Les auteurs tiennent à remercier le soutien de la recherche sur le cancer Cancer Institute Award Forum Samuel Oschin complète ainsi que des fonds de l&#39;Institut de médecine régénérative de Cedars-Sinai, et la famille Guérin. Le projet a été financé en décrit la forme d&#39;une base de CTSI Bon financé par le National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176, et est maintenant au centre national pour l&#39;avancement des sciences translationnelle, Grant UL1TR000124. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la NIH.

Cette procédure est conforme aux exigences Cedars-Sinai IACUC. Les chercheurs doivent s&#39;assurer de la conformité institutionnelle IACUC avant de procéder. Tous les outils et les réactifs doivent être stérilisés avant leur utilisation. 1. Préparation des outils, des solutions, et l&#39;ADN Mélange <ol><li> Insérez borosilicate poli tubes capillaires en verre de 100 mm d&#39;incendie dans un extracteur micropipette. Régler le chauffage pour permettre traction pondérée norme pour former la pointe de la pipette d&#39;environ 17,5 mm. Couper des conseils avec des ciseaux chirurgicaux pointus à une distance d&#39;environ 8-9 mm depuis le début de la pointe pour créer une ouverture à peu près 100 um de diamètre. </li><li> Faire un stock de 1% p / v solution vert rapide par mélange d&#39;eau sans nucléase filtré (en utilisant un filtre de seringue de 20 um) en vert à séchage rapide. </li><li> Isoler l&#39;ADN purifié exempt d&#39;endotoxine plasmide qui est très concentré (c.&gt; 3 pg / pl), dilué dans du Tris-EDTA (TE) tampon. Ajouter des quantités désirées du plasmideau mélange dilué dans du tampon TE et ajouter un rapport 1:10 de la solution vert rapide à 1% (fabrication d&#39;un 0,1% p / v de concentration finale du vert rapide). Utilisez une concentration finale de 0,5-2,0 pg / pl du plasmide pour l&#39;expression de transgènes robuste. </li></ol> 2. Anesthésie des animaux, Pipette Chargement en cours, et Pial Surface plasmide injection <ol><li> Induire une hypothermie anesthésie sur des souris postnatale 1-2 jours en les plaçant sur une boîte de Pétri qui est placé sur la glace pendant 5-8 min (temps dépend de l&#39;âge de chiot / poids). Une fois l&#39;hypothermie est confirmée par l&#39;absence de mouvement de pincement pincer et / ou de la queue réflexe, les souris sont prêts à être injecté. Placez animaux de retour sur la glace si les réflexes de la douleur sont évidents. La procédure d&#39;injection et l&#39;électroporation prennent moins de 2-3 min au total si le temps le hypothermie, injection, et les procédures d&#39;électroporation en conséquence pour maintenir l&#39;anesthésie appropriée. </li><li> Pendant l&#39;anesthésie, à l&#39;aide d&#39;une pipette standard, soigneusement pipette quantité souhaitée de plasmid mélanger à injecter (0,5-2 pi) sur un morceau de pellicule de cire de paraffine pour référence. Ici, un volume total de 0,5 pi de plasmide mélange est injecté. Ensuite, en utilisant un micro injecteur, insérer soigneusement assemblé pipette capillaire en verre dans le mélange de plasmide contenant des tubes. Prendre des précautions supplémentaires pour éviter la pointe de la rupture en faisant en sorte qu&#39;il ne touche pas les bords du tube. Aspirer la solution dans la pipette en composant lentement la molette de transfert. Une fois un volume suffisant a été chargée dans la pipette, composer avant jusqu&#39;à ce que la pression revient à la position neutre de 0 hPa. </li><li> Utilisation de 300-450 hPa Pression pour injection pour assurer une pression appropriée pour un remplissage de la surface / espace méningé pial, placer la pointe à proximité de l&#39;injection de paraffine de référence de film pipetté (de 2,2) et utiliser la pédale de l&#39;injecteur micro pour éjecter un le volume sur le film de cire de paraffine. Régler la pression en conséquence jusqu&#39;à ce que le montant est égal à la éjecté referenc auparavant pipettevolume de courrier. </li><li> Une fois la pointe a été équilibrée et l&#39;anesthésie a été confirmée, les chiots sont prêts à être injecté. </li><li> Le but de l&#39;expérience est d&#39;injecter le mélange de plasmide sous le crâne et la surface piale ci-dessus pour permettre l&#39;électroporation de l&#39;ADN vers le bas dans les progéniteurs de surface pie-mère (Figure 1A). Pour les injections de cortex, tenir le chiot vers le bas avec le pouce et l&#39;index de la main moins dominante. Les hémisphères corticaux et d&#39;autres structures superficielles telles que les colliculi supérieures sont visibles entre P0 et P2, ce qui permet un ciblage facile de ces structures (Figure 1B). Utilisation de la région dominante de la main et la cible souhaitée du cortex (c.