Cette recherche a été financée par les subventions du NIH K08 AI062732, K12 HD001401, et 1UL1RR024139-02 et une subvention de recherche en santé des enfants de la Fondation Charles H. Hood SB-M. et par la Fondation de recherche à l&#39;Université d&#39;État de New York à Stony Brook.

1. EBV stock de la préparation <ol><li> Subculture croissance exponentielle cellules B95-8 (ATCC # CRL 1612; 13) à 3 x 10 5 cellules / ml dans un 75cm 2 flacon de culture tissulaire en utilisant une technique stérile. Les cellules sont cultivées en RPMI complet contenant 1640 inactivées par la chaleur 10% de sérum fœtal bovin (FBS), pénicilline / streptomycine au 100U/ml et 100 pg / ml, respectivement, et l&#39;amphotéricine B à 0,5 pg / ml à 37 ° C en présence de 5% de CO 2. </li><li> Quarante-huit heures plus tard, remettre les cellules en eau douce complète RPMI 1640 à 1 x 10 6 cellules / ml. Pour induire la production de virus, de stimuler les cellules avec 20ng/ml tétradécanoyl acétate de phorbol (TPA) pendant 1 heure dans une norme incubateur à CO 2. Laver les cellules trois fois avec du RPMI 1640 pour retirer le TPA. </li><li> Resuspendre les cellules dans le volume initial de complet RPMI 1640 (contre 1,2) et placer le ballon dans le CO 2 incubateur pendant 96 heures. Cette méthode a été montré pour produire des titres élevés d&#39;nominale virus infectieuxticles 6. </li><li> Centrifuger à 600 x g pendant 10 min à 4 ° C pour séparer les surnageant de culture contenant de l&#39;EBV des cellules. Surnageant Filtrer à travers un filtre de 0,45 micron, aliquot, et conserver à -70 ° C pendant plus d&#39;un an. Une alternative est d&#39;obtenir le surnageant de cellules B95-8 contenant l&#39;EBV de l&#39;ATCC (VR-1492) et à utiliser à la dilution recommandée par l&#39;ATCC. </li></ol> 2. Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP) <ol><li> Draw 10 ml de sang du donneur dans une seringue ou un tube hépariné sang hépariné. Diluer avec 20 ml de sang PBS à température ambiante dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Sous-couche de sang dilué avec 15 ml de milieu Ficoll Hypaque séparation de lymphocytes. Centrifuger à 225 x g sans frein à la température ambiante pendant 30 minutes. </li><li> Retirez la couche leucocytaire et transférer dans un nouveau tube de 50 ml conique. Augmenter le volume à 50 ml avec du PBS et centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 10 minutes. </li><li> Pour le liquide surnageant. Laver les cellules par remise en suspension le culot dans 50 ml de PBS et de filer à 600 x g à température ambiante pendant 10 minutes. Laver deux fois plus dans une manière semblable. </li><li> Resuspendre lavé les cellules dans 1 ml de RPMI complet. Utilisez 5 pi de cellules pour préparer une dilution 1 / 10 en bleu Trypan. Nombre de cellules vivantes en utilisant un hématimètre. </li><li> Réglez le volume à l&#39;aide de RPMI complet dans un flacon de 25 cm 2 de culture de tissus pour obtenir une concentration cellulaire de 2 x 10 6 / ml. </li></ol> 3. L&#39;infection par l&#39;EBV <ol><li> Ajouter le FK506 (AG scientifique) à la suspension cellulaire de 2,6 à une concentration finale de 20 nM. Placez flacon de CO 2 incubateur à 37 ° C pendant une heure. </li><li> Rapidement le dégel d&#39;une partie aliquote de l&#39;EBV. Retirer flacon de l&#39;incubateur et d&#39;ajouter l&#39;EBV dans les cellules à 1 / 10 de dilution. Typiquement, cette dilution fournit une MOI de 50-100. Swirl flacon à mélanger et à le placer en position verticale dans incubateur à CO2 à 37 ° C. </li></ol> E Remarqueà l&#39;étape 4, réalisé pour prédire le succès, est une étape facultative. Si l&#39;étape 4 doit être effectuée, vous aurez besoin d&#39;incuber un flacon supplémentaire de non-infectés PBMC à 2 x 10 6 cellules / ml comme contrôle. 4. Identifier la population proliférante de cellules (étape optionnelle) <ol><li> Préparer tampon FACS: PBS + 5% de FBS. Conserver à 4 ° C. </li><li> Faire l&#39;anticorps suivants mélange dans un volume de 50 uL de chaque pour la coloration des cellules à l&#39;étape 4.6. Dilutions d&#39;anticorps doit être faite dans le tampon FACS contenant 1mg/ml d&#39;IgG de souris (Sigma) à inhiber la liaison non spécifique par des anticorps. <ol class="lroman"><li> mono-coloré avec PE conjugué anti-CD23 anticorps (1 / 50 de dilution) </li><li> mono-coloré avec FITC conjugué anti-CD58 anticorps (1 / 50 de dilution) </li><li> mono-coloré avec PE-Cy5 conjugués anticorps anti-CD19 (1 / 50 de dilution) </li><li> triple-colorées pour CD23, CD58, et CD19 (1 / 50 de dilution de chaque) </li><li> unique teinté avec un contrôle PE isotype conjuguésd&#39;anticorps adaptés à CD23-PE (à la même concentration que les anti-CD23 anticorps) </li><li> unique colorés avec des anticorps isotype contrôle FITC conjugué adapté à CD58-FITC (à la même concentration que les anti-CD58 anticorps) </li><li> mono-coloré avec PE-Cy5 anticorps conjugué de contrôle adapté à l&#39;isotype CD19-PE-Cy5 (à la même concentration que anticorps anti-CD19) </li><li> triple-colorés avec les trois anticorps isotype contrôle. </li></ol> Stocker temporairement les mélanges à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> En trois jours après l&#39;exposition à l&#39;EBV, doucement flacon tourbillonner pour obtenir une suspension cellulaire plus uniforme. Retirer du flacon 2ml dans un tube Eppendorf 2ml. Spin tube dans une microcentrifugeuse à 3000 rpm à température ambiante pendant 3 minutes. </li><li> Aspirer cellules surnageant et remettre en mémoire tampon FACS à 5 x 10 6 à 1 x 10 7 cellules / ml. </li><li> Enlevez huit parties aliquotes 50 pl dans des tubes Eppendorf individu ou d&#39;un de 96 puits à fond en V assiette. Spin tubes ou la plaque à 1500 x gpendant 3 minutes. </li><li> Jeter les tubes vortex de surnageant et / plaque. Resuspendre les cellules dans chaque tube / puits dans 50 pi de tampon FACS contenant des dilutions d&#39;anticorps appropriés préparées en 4.2. </li><li> Incuber les tubes / plaque sur la glace dans l&#39;obscurité pendant 30 minutes. Centrifuger les cellules à 3000 rpm pendant 3 minutes, retirez le surnageant et ajouter 200 ul de tampon FACS. Centrifuger les cellules et retirer le surnageant pour compléter le lavage. Répéter deux lavages. </li><li> Resuspendre les cellules dans 200 uL de tampon FACS et d&#39;acquérir des données en utilisant un cytomètre en flux, l&#39;acquisition de 20 000 événements / tube. </li><li> Analyser les données en utilisant WinMDI (freeware pour FACS analyse des données sur PC). Porte sur des cellules vivantes en utilisant des profils de dispersion avant et latérale. Puis, les cellules porte vivre pour l&#39;expression de CD19 + (marqueur des cellules B) après comparaison avec les cellules colorées avec un anticorps isotype contrôle adaptés aux anticorps anti-CD19. Terrain CD19 + live cellules B avec une intensité de fluorescence pour CD23 sur l&#39;axe x et l&#39;intensité de fluorescence pour CD58 sur l&#39;axe Y. Déterminer CD23 + CD58 + et les cellules en comparant à l&#39;EBV ont exposé des cellules colorées par correspondance anticorps isotype contrôle. Présence de CD23 + CD58 Salut cellules EBV-exposées de la culture (figure 2C) prédit prolongement réussi de l&#39;EBV infectées de croissance des cellules transformées. En revanche, CD23 + cellules CD58 Salut n&#39;émergent pas lorsque les cellules ne sont pas exposés à l&#39;EBV (figure 2A) ou exposé à une souche non immortalisant de l&#39;EBV (figure 2B). CD23 CD58 Salut cellules + ont été expérimentalement démontré de subir la prolifération et par la suite établir des LCL (14). </li></ol> 5. Expansion et la cryoconservation de LCL <ol><li> Visualisation des cellules par microscopie optique: En une semaine après l&#39;infection à EBV, des amas de cellules sont visibles en microscopie optique. La figure 3 montre un exemple de début grappes microscopiques (figure 3B) dans un ballon. </li><li> Comme le temps passe, les grappes microscopiques deviennent plus grands tels que des bouquets sont visiblesmacroscopiquement dans le ballon. La figure 3C montre grandes grappes de cellules dans établies LCL en microscopie optique. </li><li> Nourrir les cellules: doubler le volume de milieu de culture dans le ballon de la culture au jour 12. Par la suite, étendre la culture en augmentant son volume 2-3 fois à l&#39;aide de RPMI complet. </li><li> Périodicité des cellules d&#39;alimentation doit être déterminée selon le taux de croissance des cellules. Lorsque le milieu de culture devient jaune, il est généralement temps de remplacer les médias comme ci-dessus. Typiquement, cela se produit une fois par semaine. Toutefois, certaines lignées cellulaires peuvent avoir besoin d&#39;être nourri, plus ou moins fréquemment. Développer la culture à 75-100 ml au cours des prochaines semaines. </li><li> Cryoconservation: Quand le gel jusqu&#39;à cellules, les cellules par centrifugation à 600 x g pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez la cellule surnageant et remettre le culot dans un milieu de congélation froide contenant 90% de FBS et 10% de diméthylsulfoxyde à 1 x 10 7 cellules / ml. Placer le tube dans l&#39;azote liquide. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Succès est prédite par la présence de CD23 + CD58 Salut cellules. Environ 2-3% des cellules en direct sur 3-4 jours après l&#39;exposition à l&#39;EBV devrait avoir ce profil (figure 2C). D&#39;autres sous-populations de CD23 +, CD23 -, CD58 +, CD58 et - les cellules observées après une exposition à l&#39;EBV montre la prolifération minime 14. Un des cellules infectées (figure 2A) et les cellules exposées à partir de l&#39;EBV HH514-16 cellules (figure 2B), l&#39;hébergement d&#39;une souche non-immortalisant de l&#39;EBV, ne démontrent pas CD23 + CD58 Salut cellules. Vous pouvez également visualiser les cellules par microscopie optique pour contrôler le succès: Comme mentionné précédemment, une semaine après l&#39;infection à EBV, de petits amas de cellules dans le ballon sont visibles au microscope optique (figure 3B). Comme le temps passe et les cellules se développer en LCL, amas microscopiques deviennent plus grands (figure 3C), tels que les amas sont visibles macroscopiquement dans le ballon. Figure 1. Workflow pour la génération et la cryopréservation des lignées de cellules lymphoblastoïdes. Le sang périphérique est centrifugé à travers un gradient de Ficoll. Présents PBMC dans le buffy coat d&#39;un gradient d&#39;établis sont exposés à FK506 suivie par l&#39;addition de l&#39;EBV. EBV ont exposé des cellules sont cultivées à 37 ° C en présence de 5% de CO 2 d&#39;établir et d&#39;étendre ultérieurement LCL pour la cryoconservation. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg" /> Figure 2. Identification d&#39;une sous-population de cellules B devrait subir la prolifération après une exposition à l&#39;EBV. Un-infectés PBMC (A) ou PBMC exposé à l&#39;EBV provenant HH514-16 cellules (B) ou à partir de cellules B95-8 (C) en présence du FK506 ont été récoltés le jour 3. Les cellules ont été colorés avec un fluorochrome-conjugués anticorps dirigés contre CD19, CD23, CD58 et. Après gating sur cellules vivantess, non-infectées (A) et EBV-exposée (B et C) CD19 + cellules B ont été examinées pour l&#39;expression de CD23 et CD58. Une sous-population de cellules B exprimant CD58 et de niveaux élevés de CD23 (CD23 CD58 + Salut), observée uniquement dans les cellules exposées à la transformation compétents EBV (dérivée de cellules B95-8), est représenté. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg" /> Figure 3. Visualisation des amas de cellules dans les cellules infectées par l&#39;EBV. PBMC ont été traités avec le FK506 et infectés par l&#39;EBV. Un-infectées (A) et EBV-exposée (B), les cellules ont été examinées une semaine après l&#39;infection par microscopie à contraste de phase (grossissement 10X). Cinq semaines ancienne ligne de cellules lymphoblastoïdes est montré en C.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode décrite dans cet article génère LCL du sang du donneur périphérique avec l&#39;immortalisation rapide et les temps de cryopréservation. Grâce à l&#39;utilisation du FK506, un immunosuppresseur des cellules T, et des titres élevés de virus infectieux que nous sommes en mesure de favoriser la prolifération des cellules B infectées par EBV des cellules mononucléées du sang périphérique. Ces interventions font de la méthode décrite plus efficace, résultant en une expansion rapide de cellules pour des expériences ultérieures. Traditionnellement, la transformation de croissance a été surveillée par la visualisation des amas de cellules par microscopie optique d&#39;une semaine environ après l&#39;exposition à l&#39;EBV 6, 15. Toutefois, le regroupement des cellules n&#39;est pas un indicateur spécifique de la transformation de la croissance EBV médiation. Nous avons précédemment démontré identification cohérente de la population cellulaire proliférant à travers 14 cytométrie en flux, en fournissant une méthode précise et spécifique pour déterminer le succès le plus tôt que trois jours à l&#39;arrièrel&#39;exposition er des cellules B à l&#39;EBV.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Société </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> L&#39;amphotéricine B </td><td> Bioréactifs Fisher </td><td> BP 928-250 </td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde </td><td> Sigma </td><td> D 2650 </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin, inactivé à la chaleur </td><td> Sigma </td><td> F 4135 </td></tr><tr><td> Ficoll Hypaque média de séparation de lymphocytes </td><td> Mediatech </td><td> 25-072 </td></tr><tr><td> FK506 </td><td> AG scientifique </td><td> F 1030 </td></tr><tr><td> IgG de sérum de souris </td><td> Sigma </td><td> J&#39;ai 8765 </td></tr><tr><td> De souris anti-CD23 humain conjugués à PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555711 </td></tr><tr><td> Souris isotype IgG1 conjugués à PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554680 </td></tr><tr><td> De souris anti-CD58 humain conjugués au FITC </td><td> Pierce Thermo Scientific </td><td> MA1-82159 </td></tr><tr><td> Souris isotype IgG1 conjugués au FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550616 </td></tr><tr><td> De souris anti-CD19 humain conjugués à PE-Cy5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555414 </td></tr><tr><td> Souris isotype conjugués à PE-Cy5 IgG1 </td><td> Dako </td><td> X 0955 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Milieu RPMI 1640 </td><td> Sigma </td><td> R 8758 </td></tr><tr><td> Tétradécanoyl acétate de phorbol (TPA) </td><td> Calbiochem </td><td> 407952 </td></tr><tr><td> Tampon FACS (Phosphate Buffered Saline 1X + 5% sérum de veau fœtal) </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of epstein-barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines

L&#39;infection de cellules B avec virus Epstein-Barr (EBV) conduit à la prolifération et l&#39;immortalisation ultérieurs, résultant en l&#39;établissement de lignées de cellules lymphoblastoïdes (LCL) in vitro. Depuis LCL sont infectées de façon latente par l&#39;EBV, ils fournissent un système modèle pour étudier la latence du virus EBV et axée sur la prolifération des cellules B et la tumorigenèse 1. LCL ont été utilisés pour présenter les antigènes dans une variété de dosages immunologiques 2, 3. Par ailleurs, LCL peut être utilisé pour générer des anticorps monoclonaux humains 4, 5 et fournir une source potentiellement illimitée lorsque l&#39;accès au matériel biologique primaire est limitée 6, 7. Une variété de méthodes ont été décrites pour générer LCL. Méthodes précédentes ont inclus l&#39;utilisation de mitogènes tels que la phytohémagglutinine, le lipopolysaccharide 8 et 9 pokeweed d&#39;accroître l&#39;efficacité de l&#39;EBV à médiation immortalisation. Plus récemment, d&#39;autres ont utilisé immunosuppragents essive tels que la cyclosporine A pour inhiber des lymphocytes T destruction des cellules B infectées 7, 10-12. Le laps de temps considérable par l&#39;EBV à l&#39;établissement de lignées cellulaires entraîne le besoin de méthodes plus rapides et plus fiables pour l&#39;EBV conduit la transformation de croissance des cellules B. Utilisant une combinaison de titre élevé EBV et un agent immunosuppresseur, nous sommes capables d&#39;infecter constamment, transformer, et de générer LCL partir de cellules B dans le sang périphérique. Cette méthode utilise une petite quantité de cellules mononucléées du sang périphérique qui sont infectés dans les amas de cellules in vitro peut être démontrée. La présence de CD23 par l&#39;EBV en présence du FK506, une cellule T immunosuppresseurs. Traditionnellement, excroissance de cellules B proliférantes est surveillé par la visualisation des amas microscopiques de cellules d&#39;environ une semaine après l&#39;infection par l&#39;EBV. Des amas de LCL peut être vu par l&#39;oeil nu, après plusieurs semaines. Nous décrivons un essai afin de déterminer rapidement si l&#39;EBV médiation groissance de transformation est réussie avant même amas microscopiques de cellules peut être démontrée. La présence de CD23 + cellules CD58 Salut observée dès trois jours après l&#39;infection indique un résultat positif.

