LWE et RK sont pris en charge par le US National Institutes of Health des subventions R37 NS033506-16 et R01-03 NS060699 nationale. MPT a été pris en charge par une société de bourse de recherche postdoctorale American Cancer (PF-10-057-01-MPC). Les conseils et les connaissances du Dr Matthew Lyman et le Dr Oren Kobiler ont joué un rôle dans la conception de la configuration du microscope et les méthodes d&#39;imagerie des cellules vivantes. Nous remercions également pour Neal Barlow et Brian T. Kain de Nikon Instruments pour leur assistance technique dans l&#39;acquisition, l&#39;installation et la performance du microscope.

Section 1 - Conditions de contrôle de l&#39;environnement pour la microscopie par fluorescence des cellules vivantes <ol><li> 30 min avant toute expérience d&#39;imagerie connecter et commencer à chauffer le microscope étage supérieur incubateur. <ol><li> Allumez le microscope, les sources de lumière transmise et épifluorescent, et les commandes de matériels automatisés. Ouvrez le logiciel de contrôle de microscope, NIS Elements, pour se connecter au microscope et commencer à refroidir l&#39;appareil EM-CCD. </li><li> Fixer l&#39;objectif plus chaud à l&#39;objectif approprié (60X ou 100X à immersion d&#39;huile). Remarque: Sélectionnez lentille de l&#39;objectif en fonction du type d&#39;expérience. Le contraste d&#39;interférence différentiel 100X (DIC) est le mieux pour le suivi des assemblées du virion transport antérograde alors que l&#39;objectif de phase 60X est adapté pour visualiser la propagation antérograde. Un grossissement inférieur, les objectifs d&#39;immersion non pétrolières n&#39;ont pas besoin d&#39;un objectif plus chaud car ils ne sont pas en contact direct avec l&#39;échantillon. </li><li> Fixez étage supérieur incubateur sur la platine motorisée de mi<html> croscope. Assurer l&#39;insert approprié qui tient l&#39;échantillon est en place. Fixer la conduite d&#39;air humidifié à partir du contrôle incubateur à l&#39;orifice d&#39;entrée de l&#39;étage de tête incubateur. </li><li> Allumez contrôles chauds incubateur et l&#39;objectif et régler les paramètres de température à des conditions spécifiques déjà vérifiés pour l&#39;objectif et l&#39;échantillon étant imagé (voir discussion). </li><li> Ouvrez la vanne de régulation sur les 5% de CO 2 / réservoir atmosphérique de 95% à fournir CO 2 air complétée au stade supérieur incubateur. Le débit doit être compris entre 60 et 80 ml de gaz par minute. Rythme plus rapide se traduira par déshydratation poussée de l&#39;échantillon en dépit de la chambre d&#39;humidification. </li></ol></li><li> Ajouter l&#39;huile d&#39;objectif sur l&#39;objectif et placer immédiatement la culture qui sera reproduite dans l&#39;étage supérieur incubateur. </li><li> Permettre l&#39;équilibrage de la température dans la culture pour un minimum de 10 min. Une heure est préférable, notamment pour l&#39;imagerie du jour au lendemain décrit dans la section 3. </li></ol>ve_title &quot;&gt; Section 2 - imagerie en temps réel des antérograde Virion Transport Events Protocole <ol><li> Six à huit heures avant l&#39;imagerie, infecter un plat de 35 mm lamelle-bas matures, les neurones SCG dissociées avec 1 x unités formant 10 6 de la plaque du virus d&#39;intérêt (voir le tableau 1, par exemple des virus) en utilisant la méthode décrite dans Taylor et al. 2012a 11. Si vous testez plus d&#39;un virus, la vaccination off-set par 30-60 min pour permettre l&#39;imagerie des échantillons séquentiels au même post-infection fois. </li><li> Insérez plat dans l&#39;étape supérieure incubateur pour un minimum de 10 minutes avant d&#39;exécuter n&#39;importe quelle expérience. Alors que la température s&#39;équilibre, le plan focal se déplace et aura un impact négatif sur les expériences d&#39;imagerie. </li><li> Utilisation de la lumière transmise et de l&#39;oculaire du microscope, pour un corps de cellule neuronale qui a une extension axonale