-moteur, somatosensoriel, etc), insérer pipette passé la peau et le crâne en prenant soin d&#39;éviter les artères cérébrales. Assurez-vous de prévenir toute nouvelle pénétration de la pointe au-delà du crâne (qui est indiqué par l&#39;absence de toute résistance juste après avoir percé le crâne). </li><li> Injecter plasmasolution id utilisant la pédale de l&#39;injecteur micro et assurez-vous qu&#39;il répartisse uniformément à travers le tissu (figure 2A). Remarque: Il est très important de déterminer de façon empirique une approche qui maximise la livraison de plasmide tout en évitant hématome dû à la pression du fluide. Cela peut être fait en ajustant la durée de l&#39;injection, l&#39;angle, le volume, et le site cible précise pour éviter la perturbation vasculaire. </li><li> Soyez sûr d&#39;essayer de garder la pointe de sécher entre les injections en plaçant la pointe dans des gouttelettes d&#39;essais d&#39;injections faites précédemment sur un papier ciré ou un film de paraffine plastique. Cela est nécessaire pour éviter l&#39;accumulation de pointe solution d&#39;ADN évaporé et cristallisé, ce qui peut entraîner l&#39;obstruction de la pointe et les volumes de livraison incompatibles. </li></ol> 3. Électroporation <ol><li> Réglez le Electroporator à 135-150 V pour cinq impulsions, d&#39;une durée de 50 ms, avec 950 ms intervalles entre chaque impulsion. Afin d&#39;augmenter la conductance etéviter les brûlures de la peau, couvrir tweezertrodes de platine de 3 mm avec le gel de l&#39;électroporation. Vérifiez réflexes de pieds-pincement et la queue à ce point pour assurer l&#39;anesthésie. Si sensible, placer sur la glace pendant plusieurs minutes à anesthésier. </li><li> Pour cortex (colliculus supérieur) et des injections, employer une électrode de 3 mm (figure 2B) pour améliorer la viabilité des petits (par comparaison avec la 7 - et 10 mm des électrodes, qui sont utilisées pour la zone ventriculaire électroporation). Placer la sonde de charge négative de l&#39;électrode au-dessus de la zone d&#39;injection et la sonde chargée positivement autour de la région de l&#39;oeil contralatéral au-dessous de telle sorte que l&#39;orientation de l&#39;électrode se trouve à un angle de 45 à 60 ° par rapport à la ligne médiane (Figure 2C). </li><li> Utilisez la pédale de l&#39;électroporation pour déclencher courant et tenir tweezertrodes en place pour 3-5 impulsions, en fonction de l&#39;âge de chiot et le poids, en ciblant efficacement l&#39;ADN dans les cellules de surface piales sous-jacents lors de la comptabilisation de la courburedes hémisphères. Remarque: le pôle négatif peut être balayé au-dessus de la zone d&#39;injection entre les deux impulsions ou une électrode plus grande peut être utilisée pour augmenter la surface électroporation. </li><li> Immédiatement après l&#39;électroporation, soigneusement nettoyer gel de chiots et de les placer sous une lampe chauffante pendant environ 5 min. </li><li> Chiots aiguë perdre leur teinte rougeâtre-rose naturel dans les minutes après l&#39;électroporation en raison de cyanose. Respecter les chiots pour la récupération de couleur naturelle et le début de l&#39;action normale avant de les renvoyer dans leurs cages. </li><li> Assurer la resocialisation avec la mère en observant si elle apporte des petits au nid et commence à les toiletter. Si elle devient agressif, assurez-vous que les petits n&#39;ont pas les restes de gel et de les incuber avec un peu de litière pour transférer l&#39;odeur des petits. </li></ol> 4. Modifications pour le ciblage colliculi supérieure Ciblage: <ol><li> Inject le colliculus supérieur de la même façon que le cortex mais il faut noter que la région cible se trouve juste en arrière et latérale de lambda et à peu près à la ligne médiane (figures 3A et 3B). Avec des injections de succès, le mélange de plasmide remplit naturellement les contours du colliculus supérieur. Une fois les injections ont été faites avec succès, les animaux sont prêts pour l&#39;électroporation. </li></ol> Électroporation: <ol><li> D&#39;une façon très similaire, pour des injections de colliculus supérieur, placer la sonde chargée négativement de l&#39;électrode sur la zone injectée et la sonde chargée positivement autour de l&#39;oeil, museau ou le menton, la conduite de l&#39;ADN dans les régions superficielles du colliculus supérieur (figure 3C) . Dans ce cas, l&#39;orientation de l&#39;électrode se trouve à un angle de 25 à 40 ° par rapport à la ligne médiane. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

