Cette étude a été soutenue par IRSCC # 700537 Grant et subvention des IRSC # 84535 à la LDJ et le NIH / NCI octroi # CA120711-01A1-01A1 et CA120711 à AZ. Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les règlements et les directives de l&#39;Institutional Animal Care et utilisation comité à l&#39;Université de Californie à San Diego, soins des animaux et l&#39;utilisation à l&#39;Université de Western Ontario.

1. L&#39;inoculation de la tumeur dans le CAM d&#39;embryon aviaire <ol><li> Préparer sans coquille des embryons de poulet fécondés comme décrit 8. </li><li> Le 9 ème jour de développement embryonnaire, assembler un micro-injecteur à l&#39;aide d&#39;une aiguille de calibre 18 connectés sur seringue de 1 mL. Coupez un morceau de tuyau 5-6 pouces Tygon (1 / 32 &quot;de diamètre, 3 / 32&quot; de diamètre extérieur, 1 / 32 &quot;épaisseur de paroi) et insérer délicatement l&#39;aiguille de biseau de dans le tube. Environ 4-5 cm de tubulure doit s&#39;étendent de la pointe de l&#39;aiguille (figure 1a). </li><li> Remplir la seringue et le tube avec la suspension cellulaire. Ensuite, insérer une aiguille de verre micro-injection à l&#39;extrémité du tube et enlever soigneusement les bulles d&#39;air. </li><li> Injecter Jour 9 embryons (figure 1b) sous un champ de dissection d&#39;un illuminateur d&#39;10,000-100,000 cellules cancéreuses en bolus dans le CAM (figure 1c). Lentement injecter des cellules et soigneusement s&#39;assurer que l&#39;aiguille est dans le bon endroit pour les cellules de former un bol visibles au sein de la CAM. Les cellules qui dégoutte sur la surface de came peuvent être nettoyés en utilisant l&#39;applicateur Kimwipe ou autres. </li><li> Retour aux embryons incubateur humidifié à 38 ° C avec une humidité de 60% et permettre la tumeur de croître et vasculariser (jusqu&#39;à 7 jours). </li></ol> 2. Préparation de nanoparticules <ol><li> Pour préparer marqué par fluorescence des nanoparticules CPMV pour l&#39;injection dans l&#39;embryon de poulet; diluer les nanoparticules virales (synthétisé comme en 8 dans du PBS, pH 7,4, à une concentration du mélange Vortex 100 pg / ml avant de l&#39;utiliser et centrifuger pendant une minute pour enlever tout. agrégats. sonication peut également être utile en fonction de conjugués et le degré d&#39;agrégation. Stocks de CPMVs marqué par fluorescence sont stables pendant au moins 1 an s&#39;il est conservé à 4 ° C dans l&#39;obscurité. Vérifiez périodiquement stocks en mettant quelques gouttes sur une lame de verre et la vérification pour la fluorescence. Transmission Electron Microscopy (TEM) peuvent également être utilisés pour déterminer si les particules restées intactes après conjugaison. </li><li> En bref, un microgramme de nanoparticules virales (dans un volume final de 2 pl) peuvent être ajoutés à des grilles de cuivre enrobées. Ensuite, ajoutez un volume égal d&#39;acétate d&#39;uranyle 2% pendant 1 minute à microscope électronique (Philips EM 410). </li></ol> 3. L&#39;injection intraveineuse d&#39;marqués à la fluorescence des nanoparticules virales <ol><li> Le Jour 16, assembler des micro-injecteur tel que décrit ci-dessus. Aspirer le volume désiré de nanoparticules virale à travers le tube dans la seringue (&gt; 200 uL). Retirez délicatement les bulles d&#39;air. Insérez l&#39;aiguille de verre micro-injection à l&#39;extrémité du tube. Assurez-vous que l&#39;aiguille est plus longue et effilée que possible (figure 2a). Si l&#39;aiguille est trop brutal, il ne sera pas en mesure de percer l&#39;ectoderme et ne parviendra pas à pénétrer dans le bateau. Si l&#39;aiguille est trop forte, la pointe va s&#39;effondrer lors de la pénétration tissulaire. </li><li> Intraveineuse injecter 100 ml de dextran 1 mg / ml de fluorescéine (MW 70000 Da, Invitrogen) en portant une tumeur embryonnaire distale du site désiré pour être visualisées (figure 3d). Canulation veineuse réussie de CAM est évident par la compensation de sang dans le chemin du débit d&#39;injection (Figure 2b). Évaluer vasculaires fuites 1 heure après l&#39;injection. </li><li> Par voie intraveineuse d&#39;injecter 50 ul de 1 mg / ml, solution de CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) ou pégylé CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) dans des embryons contenant les tumeurs avec fuite vasculaire distale du site désiré être visualisées. </li><li> Tumeurs Image immédiatement et toutes les heures après l&#39;injection en utilisant un Zeiss examinateur Z1 microscope droit équipé d&#39;un disque Yokogawa filature, Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD. </li></ol> 4. En