clairement isolé. Vous pouvez également utiliser l&#39;éclairage par fluorescence approprié pour trouver une cellule exprimant DETECmontants des tables de protéines fluorescentes. Il est important de limiter l&#39;exposition de l&#39;échantillon à l&#39;éclairage fluorescent, à cette étape et les étapes ultérieures, en raison des dommages cellulaires induite par la lumière et le blanchiment des protéines fluorescentes. </li><li> Atténuer l&#39;éclairage à fluorescence à réduire l&#39;intensité de la lumière d&#39;excitation dans laquelle les cellules sont exposées. Engager atténuant la lumière densité neutre (ND) de filtres dans le trajet de la lumière d&#39;éclairage par fluorescence. Pour les films d&#39;une durée de 1 min, un minimum de ND4 doivent être utilisés pour empêcher photo-blanchiment des protéines fluorescentes et étendue photo-endommagement des axones. Structures fortement fluorescentes peuvent généralement être visualisé avec un filtre ND8 en place. </li><li> En utilisant le logiciel de microscope (Figure 2 et complémentaire Film 1A), mettez le trajet de la lumière à la caméra EM-CCD. </li><li> Déterminer le temps d&#39;imagerie optimales et des conditions pour chaque canal fluorescent. <ol><li> Lancez une fenêtre d&#39;image en direct en utilisant le bouton &quot;Play&quot;. &lt;/ Li&gt; <li> Déterminer les paramètres d&#39;exposition de l&#39;appareil optimal pour chaque protéine fluorescente. Ne pas dépasser 300 ms par canal comme des aberrations dynamiques sur les structures de virions mouvement rapide se produira. Utiliser le gain EM de l&#39;appareil photo à un réglage de 300 (suggérés par le fabricant gain maximum), afin de minimiser le temps d&#39;exposition et d&#39;améliorer la détection des signaux faibles. Temps d&#39;exposition correcte devrait produire une image avec une faible intensité de fond et les signaux spécifiques élevées. </li></ol></li><li> Après avoir réglé l&#39;exposition et de trouver une région bien définie de l&#39;axone, le logiciel doit être configuré pour effectuer l&#39;acquisition automatique d&#39;images. Arrêtez la fenêtre d&#39;imagerie en temps réel pour éviter échantillon de blanchiment. <ol><li> Dans le logiciel NIS Elements, sélectionnez le 6D - Définir / Exécuter l&#39;application de l&#39;expérience de la &quot;Applications&quot; menu déroulant. </li><li> Dans la fenêtre d&#39;acquisition de ND, cliquez sur l&#39;onglet Temps qui déterminera la fréquence d&#39;acquisition d&#39;image. Définir l&#39;intervalle de «pas de retard» et de la durée de 5 min. Thlogiciel de e acquerra alors trames d&#39;image à la fréquence la plus élevée possible pour la durée de 5 min. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet &quot;Lambda&quot;, qui permet de sélectionner les configurations matérielles prédéfinies utilisées pour de multiples acquisition d&#39;image fluorescente. Cliquez sur la première case et la baisse subséquente menu déroulant pour sélectionner une configuration matérielle appropriée. Répétez l&#39;opération pour toutes les protéines fluorescentes à imager. </li><li> S&#39;assurer que les languettes pour &quot;XY Positions&quot;, &quot;série Z&quot; et &quot;Image Grand&quot; sont de-sélectionnés. </li><li> Au-dessus des onglets, sélectionnez la case «Save to File&quot; pour sauvegarder automatiquement les images sur le disque dur lors de l&#39;acquisition. Configurer l&#39;emplacement et le nom de fichier du fichier de sortie de l&#39;expérience. Comme les expériences successives sont effectuées, le logiciel va ajouter un numéro séquentiel à la fin du nom de fichier désigné. </li><li> Une fois tous les onglets ont été sélectionnés. Initier l&#39;expérience en cliquant sur le bouton &quot;Run-Now&quot;. </li><li> Optimiser le taux d&#39;acquisition d&#39;image par le biais des paramètres d&#39;exposition et imagtaille de e. En utilisant une petite région de la zone d&#39;image est souvent capable d&#39;accélérer les taux