tr><tr><td> générateur d&#39;impulsions électriques </td><td> Custom made </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 plaques ainsi </td><td> PPT </td><td> 92406 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tube à centrifuger </td><td> PPT </td><td> 91015 </td><td></td></tr><tr><td> 75 flacon de culture cm 2 </td><td> PPT </td><td> 90076 </td><td></td></tr></tbody></table>

changing the direction and orientation of electric field during electric pulses application improves plasmid gene transfer in vitro

Gene électrotransfert est une méthode physique utilisée pour délivrer des gènes dans les cellules par l&#39;application de courtes et intenses impulsions électriques, qui provoquent la déstabilisation de la membrane cellulaire, ce qui rend perméable aux petites molécules et permet le transfert de grosses molécules comme l&#39;ADN. Il représente une alternative aux vecteurs viraux, en raison de son innocuité, l&#39;efficacité et la facilité d&#39;application. Pour gène électrotransfert différents protocoles d&#39;impulsions électriques sont utilisés pour atteindre un maximum transfection de gènes, l&#39;un d&#39;eux est changeant la direction du champ électrique et d&#39;orientation lors de la livraison d&#39;impulsion. Changement de direction du champ électrique et d&#39;orientation augmenter la surface de membrane compétents pour l&#39;entrée d&#39;ADN dans la cellule. Dans cette vidéo, nous montrent la différence dans l&#39;efficacité électrotransfert de gènes lorsque toutes les impulsions sont livrés dans la même direction et quand impulsions sont délivrées en changeant alternativement la direction du champ électrique et d&#39;orientation. Pour cette astuce objectif avec des électrodes intégrées et générateur de prototypes de haute tension, ce qui permet de changer de champ électrique dans des directions différentes pendant l&#39;application d&#39;impulsions électriques, ont été utilisés. Gene électrotransfert efficacité est déterminée 24h après l&#39;application d&#39;impulsions que le nombre de cellules exprimant la protéine fluorescente verte divisée par le nombre de toutes les cellules. Les résultats montrent que la transfection du gène est augmenté lorsque l&#39;orientation du champ électrique au cours d&#39;impulsions électriques de livraison est modifié.

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Changing the Direction and Orientation of Electric Field During Electric Pulses Application Improves Plasmid Gene Transfer in vitro

Transfection de gènes par électroporation est amélioré d&#39;environ deux fois lorsque l&#39;orientation du champ électrique est changé lors de l&#39;application d&#39;impulsions, tandis que la viabilité des cellules n&#39;est pas affectée. L&#39;augmentation de la transfection de gènes est causée par l&#39;augmentation de la surface de membrane qui est rendue compétente pour l&#39;entrée d&#39;ADN dans la cellule.

Modification de la direction et l&#39;orientation du champ électrique pendant des impulsions électriques d&#39;application améliore le transfert de gène plasmidique In vitro</em

Gene electrotransfer is a physical method used to deliver genes into the cells by application of short and intense electric pulses, which cause ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Changing the Direction and Orientation of Electric Field During Electric Pulses Application Improves Plasmid Gene Transfer in vitro

10.4K vues.  University of Ljubljana. Transfection de gènes par électroporation est amélioré d'environ deux fois lorsque l'orientation du champ électrique est changé lors de l'application d'impulsions, tandis que la viabilité des cellules n'est pas affectée. L'augmentation de la transfection de gènes est causée par l'augmentation de la surface de membrane qui est rendue compétente pour l'entrée d'ADN dans la cellule.