L&#39;aspect le plus critique pour l&#39;électroporation réussie des progéniteurs de surface piales sont: 1) le ciblage du plasmide mélange à la surface pial; 2) en évitant la génération d&#39;hématomes au site d&#39;injection; et 3) en évitant la mortalité associées à l&#39;électroporation mésencéphale. Cibler de manière appropriée la surface pial est réalisé par perforation mesurée et soignée du crâne pour éviter la pénétration de la surface pial. Incorrecte de ci...

Cellules souches et progénitrices neurales sont présentes tout au long du mammifère CNS 1, 2. Leur nature et les propriétés dans les zones germinales embryonnaires et adultes entourant les régions ventriculaires du cerveau et de la moelle épinière ont été largement documentés dans la dernière décennie 1-3. En grande partie, cela est dû au développement d&#39;outils génétiques de plus en plus précises, telles que le système nerveux spécifique recombinaison Cre des allèles floxé ou lignée rétroviral traçage 4. Toutefois, une région-l&#39;ancêtre géniteur de surface pial zone-a récemment été décrite en détail 5-7 et attend examen complet. La surface piale du cerveau est définie comme l&#39;interface entre la surface du cerveau et des méninges entourant 8. Au cours du développement, neuro et, plus tard, radiaux gliales pieds finaux attachent à cette surface 9,10. Certains des sapinsst neurones dans le cerveau humain et de nombreux mitoses neuronales sont observés dans cette région 11. Plus tard, au cours de la neurogenèse embryonnaire, les interneurones corticaux sont connus pour traverser la région pial, en plus de leurs routes migratoires dans la zone intermédiaire et la zone sous-ventriculaire 12-14. Pendant cette période, les cellules souches peuvent être cultivées à partir de cette zone et il semble être un site actif de la neuro-et gliogénèse 5. Dans le cerveau adulte, il a été rapporté que les interneurones peuvent être nés à partir de progéniteurs de surface piales après la provocation hypoxique 7. Toutefois, la contribution de cette région à son à genensis cours du développement embryonnaire et postnatal est restée obscure en partie en raison de la difficulté d&#39;enquêter spécifiquement cette région 6. Dans le colliculus supérieur et dans le cortex cérébral, les interneurones superficielles (couche I ou dans le cortex) peuvent moduler la sortie du circuit de populations de neurones excitateurs sous-jacentes et de contribuer ainsi significantly à la fonction de ces structures. En particulier, la couche 1 interneurones sont en position privilégiée pour réguler la décharge des neurones à travers les couches supérieures du cortex cérébral en raison de leur connectivité étendue aux couches superficielles et profondes de colonnes corticales 15,16. D&#39;une manière similaire, les interneurones horizontales reçoivent entrée excitatrice à partir de fibres corticales et de la rétine, projet sur ​​une zone relativement large et sont spéculé à la médiation inhibition de populations neuronales répondant aux stimuli visuels à distance 17,18. En outre, leur morphologie est bien adapté à jouer un rôle potentiel dans l&#39;activité d&#39;onde motifs dans le système visuel en développement 19. Fait intéressant, le développement des interneurones et la maturation se produit dans une large mesure après la naissance. En outre, ce processus de maturation a été trouvé à être réglementées par l&#39;activité neuronale et est donc un substrat de la plasticité du développement avec des conséquences pour la vie sur la fonction de circuit 20,21. Notamment, no promoteurs sont décrits qui peuvent cibler spécifiquement ces cellules transgénique. Progéniteurs de division peuvent être ciblées avec rétrovirus 7 mais la production de virus est longue et requiert des compétences pour obtenir les titres élevés nécessaires pour la transduction cellulaire. L&#39;électroporation a conduit à une renaissance de l&#39;étude de développement neurologique, car elle permet l&#39;interrogation génétique rapide et efficace des voies de signalisation dans progéniteurs neuronaux 4, 22, 23. L&#39;électroporation implique l&#39;injection d&#39;ADN de plasmide, suivie par l&#39;envoi d&#39;impulsions électriques à l&#39;extérieur de la tête, à conduire de manière unidirectionnelle de l&#39;ADN dans les progéniteurs proliférant entourant les ventricules 4, 22, 23. L&#39;électroporation semble exiger transit à travers les cellules de la phase M du cycle cellulaire pour l&#39;expression de transgènes plasmidiques 24. Plus précisément, il a été trouvé que seulsles cellules passant à travers l&#39;intérieur de la phase M 8 h d&#39;électroporation de plasmides vont exprimer des transgènes malgré une livraison efficace de toutes les cellules à l&#39;intérieur de ~ 160 um de la paroi ventriculaire 24. On suppose que cela est dû à la nécessité d&#39;une rupture de l&#39;enveloppe nucléaire en permettant un accès nucléaire des plasmides épisomiques, en tant que produits chimiques provoquant la perméabilisation nucléaire peuvent induire l&#39;expression de plasmides dans des cellules post-mitotiques 25. Oeuvre à l&#39;origine dans l&#39;embryon 22, l&#39;électroporation a été adapté pour une utilisation dans le cerveau post-natal beaucoup plus tard 26, 27. Récemment, nous avons adapté électroporation pour une utilisation dans la manipulation génétique des progéniteurs de surface piales 6. En outre, en utilisant cette approche, nous avons montré qu&#39;il existe apparemment deux lignées distinctes de progéniteurs dans cette région et astrocytaire interneuronale-6. Ce protocole détaille un moyen simple, rapide et puissant pour cibler ces cellules pour l&#39;interrogatoirele développement de mécanismes de réglage de ces cellules.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:695px;" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Item Name</td>
			<td style="width:269px;">Vendor</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fire Polished Borosilicate Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>1B100F-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td>P-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, Inc.</td>
			<td>F7528</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECM 830 Generator</td>
			<td><a name="RANGE!B6">Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</a></td>
			<td>45-0052</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3mm Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</td>
			<td>45-0487</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SignaGel Electrode Gel</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>70315-025</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris-EDTA Buffer, pH 8.0</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>11-01-02-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Infrared Heat Lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36547-009</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Scissors Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal pial surface electroporation