d&#39;acquisition d&#39;images. Définir la zone d&#39;intérêt en utilisant l&#39;outil ROI dans NIS-Elements, en sélectionnant une zone située entre 25% et 50% de la superficie totale de l&#39;image. Alternativement, les temps d&#39;exposition plus courts vont augmenter les taux d&#39;acquisition d&#39;images, mais diminue la qualité de signal (voir la discussion). </li></ol></li></ol> Section 3 - Nuit imagerie time-lapse de antérograde spread Événements <ol><li> Quatre heures avant l&#39;imagerie, infecter une culture neuronale compartimentée construit sur un 35 mm μ-Dish. Inoculez corps cellulaires neuronaux avec 1 x 10 6 unités formatrices de plages du virus d&#39;intérêt (voir le tableau 1, par exemple des virus) en utilisant la méthode décrite dans Taylor et al. 2012b 12. </li><li> Placez délicatement boîte de culture dans l&#39;étage supérieur incubateur. S&#39;assurer que la position de l&#39;objectif est fixé sur le côté de la boîte. Porter lentement l&#39;objectif dans le foyer, s&#39;assurantment l&#39;objectif ne pousse pas vers le haut dans l&#39;échantillon. Une fois le champ de mise au point a été identifié, se déplacer lentement l&#39;objectif dans le centre de l&#39;assiette, près de la barrière interne démarquage du côté interne du compartiment de l&#39;axone. Pendant le déplacement, s&#39;assurer que la profondeur de mise au point est maintenue et éviter les poussant vers le haut dans l&#39;échantillon. Déviation de la surface en plastique par l&#39;objectif risque d&#39;endommager les axones et les plastiques. </li><li> Ajoutez environ 2 ml d&#39;eau tiède (~ 37 ° C) tampon phosphate salin à la boîte de culture à l&#39;extérieur de l&#39;anneau en téflon. Ce entoure la culture des neurones d&#39;une bague de PBS pour minimiser échantillon déshydratation et assurer une isolation thermique. </li><li> Laisser la température s&#39;équilibrer pendant au moins 1 heure avant de commencer l&#39;acquisition d&#39;image automatisé (3,8). Étapes 3.5 à 3.7 peuvent être configurés pendant ce temps. </li><li> Restreindre l&#39;intensité de l&#39;éclairage au niveau le plus bas possible en engageant tous les filtres de densité neutre. Cela permettra l&#39;acquisition d&#39;images fréquentes over de longues périodes sans excessive photo-dommages. Réduire l&#39;éclairage se traduira par un signal faible, ce qui nécessite de plus longues expositions (voir discussion). </li><li> Utiliser les paramètres d&#39;exposition historiques ou avant montage expérimental générer un plat parallèle des cellules épithéliales infectées exprimant les protéines fluorescentes cibles importantes pour établir les paramètres de l&#39;exposition, décrite à la section 2.5. </li><li> Après avoir réglé l&#39;exposition pour les canaux nécessaires, il est temps de configurer le logiciel pour l&#39;acquisition automatique d&#39;images. Arrêtez la fenêtre d&#39;imagerie en temps réel pour limiter échantillon de blanchiment. <ol><li> Dans le logiciel Elements (Figure 2 et le film supplémentaire 2), sélectionnez le 6D - Définir / Exécuter l&#39;application de l&#39;expérience de la &quot;Applications&quot; menu déroulant pour faire apparaître la fenêtre d&#39;acquisition de ND. </li><li> Dans la fenêtre d&#39;acquisition ND, cliquez sur l&#39;onglet Heure. Définir l&#39;intervalle de &quot;5 min&quot;. Réglez la durée à 20 h. Le champ des boucles est automatiquement calculée pour le nombre de répétitions du programmm sera performant. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet &quot;Lambda&quot;. Cliquez sur la première case et la baisse subséquente le menu déroulant, sélectionnez la configuration de lambda approprié pour le contraste de phase. Répétez l&#39;opération pour les positions suivantes, la sélection des configurations appropriées pour chaque protéine fluorescente à imager. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet &quot;Image Large&quot;, qui détermine les paramètres de plusieurs images à combiner dans un seul champ de vision plus large. Une zone de bonne taille se compose de 5 x 2 images à l&#39;aide de 7% chevauchement de couture. Cela permettra pour le nombre maximum de cellules par mesure d&#39;imager sans impact sur la fréquence d&#39;acquisition d&#39;image. Aussi, décochez la case pour &quot;Shutter Fermer actif pendant le mouvement de la scène&quot;. Cette option améliore la vitesse d&#39;acquisition en ne fermant volets entre les images. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet &quot;XY Positions&quot;, pour identifier plusieurs postes qui seront imagés séquentiellement en parallèle au cours du film du jour au lendemain. Sélectionnez positions qui définissent le centre point pour chaque grande zone d&#39;image. Sélectionner 6-8 positions d&#39;image de l&#39;échantillon. Une bonne partie de l&#39;image aura de petits amas de cellules en étroite apposition d&#39;axones clairement définis. Les cellules ne doivent pas être empilés les uns sur les autres et axone regroupement doit être minimisé. Le point de focalisation est le noyau de la cellule. Positionner l&#39;objectif de telle sorte qu&#39;une enveloppe nucléaire clairement définie est considérée pour la majorité des cellules. </li><li> Assurez-vous sur l&#39;onglet &quot;série Z&quot; est décochée. </li><li> Configurez la fonction de sauvegarde automatique tel que décrit ci-dessus à la section 2.6.5. </li><li> Testez l&#39;exposition et la position en cliquant sur ​​&quot;1 boucle temporelle&quot;. Évaluer les images qui en résultent pour l&#39;éclairage transmis de lumière, foyer, et le cadrage. Si accent s&#39;est déplacé, réinitialiser la mise au point pour chaque position sous l&#39;onglet XY. Attendre 10 minutes et répéter l&#39;opération jusqu&#39;à ce point est stable. </li><li> Après tous les paramètres ont été vérifiés et testés, initier l&#39;expérience automatisé en cliquant sur le bouton &quot;Exécuter&quot;. </li></ol></li&gt; </ol> Section 4 - Traitement de l&#39;image et de l&#39;Exportation Data Export <ol><li> Ensembles de données obtenues lors de l&#39;imagerie des cellules vivantes d&#39;événements de transport ou de propagation doivent être exportés depuis le logiciel NIS Elements en types de fichiers couramment utilisés pour une utilisation ultérieure à des présentations et des publications (Supplemental Movie 3). Pour exporter des films ouvrent la première nd2 fichier approprié. Dans NIS Elements et sélectionnez la vue &quot;split-composante&quot; pour visualiser les canaux fluorescents souhaités. Lire le fichier à une vitesse appropriée; 5 images par seconde est un bon point de départ pour la visualisation des fast-transport. </li><li> Inclure un horodatage pour représenter une horloge en temps réel pendant la lecture du film. Faites un clic droit sur l&#39;image et sélectionner, ajouter ND-information. Un compteur numérique apparaîtra dans le coin supérieur gauche. <ol><li> Modifier l&#39;horodatage pour afficher des informations. Faites un clic droit sur le comptoir et sélectionnez Modifier ND-information. Dans la fenêtre suivante pop-up, de modifier le texte pour refléter l&#39;imaginationng paramètres qui sont importants. Modifier la police, la couleur et la taille pour plus de clarté. </li></ol></li><li> Allez dans le menu &quot;Edition&quot; et trouver &quot;Créer vue instantané» ou appuyez sur la touche &quot;x&quot;. Cette commande ouvre la vue &quot;snapshot&quot; fenêtre. Sélectionnez &quot;s&#39;appliquent à tous les cadres&quot; pour générer un 8-bit, RGB, fichier prêt à exporter contenant les canaux fluorescents de l&#39;ensemble du film. </li><li> Enregistrer en tant que fichier. Avi pour une compatibilité multi-plateforme. Régler la vitesse de lecture de 200 ms par image. Les fichiers. Avi générés par NIS éléments peuvent ensuite être compressés avec d&#39;autres logiciels de conversion dans le type de fichier souhaité. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

