Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Agenzia di ricerca sloveno (progetto J2-9770, IP-0510 centro infrastrutturali e programma P2-0249). Questo video rappresenta materiale supplementare per il &quot;Elettroporazione basato Tecnologie e Trattamenti&quot; laboratorio scientifico e corso post-laurea, organizzato dalla Facoltà di Ingegneria Elettrica presso l&#39;Università di Lubiana, Slovenia. Autori ringraziano anche Dusa Hodzic per la gentile fornitura del DNA plasmidico.

1. Coltura cellulare, il plasmide e la preparazione del buffer per l&#39;esperimento <ol><li> In questo esperimento le cellule ovariche di criceto cinese (CHO-K1) sono utilizzati. Le cellule sono coltivate in una miscela di nutrienti HAM-F12 (PAA) integrato con 2 mM di L-glutamina, 10% di siero fetale bovino, 400 microlitri / l gentamicina (tutti da Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Germania), e 1 ml / l crystacilin (Pliva, Zagabria, Croazia). Le cellule sono conservate a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 nell&#39;atmosfera nell&#39;incubatrice per 24 ore. </li><li> Amplificare plasmide pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, USA) che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) in DH5α ceppo di Escherichia coli e isolare con HiSpeed ​​plasmidi Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Germania). Concentrazione di DNA plasmide (plasmide disciolti in tampone TE) dovrebbe essere determinata spettrofotometricamente a 260 nm e confermato mediante elettroforesi su gel. </li><li> Preparare isoosmolar tampone fosfato di sodio (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 1 mM MgCl2, 250 mM saccarosio, pH 7,4). </li><li> Il giorno di esperimento preparare sospensione cellulare da tripsinizzazione con il 0,25% tripsina / EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Germania). Centrifugare le cellule per 5 min a 1000 rpm (180 xg) a 4 ° C (Sigma, Germania) e risospendere pellet di cellule in tampone isoosmolar fosfato di sodio per una densità cellulare di 5 × 10 6 cellule / ml. </li></ol> 2. Dotazione hardware <ol><li> Le cellule sono esposte a campo elettrico in puntale (Figura 1) con elettrodi integrata collegata ad un generatore ad alta tensione prototipo. La punta e la geometria di elettrodi permette l&#39;applicazione della relativa omogeneità di campo elettrico e il generatore permette la consegna di impulsi elettrici in direzioni diverse. La punta e il generatore sono stati sviluppati presso il Laboratorio di Biocybernetics, Facoltà di Ingegneria Elettrica, Università di Lubiana 1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3309/3309fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Verticale e orizzontale (a), sezione fotografia e (b), della punta della pipetta con elettrodi integrati. Nella sezione colore grigio è utilizzato per la custodia in plastica e nero per gli elettrodi. La punta della pipetta con elettrodi integrato è costituito da quattro elettrodi barra cilindrica. Gli elettrodi sono in acciaio inox, il loro diametro è di 1,4 mm, elettrodi adiacenti sono 1 mm l&#39;una dall&#39;altra, e gli elettrodi opposti sono 2 mm. Gli elettrodi sono incollate in punta di plastica in parallelo e la loro lunghezza applicabile è di 30 mm 2. 3. Gene electrotransfer protocollo <ol><li> Aggiungi plasmide pEGFP-N1 ad una sospensione di cellule in concentrazione di 10 mcg / ml. </li><li> Incubare la miscela per 2-3 minuti a temperatura ambiente, prima di applicare gli impulsi elettrici. </li><li> Aspire 100 l di sospensione cellulare in la punta della pipetta con elettrodi integrati. </li><li> Per ottenere il miglior efficacia electrotransfer genica e mantenere la vitalità cellulare, i parametri ottimali di impulsi elettrici devono essere utilizzati. In questo esperimento un treno di 8 impulsi rettangolari (ciascuno con durata di 1 ms, ampiezza 225 V a 1 Hz, frequenza di ripetizione) è applicato a ciascun campione, utilizzando ad alta tensione del generatore prototipo. Due differenti protocolli di campo elettrico (Figura 2) sono utilizzati: in primo protocollo tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione, mentre nel secondo protocollo impulsi vengono consegnati cambiando alternativamente la direzione del campo elettrico e l&#39;orientamento. Il secondo protocollo può essere utilizzato solo con generatore di impulsi appropriati, che consente l&#39;applicazione di impulsi elettrici in direzioni diverse. </li><li> Immediatamente dopo l&#39;applicazione di impulsi trasferimento alle cellule di puntale in 6 pozzetti e aggiungere siero fetale bovino (FCS-Sigma, USA) (25% del volume del campione). </li><li> Incubare le cellule per 5 minuti a 37 ° C per consentire una nuova chiusura della membrana cellulare. </li><li> Aggiungere 2 ml di HAM-F12 per ogni campione in 6 bene e incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 nell&#39;atmosfera nell&#39;incubatrice. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3309/3309fig2.jpg" alt="Figura 2"/> . Figura 2 protocolli di campo elettrico: (a) tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione, (b) gli impulsi vengono consegnati alternativamente cambiando la direzione del campo elettrico e l&#39;orientamento. 4. Acquisizione di immagini e la determinazione di efficacia gene electrotransfer <ol><li> L&#39;efficacia del gene electrotransfer è determinato come percentuale di cellule che esprimono GFP 24 ore dopo l&#39;applicazione di impulsi. </li><li> Le cellule sono osservati utilizzando un microscopio a fluorescenza (nel nostro caso Zeiss 200, Axiovert, ZR Germania) con luce di eccitazione a 488 nm generata con un sistema monocromatore (policromia IV, Visitron, Germania) e di emissione è rilevata a 507 nm. Le immagini vengono registrate con sistema di imaging (MetaMorph sistema di imaging, Visitrsu, Germania), ma altri software di acquisizione simili possono anche essere utilizzati. </li><li> Acquisire almeno cinque immagini (contrasto di fase e fluorescenza verde) a 20x obiettivo. </li><li> Contare le celle in immagini a contrasto di fase e le cellule che esprimono GFP in verde immagine fluorescenza. Determinare la percentuale di efficacia gene electrotransfer dividendo il numero di cellule che esprimono GFP con il numero di tutte le cellule in ogni immagine corrispondente (Figura 3). </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/3309/3309fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. La percentuale di cellule che esprimono GFP, quando tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione e quando gli impulsi vengono consegnati alternativamente cambiando la direzione del campo elettrico e l&#39;orientamento è presentato. Cellule sono state esposte ad un treno di otto impulsi di ampiezza 225 V, durata 1 ms e frequenza di ripetizione di 1 Hz. Risultati sono stati ottenuti mediante microscopia a fluorescenza. Ogni valore nel grafico rappresentano media di tre esperimenti indipendenti ± deviazione standard. Cambiando la direzione del campo elettrico e l&#39;orientamento della percentuale di cellule che esprimono GFP aumenta.