Au cours des dernières années, la surface pial a été identifié comme un créneau germinal de l&#39;importance au cours embryonnaire, périnatale et adulte neuro-et gliogénèse, y compris après une blessure. Cependant, les méthodes d&#39;interrogation génétiquement ces populations de cellules progénitrices et de suivre leurs lignées ont été limitées en raison d&#39;un manque de spécificité ou de temps de production de virus. Ainsi, les progrès réalisés dans cette région a été relativement lente avec seulement une poignée d&#39;enquêtes de ce lieu. L&#39;électroporation a été utilisée pour plus d&#39;une décennie à étudier neurones propriétés de cellules souches dans l&#39;embryon, et plus récemment dans le cerveau postnatal. Nous décrivons ici une technique efficace, rapide et simple pour la manipulation génétique des progéniteurs de surface piales fondées sur une approche d&#39;électroporation adapté. Pial surface électroporation permet d&#39;étiquetage génétique facile et la manipulation de ces progéniteurs, qui représente une approche gain de temps et économique pour l&#39;étude de ces cellules.

Piales surface résultats d&#39;électroporation dans l&#39;expression de l&#39;ADN plasmidique dans des cellules de la plupart des progéniteurs-à ou près de la surface pial 6. Plus précisément, l&#39;orientation des électrodes est critique en dictant la direction de déplacement du plasmide et l&#39;expression subséquente. Ainsi, dans les deux configurations d&#39;électrodes, le plasmide est dirigée à peu près dans un vecteur linéaire entre l&#39;électrode négative et positive. Par conséquent,...

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Neonatal Pial Surface Electroporation

La surface piale est une zone de progéniteur unique dans le système nerveux central qui reçoit une attention croissante. Ici, nous détaillons une méthode de manipulation génétique rapide de cette zone souches en utilisant une méthode d&#39;électroporation modifié. Cette procédure peut être utilisée pour les enquêtes cellulaires et moléculaires de lignées cellulaires et les voies de signalisation impliquées dans la différenciation cellulaire et d&#39;élucider le sort et les propriétés des cellules filles.