Le but de l&#39;imagerie des cellules vivantes est l&#39;observation des processus biologiques tels qu&#39;ils se présentent sans altération significative par l&#39;acte d&#39;observation. Cet objectif est atteint par l&#39;optimisation de trois variables: le contrôle de l&#39;environnement, de la vitesse de l&#39;imagerie et l&#39;éclairage par fluorescence. Ces variables interdépendantes doivent être équilibrées pour obtenir des conditions d&#39;imagerie viables. Les protocoles présentés utilisent des condit...

Infection du système nerveux périphérique (SNP) par alphaherpes virus tels que le virus de l&#39;herpès simplex (HSV) -1, -2 et virus de la pseudo-rage (PRV) comporte plusieurs étapes complexes et fortement réglementés au long du cycle de vie du virus. Transport dans les neurones du SNP est essentiel pendant les événements des deux infection virale primaire et la suite propagation inter-hôte. Les mécanismes moléculaires qui modulent deux composantes du cycle de vie du virus, le transport dirigé des assemblées virales loin des corps cellulaires dans les axones (transport antérograde) et de la transmission ultérieure des virions aux cellules sensibles (propagation antérograde) sont importantes pour comprendre la pathogenèse herpèsvirus. Le transport et l&#39;évacuation des particules virales dans les neurones dépend de l&#39;assemblage d&#39;un 1,2 virion infectieux mature. Dosages préalablement fixés, y compris immunofluorescence (IF) et la microscopie électronique (EM), ont été utilisés pour étudier l&#39;état de l&#39;ensemble des particules et protinteractions ein associés au transport du virion et la propagation 3-6. Toutefois, la nature dynamique des virions transport et des artefacts expérimentaux mis en place par fixation chimique confondu l&#39;interprétation des images fixes 7,8. Récemment, un certain nombre de protéines de fusion virale fluorescentes ont été décrits pour le HSV et PRV qui ont des répercussions négligeables sur la fonction des protéines. Green Fluorescent Protein (GFP) et des protéines fluorescentes rouges (mCherry ou mRFP) fluorophores sont souvent jumelés pour permettre l&#39;imagerie de deux des trois composantes structurelles d&#39;un virion maturité: capside, tégument, et la glycoprotéine 9-11. Vivez l&#39;imagerie cellulaire du transport antérograde utilisant des virus à double marquage visualise l&#39;état d&#39;assemblage des particules virales durant le transport. Fluorophore similaire exprimant souches virales sont utilisés pour visualiser le nombre et la diversité des génomes viraux suivants propagation 12,13. Les propriétés des protéines fluorescentes (revue de 14,15) influent considérablement surla capacité de visualiser assemblées virales ou cellulaires. Les propriétés intrinsèques de la protéine fluorescente, y compris l&#39;auto-interactions et la stabilité, devraient être considérés lors de la conception et de tester de nouvelles protéines de fusion pour la préservation de la fonctionnalité de type sauvage. En conjonction avec des protéines de fusion fluorescentes, deux bien caractérisés dans les systèmes de culture cellulaire in vitro sont utilisés pour l&#39;imagerie des cellules vivantes de l&#39;infection par le virus de l&#39;herpès: dissocié 16 et compartimenté 17 (figure 1A) ganglions neurones cervicaux supérieurs de rat (CTB). Dans les deux systèmes, embryonnaire SCG de sont disséqués, dissocié à des organismes unicellulaires, et plaqué par culture in vitro 18. SCG neurones font partie du système nerveux autonome et peut être facilement cultivées et différenciées par le facteur de croissance neuronal (NGF) dans un état ​​polarisé matures ex vivo. Neurones SCG dissociées forment un réseau étendu d&#39;axones qui permet fou la visualisation de particules virales car ils subissent le transport antérograde 6. SCG cultures compartimentées offrent une isolation fluidique du corps cellulaire des neurones (S compartiment) et terminaisons axonales distales (compartiment N) 19. Un certain nombre de protocoles détaillés pour la construction et l&#39;utilisation des neurones compartimentées aide initiale de 20 ou modifié Campenot chambres 17 ont été publiés précédemment. Isolement fluidique permet d&#39;infection sélective des corps cellulaires neuronaux et la détection des virions fils après le transport de la gare Termini de l&#39;axone isolés. Placage cellules épithéliales sur les terminaisons avant l&#39;infection fournit des cellules réceptrices de la propagation de l&#39;infection virale. Il ya beaucoup d&#39;éléments essentiels importants pour tous vivent expérimentation d&#39;imagerie cellulaire, mais le plus pertinent pour nos protocoles sont les suivants: acquisition automatique de l&#39;image, éclairage fluorescent, la vitesse de l&#39;imagerie et le contrôle de l&#39;environnement. Pour toutes les expériences d&#39;imagerie, nous utilisonsinversé, automatisé, microscope d&#39;éclairage à épifluorescence (figure 1B). Le microscope est construit autour