Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans l’étude des interactions hôte-pathogène en permettant l’examen de l’expression du codage, du non-codage et de l’ARN viral impliquée dans la réponse des acides aminés hôtes ainsi que de la façon dont un agent pathogène peut affecter les fonctions biologiques de l’hôte. Le principal avantage de cette technique est qu’elle présente un protocole optimisé pour le traitement de l’ARNm et de l’ARN non codant provenant de bibliothèques RNAseq réduites en globine à partir d’un seul échantillon de sang entier. La technique sera démontrée par Sarah Anderson, technicienne de mon laboratoire.
Commencez par centrifuger les tubes sanguins à 50 20 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. En travaillant dans un cabinet de sécurité biologique, après avoir enlevé le supernatant, ajouter huit millilitres d’eau sans RNase à la pastille. Fermer les tubes et vortex la pastille jusqu’à ce qu’elle soit visiblement dissoute, puis centrifuger les tubes à 50 20 fois G pendant 10 minutes à température ambiante pour récupérer la pastille.
En travaillant dans un cabinet de sécurité biologique, jetez le supernatant et économisez la pastille. Pour isoler l’ARN total, commencez par achemier 300 microlitres de tampon liant la lyse à la pastille. Après vortex, transférer le mélange de chaque tube dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre étiqueté.
Ajouter 30 microlitres d’additif homogénétique du kit d’isolation miRNA. Vortex les tubes et placer sur la glace pendant 10 minutes. En travaillant dans un capot de fumée, retirer les tubes de la glace et ajouter 300 microlitres du réaccente chloroforme de phénol acide du kit et vortex à nouveau pour mélanger.
Après avoir centrifugé à 10 000 fois G pendant cinq minutes à température ambiante, retirer soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube. Selon la quantité de récupération aqueuse par rapport à l’étape précédente, ajouter 1,25 fois le volume de 100% d’éthanol au phage aqueux dans chaque tube et pipette à mélanger. Préparer des tubes de collecte frais contenant une cartouche de filtre pour chaque échantillon.
Pipette environ 675 microlitres du mélange lysate-éthanol sur la cartouche de filtre. Centrifugeuse brièvement à 10 000 fois G pour passer le liquide à travers le filtre. Jetez le flux à travers.
Répétez le mélange lysate-éthanol en ajoutant au filtre et à la centrifugation jusqu’à ce qu’il ait été complètement utilisé. Ajouter 700 microlitres de solution de lavage un du kit à la cartouche de filtre. Centrifugeuse brièvement pour tirer la solution à travers les filtres.
Jetez le flow-through et gardez les mêmes cartouches de filtre et tubes de collecte. Ajouter 500 microlitres de solution de lavage deux-trois à chaque cartouche de filtre. Après avoir centrifugé à nouveau, jeter le flow-through et répéter l’étape de lavage.
Pour éliminer tout liquide résiduel des cartouches de filtre, faites-les tourner 60 secondes de plus. Transférer les cartouches dans des tubes de collecte frais. Ajouter 100 microlitres d’eau préchauffée sans nucléase de 95 degrés Celsius au centre de chaque cartouche de filtre.
Centrifuger les cartouches pendant environ 20 à 30 secondes à la centrifugeuse de table à vitesse maximale. Pour préformer l’hybridation avec les oligos de réduction de la globine, d’abord dénoler l’ARN en ajoutant chaque échantillon extrait dans un tube de réaction sans nucléase à paroi mince de 0,2 milliliter. Placez les tubes dans un cycleur thermique à 70 degrés Celsius pendant deux minutes.
Après cela, placez immédiatement les tubes sur la glace pour obtenir une qualité optimale d’ARN. Pendant que les tubes refroidissent, préparez 400 microlitres de mélange oligo de réduction de globine de 10X et tampon d’hybridation d’oligo de 10X dans un tube de deux millilitres. Pour faire le mélange d’hybridation, ajoutez six microgrammes d’échantillon d’ARN, deux microlitres du mélange oligo de réduction de globine de 10X, un microlitre de tampon d’hybridation d’oligo de 10X, et l’eau libre de nucléase à un volume final de 10 microlitres à chaque tube de réaction mince-muré de 0,2 milliliter.
Placez les tubes dans le cycleur thermique à 70 degrés Celsius pendant deux minutes. Après cela, placez immédiatement les tubes sur la glace. Pour effectuer la digestion RNase H, diluer d’abord 10X RNase H à un X RNase H avec un tampon X RNase H.