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	<li>Rebersek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporator+with+automatic+change+of+electric+field+direction+improves+gene+electrotransfer+in-vitro.">Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro.</a> Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).</li><li>Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip+electrode+chamber+for+small+volume+electroporation,+electrofusion,+and+gene+transfection.">Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection.</a> 18, (2006).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-841 (1982).</li><li>Daud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+trial+of+interleukin-12+plasmid+electroporation+in+patients+with+metastatic+melanoma.">Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma.</a> J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).</li><li>Pavlin, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+conductivity+of+a+suspension+of+permeabilized+cells:+a+theoretical+analysis.">Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis.</a> Biophys J. 85, 719-729 (2003).</li><li>Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+mechanisms+of+electric+field-induced+DNA+transfection.+IV.+Effects+of+DNA+topology+on+cell+uptake+and+transfection+efficiency.">Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency.</a> Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).</li><li>Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+electrotransfection+of+mammalian+cells.">Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).</li><li>Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+synchronization+effect+on+mammalian+cell+permeabilization+and+gene+delivery+by+electric+field.">Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field.</a> Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).</li><li>Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Mg+ions+on+efficiency+of+gene+electrotransfer+and+on+cell+electropermeabilization.">Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization.</a> Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).</li><li>Rols, M., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electropermeabilization+of+mammalian+cells+to+macromolecules:+control+by+pulse+duration.">Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration.</a> Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).</li><li>Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+involved+in+gene+electrotransfer+using+high-and+low-voltage+pulses-An+in+vitro+study.">Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study.</a> Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).</li><li>Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+electrophoresis+in+gene+electrotransfer.">The role of electrophoresis in gene electrotransfer.</a> J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).</li><li>Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+electrode+orientation+improves+the+efficacy+of+electrochemotherapy+of+solid+tumors+in+mice.">Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice.</a> Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).</li><li>Faurie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-mediated+gene+transfer+and+expression+are+controlled+by+the+life-time+of+DNA/membrane+complex+formation.">Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation.</a> J Gene Med. 12, 117-125 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Gene electrotransfer è una tecnica biotecnologica versatile che consente il trasferimento del DNA nelle cellule mediante l&#39;applicazione di brevi impulsi elettrici ad alta tensione 3 e rappresenta una alternativa più sicura di vettori virali per la sua sicurezza, efficacia e facilità di applicazione. Anche se gene electrotransfer oggi è ampiamente utilizzata per trasfettare tutti i tipi di cellule e prima fase io studio clinico con questo metodo è stato segnalato 4, i meccanismi alla base n...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> HAM-F12 </td><td> PAA </td><td> E15-016 </td><td> terreno di coltura </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7513 </td><td></td></tr><tr><td> siero fetale bovino </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> gentamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397 </td><td> antibiotico </td></tr><tr><td> crystacilin </td><td> Pliva </td><td> 625110 </td><td> antibiotico </td></tr><tr><td> pEGFP-N1 </td><td> Clontech Laboratori </td><td> 6085-1 </td><td> DNA plasmidico </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​Kit Maxi plasmidi </td><td> Qiagen </td><td> 12662 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Merck </td><td> F640786 933 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> TKI Hrastnik </td><td> 0795 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-8266 </td><td></td></tr><tr><td> saccarosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 16104 </td><td></td></tr><tr><td> tripsina / EDTA soluzione </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T4174 </td><td></td></tr><tr><td> puntale </td><td> Una soluzione su misura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> generatore di impulsi elettrici </td><td> Una soluzione su misura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 pozzetti </td><td> TPP </td><td> 92406 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga da 15 ml tubo </td><td> TPP </td><td> 91015 </td><td></td></tr><tr><td> 75 centimetri 2 cultura fiasco </td><td> TPP </td><td> 90076 </td><td></td></tr></tbody></table>