du Nikon Eclipse base de Ti et emploie un certain nombre de systèmes motorisés commandés par ordinateur pour reconfigurer rapidement le microscope lors de l&#39;acquisition automatique d&#39;images. Pour l&#39;éclairage par fluorescence, nous utilisons un large spectre mercure lampe à arc qui peut être atténué avec des filtres de densité neutre le long de la voie d&#39;éclairage. filtres d&#39;excitation limiter le spectre de l&#39;éclairage fluorescent et lorsqu&#39;il est associé à des miroirs dichroïques multi-pass et filtres d&#39;émission de fluorescence visualiser composés fluorescents spécifiques. Les filtres d&#39;excitation et d&#39;émission sont montés à commutation rapide roues indépendantes, le filtre pour permettre l&#39;acquisition séquentielle rapide des différents canaux fluorescents. La vitesse d&#39;acquisition des images est encore améliorée avec une caméra EM-CCD sensible et rapide, utile pour la détection des signaux de faible intensité et de courte images fois lu. Contrôle de l&#39;environnement sur la microscOPE est réalisée avec un haut stade chauffé incubateur et un chauffage de l&#39;objectif de maintenir les échantillons à des températures élevées pendant une atmosphère humidifiée 2 et CO enrichi est passé dans l&#39;incubateur. Le microscope est gardé dans une pièce sombre avec une température ambiante maintenue à près de 25 ° C et la lumière extérieure réduite avec des rideaux occultants sur toutes les fenêtres. Les protocoles suivants décrivent l&#39;utilisation de ce système pour le transport antérograde et des essais d&#39;étalement. Un certain nombre d&#39;alternatives existent pour contrôler les variables d&#39;imagerie des cellules vivantes. Le contrôle des paramètres de microscopie peut être effectuée manuellement ou par des systèmes automatisés qui dépendent de logiciels propriétaires. Éclairage par fluorescence peut être réalisé avec des sources laser halogène, LED ou. La vitesse de formation d&#39;image est modifiée par la vitesse de commutation du filtre et le temps pour visualiser le signal dans le système de détection couplé. Contrôle de l&#39;environnement peut être réalisé avec du matériel spécialisé sur la miétape de croscope, enceinte de tout ou partie du microscope dans une boîte chauffé et humidifié, ou en élevant la température de la pièce où microscopie sera effectuée. Chacune de ces alternatives a ses avantages et inconvénients liés aux coûts et à la performance. Dans le protocole suivant, nous détaillons l&#39;utilisation de l&#39;imagerie des cellules vivantes pour étudier le transport antérograde rapide et la propagation antérograde de alphaherpes virus grâce à l&#39;utilisation de souches virales recombinantes. Imagerie des cellules vivantes en temps réel visualise capside, tégument et / ou glycoprotéine co-localisation des structures dynamiques qui subissent le transport dans les axones 11. Imagerie timelapse nuit de cultures de neurones compartimentées visualise sortie du virion axonale et l&#39;infection de cellules sensibles 12. Les protocoles présentés ici ont été optimisés pour une utilisation avec notre système d&#39;imagerie en particulier, mais sont présentés en termes généraux par rapport aux quatre éléments d&#39;imagerie des cellules vivantes. Dans la discussion que nousseront plus en détail certains de l&#39;optimisation qui est nécessaire pour l&#39;expérimentation réussie.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm glass bottom culture dish</td>
 <td>MatTek Corporation; Ashland, MA </td>
 <td>P35G-1.5-20-C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm &mu;-Dish </td>
 <td>Ibidi USA LLC, Verona, WI </td>
 <td>81156</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope body </td>
 <td>Nikon Instruments Inc. </td>
 <td>Nikon Eclipse Ti</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized microscope X-Y stage</td>
 <td>Prior Scientific; Rockland, MA </td>
 <td>H117 ProScan Flat Top</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized filter wheels</td>
 <td>Prior Scientific</td>
 <td>HF110 10 position filter wheel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent illumination source </td>
 <td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada </td>
 <td>X-Cite 120Q </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-band Fluorescence filter sets</td>
 <td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td>
 <td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td>
 <td>iXon3 897 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chamlide stage top environmental incubator</td>
 <td>Live Cell Instruments; Seoul, South Korea</td>
 <td>TC-L-10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective lens heater</td>
 <td>Bioptecs; Butler, PA</td>
 <td>150803 Controller 150819-12-08 Heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Analysis software</td>
 <td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td>
 <td>NIS Elements </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