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Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Nous décrivons une méthode pour générer des lignes cellulaires transformées B à l&#39;aide d&#39;Epstein-Barr virus. Nous avons également illustrer un nouveau test qui permet d&#39;identifier les cellules B destiné à subir une transformation aussi tôt que trois jours après l&#39;infection.

Création d&#39;Epstein-Barr Virus croissance transformées lignées lymphoblastoïdes

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

establishment-epstein-barr-virus-growth-transformed-lymphoblastoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.8K vues.  State University of New York at Stony Brook. Nous décrivons une méthode pour générer des lignes cellulaires transformées B à l'aide d'Epstein-Barr virus. Nous avons également illustrer un nouveau test qui permet d'identifier les cellules B destiné à subir une transformation aussi tôt que trois jours après l'infection.

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Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

Dérivation des thymique lymphome à cellules T à partir des lignes Atm - / -</sup Et<emP53> - / -</sup Souris

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Recherche

Immunologie et infection

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

L&#39;expansion des lymphocytes T cytotoxiques à partir de sang de cordon ombilical qui cytomégalovirus cible, le virus Epstein-Barr Virus et Adénovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Imagerie de cellules vivantes de Alphaherpes Virus Transport antérograde et la propagation

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

Une cellule de Blood Red Simple Lysis Méthode pour la création de B lymphoblastoïdes lignées cellulaires

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

Une méthode Simple et efficace pour établir les NK et les lymphocytes T lignes provenant de Patients avec une Infection chronique Active Virus Epstein - Barr

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identification de codage et de Classes d’ARN Non codants exprimée chez le porc sang total

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Mise en place d’une Infection virale et analyse de l’Interaction hôte-Virus chez Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...