changing the direction and orientation of electric field during electric pulses application improves plasmid gene transfer in vitro

Gene electrotransfer è un metodo fisico usati per fornire i geni nelle cellule mediante l&#39;applicazione di impulsi elettrici brevi e intensi, che causano destabilizzazione della membrana cellulare, rendendo permeabili a molecole piccole e permette il trasferimento di grandi molecole come il DNA. Rappresenta un&#39;alternativa ai vettori virali, grazie alla sua sicurezza, efficacia e facilità di applicazione. Per gene electrotransfer diversi protocolli di impulsi elettrici vengono utilizzati al fine di ottenere il massimo transfezione genica, uno di loro sta cambiando la direzione del campo elettrico e l&#39;orientamento durante la consegna degli impulsi. Cambio di direzione del campo elettrico e l&#39;orientamento aumentare la superficie della membrana competente per l&#39;ingresso del DNA nella cellula. In questo video, dimostriamo la differenza di efficacia gene electrotransfer quando tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione e quando gli impulsi vengono consegnati alternativamente cambiando la direzione del campo elettrico e l&#39;orientamento. A questo scopo punta con elettrodi integrati e ad alta tensione prototipo di generatore, che permette di cambiare di campo elettrico in diverse direzioni durante l&#39;applicazione di impulsi elettrici, sono stati utilizzati. Gene efficacia electrotransfer è determinato 24 ore dopo l&#39;applicazione di impulsi come il numero di cellule che esprimono la proteina fluorescente verde divisa con il numero di tutte le cellule. I risultati mostrano che la transfezione genica è aumentata quando l&#39;orientamento del campo elettrico durante la consegna degli impulsi elettrici è cambiato.

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Changing the Direction and Orientation of Electric Field During Electric Pulses Application Improves Plasmid Gene Transfer in vitro

Trasfezione genica mediante elettroporazione è migliorato di circa due volte quando l&#39;orientamento del campo elettrico viene modificato durante l&#39;applicazione di impulsi, mentre la vitalità cellulare non è interessato. L&#39;aumento della transfezione genetica è causata dalla crescita dell&#39;area membrana che è competente per l&#39;ingresso del DNA nella cellula.

Cambiare la direzione e l&#39;orientamento del campo elettrico durante l&#39;applicazione impulsi elettrici migliora il trasferimento plasmidi Gene In vitro</em

Gene electrotransfer is a physical method used to deliver genes into the cells by application of short and intense electric pulses, which cause ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Changing the Direction and Orientation of Electric Field During Electric Pulses Application Improves Plasmid Gene Transfer in vitro

10.4K Views.  University of Ljubljana. Trasfezione genica mediante elettroporazione è migliorato di circa due volte quando l'orientamento del campo elettrico viene modificato durante l'applicazione di impulsi, mentre la vitalità cellulare non è interessato. L'aumento della transfezione genetica è causata dalla crescita dell'area membrana che è competente per l'ingresso del DNA nella cellula.