live cell imaging of alphaherpes virus anterograde transport and spread

Les progrès des techniques vivantes des cellules par microscopie de fluorescence, ainsi que la construction de souches virales recombinantes exprimant des protéines de fusion fluorescentes ont permis la visualisation en temps réel du transport et de la propagation de l&#39;infection par le virus alphaherpes des neurones. L&#39;utilité de nouvelles protéines de fusion fluorescentes à membrane virale, tégument, et capsides, en conjonction avec l&#39;imagerie des cellules vivantes, identifié ensembles de particules virales subissant transport à l&#39;intérieur des axones. Des outils similaires ont été utilisées avec succès pour les analyses de cellule à cellule propagation de particules virales de quantifier le nombre et la diversité des virions transmis entre les cellules. Surtout, les techniques d&#39;imagerie des cellules vivantes du transport antérograde et la propagation de produire une foule de renseignements, y compris des vitesses de particules de transport, de distribution de particules, et des analyses temporelles de la localisation des protéines. A côté des techniques génétiques virales classiques, ces méthodes ont fourni des renseignements cruciauxen questions mécanistiques importantes. Dans cet article, nous décrivons en détail les méthodes d&#39;imagerie qui ont été développés pour répondre aux questions de base du transport de virus alphaherpes et la propagation.

Transport antérograde L&#39;application de ce protocole d&#39;infections des cultures SCG dissociées avec PRV 348, une souche PRV recombinant exprimant la GFP-US9 et des protéines de fusion membranaire gM mCherry, a facilité la visualisation du transport antérograde des virions (Figure 3 et Movie supplémentaires 4). L&#39;incorporation de ces protéines de fusion dans des particules virales résultats dans leur détection sur le transport lacrymaux, et le...

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Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Imagerie des cellules vivantes d&#39;infections virales alphaherpes permet d&#39;analyser les événements dynamiques de transport dirigée et la propagation intercellulaire. Ici, nous présentons des méthodes qui utilisent des souches virales recombinantes exprimant des protéines de fusion fluorescentes pour faciliter la visualisation des assemblages virale lors d&#39;une infection de neurones primaires.