Néonatale Pial électroporation de surface

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K vues.  Cedars-Sinai Medical Center.  La surface piale est une zone de progéniteur unique dans le système nerveux central qui reçoit une attention croissante. Ici, nous détaillons une méthode de manipulation génétique rapide de cette zone souches en utilisant une méthode d'électroporation modifié. Cette procédure peut être utilisée pour les enquêtes cellulaires et moléculaires de lignées cellulaires et les voies de signalisation impliquées dans la différenciation cellulaire et d'él...

Vidéo: Neonatal Pial Surface Electroporation

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Recherche

Neurosciences

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Néonatale électroporation zone sous-ventriculaire

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Sous-sélective électroporation corticaux Interneurones

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

L&#39;isolement et la culture des neurones de la moelle épinière chez les souris néonatales

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Préparation de surface cochléaire dans la souris adulte

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying neonatal seizures and hypoxia ischemia. This manuscript describes a method for continuous video electroencephalogram (EEG) monitoring in neonatal mice to detect seizures and analyze EEG background during hypoxia ischemia. Use of video and EEG in conjunction allows description of seizure semiology and confirmation of seizures. This method also allows analysis of power spectrograms and EEG background pattern trends over the experimental time period. In this hypoxia ischemia model, the method allows EEG recording prior to injury to obtain a normative baseline and during injury and recovery. Total monitoring time is limited by the inability to separate pups from the mother for longer than four hours. Although, we have used a model of hypoxic-ischemic seizures in this manuscript, this method for neonatal video EEG monitoring could be applied to diverse disease and seizure models in rodents.

This manuscript describes a method for continuous video EEG recordings using multiple depth electrodes in neonatal mice undergoing hypoxia-ischemia.

Électroencéphalogramme vidéo continu pendant l’hypoxie-ischémie chez les souris néonatales

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...

Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and lifelong neurological deficits. While PHH can be treated by temporary and permanent cerebrospinal fluid (CSF) diversion procedures (ventricular reservoir and ventriculoperitoneal shunt, respectively), there are no pharmacological strategies to prevent or treat IVH-induced brain injury and hydrocephalus. Animal models are needed to better understand the pathophysiology of IVH and test pharmacological treatments. While there are existing models of neonatal IVH, those that reliably result in hydrocephalus are often limited by the necessity for large-volume injections, which may complicate modeling of the pathology or introduce variability in the clinical phenotype observed.
Recent clinical studies have implicated hemoglobin and ferritin in causing ventricular enlargement after IVH. Here, we develop a straightforward animal model that mimics the clinical phenotype of PHH utilizing small-volume intraventricular injections of the blood breakdown product hemoglobin. In addition to reliably inducing ventricular enlargement and hydrocephalus, this model results in white matter injury, inflammation, and immune cell infiltration in periventricular and white matter regions. This paper describes this clinically relevant, simple method for modeling IVH-PHH in neonatal rats using intraventricular injection and presents methods for quantifying ventricle size post injection.

We present a model of neonatal intraventricular hemorrhage using rat pups that mimics the pathology seen in humans.

Modélisation de l’hémorragie intraventriculaire néonatale par injection intraventriculaire d’hémoglobine

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and ...

Micro-TDM du cerveau néonatal de souris et traitement d’images

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard method for soft tissues, although its low spatial resolution poses some limits for small animals. Here, we describe a protocol for obtaining high-resolution three-dimensional (3D) information on mouse neonate brains and skulls using micro-computed tomography (micro-CT). The protocol includes those steps needed to dissect the samples, stain and scan the brain, and obtain morphometric measurements of the whole organ and regions of interest (ROIs). Image analysis includes the segmentation of structures and the digitization of point coordinates. In sum, this work shows that the combination of micro-CT and Lugol's solution as a contrast agent is a suitable alternative for imaging the perinatal brains of small animals. This imaging workflow has applications in developmental biology, biomedicine, and other sciences interested in assessing the effect of diverse genetic and environmental factors on brain development.

Pleins feux sur l&#39;auteur : Imagerie haute résolution du cerveau de souris nouveau-née - Un protocole de micro-tomodensitométrie avec l&#39;agent de contraste Solution de Lugol

This study describes the steps for obtaining high-resolution images of neonatal mouse brains by combining micro-computed tomography (micro-CT) and a contrast agent in ex vivo samples. We describe basic morphometric analyses to quantify brain size and shape in these images.

Imagerie micro-tomodensitométrie et analyse morphométrique du cerveau néonatal de souris

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...