Préparez le mélange de réaction RNase H en combinant deux microlitres de tampon 10X RNase, un microlitre d’inhibiteur de la RNase et deux microlitres d’un X RNase H, et cinq microlitres d’eau sans nucléase pour un volume total de 10 microlitres. Ajouter 10 microlitres du mélange de réaction RNase H aux échantillons d’hybridation de réduction de la globine et bien mélanger. Digérer cette réaction à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis refroidir à quatre degrés Celsius.
Arrêtez la digestion en ajoutant un microlitre de 0,5 molaire EDTA au tube, et transférez toute la teneur du tube dans un tube frais de 1,5 millilitre. Immédiatement après cela, ajouter 80 microlitres d’eau sans RNase, 350 microlitres de tampon de lyse, puis 250 microlitres de 100% d’éthanol à chaque tube et bien mélanger par pipetting. Transférez chaque échantillon de 700 microlitres dans une cartouche de filtre d’éution distincte placée dans un tube de collecte de deux millilitres pour recueillir le débit.
Centrifugeuse pendant 15 secondes à 8000 fois G ou plus, puis jeter le flux à travers. Placez les mêmes cartouches de filtre d’éution dans de nouveaux tubes de collecte de deux millilitres. Pour laver les membranes des cartouches de filtre, ajouter 500 microlitres du tampon de lavage doux aux cartouches de filtre et à la centrifugeuse pendant 15 secondes à 8 000 fois G ou plus.
Jetez le flux à travers. Ensuite, à l’aide des mêmes tubes de collecte, ajouter 500 microlitres de 80% d’éthanol aux cartouches de filtre. Centrifugeuse pendant deux minutes à 8000 fois G et plus.
Jetez à la fois les tubes d’écoulement et de collecte, et enregistrez les colonnes de spin d’éution. Placez chaque colonne de spin d’éution dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres. Centrifugeuse à pleine vitesse pendant cinq minutes avec le couvercle ouvert sur les cartouches de filtre pour sécher les membranes de la colonne de spin et empêcher le report de l’éthanol.
Après avoir jeté les tubes de collecte, placez chaque cartouche de filtre séchée dans un tube de collecte frais de 1,5 millilitre. Ajouter 14 microlitres d’eau sans RNase directement au centre de la membrane de la cartouche de filtre. Pour élucider l’ARN, centrifugez les tubes pendant 60 secondes à pleine vitesse, puis continuez avec une évaluation et une préparation plus poussées de l’ARN.
L’échantillon appauvri en globine peut maintenant être fractionné et utilisé pour préparer les petites bibliothèques d’ARN non codantes ainsi que l’ARNm appauvri en ribos et les bibliothèques d’ARN longues et non codantes. Après avoir préparé des bibliothèques d’expression des échantillons de sang entier appauvris en globine et ribo-épuisés utilisant ce protocole, le résumé d’exécution de fichier d’électrophoresis a montré un échantillon de bibliothèque globine-épuisé avec des nombres d’intégrité d’ARN qui allaient de 6.3 à 9.2. Cela s’est avéré être une amélioration par rapport à d’autres études qui ont utilisé des méthodes d’épuisement de la globine et n’ont été en mesure d’atteindre les chiffres rin à ou près de six.
La réduction de la préglobine et la réduction post-globine d’un seul échantillon de sang entier porcin ont montré que les concentrations de 260 à 280 nanomètres sont à ou au-dessus de deux. À l’aide de ce protocole, on a obtenu des électrophéogrammes à base de copeaux d’échantillons de bibliothèque d’ARNm de sang entier appauvris à base de globine et de ribo avant la mise en commun et le séquençage. Pour les bibliothèques d’ARNm, l’électrophétogramme représentatif a un pic à environ 280 paires de base.
Pour les petits anrnas, les électrophétogrammes représentatifs à base de puces contiennent une gamme de pics d’environ 100 à 400 paires de base. Les pics à environ 143 paires de base correspondent aux miARN, et les pics à environ 153 paires de base correspondent aux PIARN. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de tubes de glace immédiatement où noté.
À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage de prochaine génération devraient être effectuées afin de répondre à d’autres questions telles que l’expression différentielle, les changements épigénétiques et leur effet sur les voies et les processus biologiques. N’oubliez pas que travailler avec un réaccente phénol-chloroforme est extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail dans un capot de fumée doivent être prises. En outre, lors de la manipulation du sang entier ou des organismes infectieux, le travail doit être effectué dans un cabinet de sécurité biologique avant une activation de l’organisme infectieux.