Imagerie de cellules vivantes de Alphaherpes Virus Transport antérograde et la propagation

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K vues.  Montana State University. Imagerie des cellules vivantes d'infections virales alphaherpes permet d'analyser les événements dynamiques de transport dirigée et la propagation intercellulaire. Ici, nous présentons des méthodes qui utilisent des souches virales recombinantes exprimant des protéines de fusion fluorescentes pour faciliter la visualisation des assemblages virale lors d'une infection de neurones primaires.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;utilisation d&#39;un piège optique pour l&#39;étude des interactions hôtes pathogènes pour l&#39;imagerie cellulaire dynamique en direct

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Recherche

Immunologie et infection

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imagerie de cellules vivantes de la<emBacillus subtilis> Et Streptococcus pneumoniae À l&#39;aide automatisée de microscopie time-lapse

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

En temps réel l&#39;imagerie en direct de T-signalisation cellulaire Formation Complex

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Imagerie cellulaire Interaction dans la muqueuse trachéale au cours de l’infection par le Virus grippal à l’aide de la microscopie intravitale biphotonique

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, studying IAV requires the use of laborious secondary approaches to detect the presence of the virus in infected cells and/or in animal models of infection. This limitation has been recently circumvented with the generation of recombinant IAVs expressing easily traceable fluorescent or bioluminescent (luciferase) reporter proteins. However, researchers have been forced to select fluorescent or luciferase reporter genes due to the restricted capacity of the IAV genome for including foreign sequences. To overcome this limitation, we have generated a recombinant replication-competent bi-reporter IAV (BIRFLU) stably expressing both a fluorescent and a luciferase reporter gene to easily track IAV infections in vitro and in vivo. To this end, the viral non-structural (NS) and hemagglutinin (HA) viral segments of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) were modified to encode the fluorescent Venus and the bioluminescent Nanoluc luciferase proteins, respectively. Here, we describe the use of BIRFLU in a mouse model of IAV infection and the detection of both reporter genes using an in vivo imaging system. Notably, we have observed a good correlation between the expressions of both reporters and viral replication. The combination of cutting-edge techniques in molecular biology, animal research and imaging technologies, provides researchers the unique opportunity to use this tool for influenza research, including the study of virus-host interactions and dynamics of viral infections. Importantly, the feasibility to genetically alter the viral genome to express two foreign genes from different viral segments opens up opportunities to use this approach for: (i) the development of novel IAV vaccines, (ii) the generation of recombinant IAVs that can be used as vaccine vectors for the treatment of other human pathogen infections.

Influenza A viruses (IAVs) are contagious respiratory pathogens that cause annual epidemics and occasional pandemics. Here, we describe a protocol to track viral infections in vivo using a novel recombinant luciferase and fluorescence-expressing bi-reporter IAV (BIRFLU). This approach provides researchers with an excellent tool to study IAV in vivo.

Un virus de la grippe Luciferase-fluorescent Reporter pour l'imagerie en direct et la quantification de l'infection virale

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung injury (ALI)/acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other respiratory pathologies in vivo is difficult due to the limited accessibility and inherent motion artifacts of the lungs. Nonetheless, various approaches have been developed to overcome these challenges. This protocol describes a method for intravital fluorescence microscopy to study real-time leukocyte-endothelial interactions in the pulmonary microcirculation in an experimental model of ALI. An in vivo lung imaging system and 3-D printed intravital microscopy platform are used to secure the anesthetized mouse and stabilize the lung while minimizing confounding lung injury. Following preparation, widefield fluorescence microscopy is used to study leukocyte adhesion, leukocyte rolling, and capillary function. While the protocol presented here focuses on imaging in an acute model of inflammatory lung disease, it may also be adapted to study other pathological and physiological processes in the lung.

Intravital fluorescence microscopy can be utilized to study leukocyte-endothelial interactions and capillary perfusion in real-time. This protocol describes methods to image and quantify these parameters in the pulmonary microcirculation using a vacuum-stabilized lung imaging system.

Microscopie à fluorescence intravitale à grand champ de la microcirculation pulmonaire dans une lésion pulmonaire aiguë expérimentale à l’aide d’un système d’imagerie stabilisé sous vide

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Imagerie en temps réel de la régénération de la glande sous-mandibulaire de la souris

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

Pleins feux sur l’auteur : Étude des interactions macrophage-cellules épithéliales dans la régénération des glandes salivaires après une blessure 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Interrogation des interactions cellule-cellule dans la glande salivaire par imagerie ex vivo de cellules vivantes

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...