temps réel d&#39;imagerie intravitale <ol><li> Pour assembler l&#39;unité d&#39;imagerie embryon, appliquer une mince couche de graisse à vide autour de la circonférence du port d&#39;imagerie sur le dessous du couvercle de l&#39;unité d&#39;imagerie embryon, et en forme une lamelle de verre de 18 mm sur le port. </li><li> Position de l&#39;embryon de telle sorte que la lamelle couvre la zone souhaitée pour l&#39;imagerie. Abaissez lentement le couvercle jusqu&#39;à ce que la lamelle est tout simplement le contact avec l&#39;embryon, puis vissez le couvercle sur l&#39;appareil pour le maintenir en place (figure 2c). </li><li> Ajouter de l&#39;eau chauffée à 37 ° C dans l&#39;unité d&#39;imagerie embryon en dehors du plat contenant l&#39;embryon, puis placez l&#39;unité entière sur la scène d&#39;un microscope confocal à droite avec la chambre de l&#39;intérieur de l&#39;environnement équilibré à 37 ° C. </li><li> Positionnez l&#39;unité d&#39;imagerie contenant l&#39;embryon au microscope à fluorescence confocale à disque rotatif (figure 2e). L&#39;unité d&#39;imagerie tiendra l&#39;embryon en place et tenir le champ de vision tout en capturant des images fixes, permettant à la fois des piles Z en trois dimensions et time-lapse de capturer des images. Nous acquérir et d&#39;analyser en trois dimensions time-lapse images à l&#39;aide de Perkin Elmer (anciennement Improvisation) logiciel Volocity (figure 3a). Acquérir une haute résolution en trois dimensions pile de la tumeur et les vaisseaux environnants pour visualiser detaileanalyses d structurelles spécifiques au temps des points. Acquérir en trois dimensions des piles à intervalles réguliers de temps aux points de carte détaillée des changements structurels dans la vascularisation tumorale. Tumeurs image toutes les heures après l&#39;injection. </li><li> Quantifier l&#39;absorption des nanoparticules virales en calculant la moyenne Alexa Fluor (AF) 647 du signal dans des régions sélectionnées dans la tumeur ou dans le stroma (non tumoral région) en utilisant le logiciel d&#39;image telles que la quantification Volocity (Perkin Elmer). La tumeur du stroma ratio a été calculé en divisant la moyenne AF 647 du signal dans la tumeur sur la moyenne du signal AF 647 dans le stroma. Un ratio tumeur / stroma supérieur à 1 indique que la nanoparticule est repris par la tumeur. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Dans l&#39;exemple décrit ici, nous avons injecté des cellules HT-29 du cancer du colon pour former un bolus d&#39;environ 1mm dans la taille au sein de la CAM d&#39;embryons de poulet jour 9 (figure 1b). Après inoculation, les embryons ont été cultivés pendant 7 jours dans un incubateur humidifié pour permettre la croissance tumorale et la vascularisation suffisante (figure 1c). Les embryons ont été injectés par voie intraveineuse avec un faible poids moléculaire du dextrane de confirmer la vascularisation tumorale, et les tumeurs ont été visualisées au microscope Zeiss Z1 AxioExaminer verticale (figure 2d). Après administration intraveineuse de CPMV-AF 647 ou CPMV-PEG-AF 647 nanoparticules (figure 3a et b), à haute résolution en temps réel l&#39;imagerie confocale (figure 2e) a révélé que les deux CPMV et CPMV-PEG nanoparticules rapidement étiquetés la vascularisation entier, mais l&#39;absorption de CPMV-PEG par la tumeur était d&#39;environ 3 fois plus élevé que CPMV après 12 heures (figure 3a). La captation tumorale relative de nanoparticules a été déterminé en utilisant le logiciel d&#39;analyse d&#39;image (Volocity de Perkin Elmer). Régions d&#39;intérêt ont été choisis au sein et en dehors de la tumeur (dans le compartiment stromal) et l&#39;intensité moyenne de fluorescence de chacun a été déterminé. Les données sont exprimées en tumeur / stroma ratio. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Microinjection de tumeurs dans la CAM d&#39;un embryon aviaire. (A) L&#39;appareil est assemblé à partir de micro-injection des composants comme indiqué. (B) des embryons aviaire au jour 9 sont prêts à être inoculés avec la tumeur lors de la CAM s&#39;est propagé à couvrir toute la surface. (C) Au jour 16, la tumeur aura atteint jusqu&#39;à 1 cm de diamètre (ligne pointillée) et est prête pour l&#39;injection des nanoparticules. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Injection de nanoparticules et de l&#39;imagerie intravitale. Injection sous un microscope de dissection montrant (a) la pointe de l&#39;aiguille microinjecteur prêt à être injecté dans la veine CAM et (b) l&#39;aiguille microinjecteur inséré dans la veine (indiqué par la flèche) et de nanoparticules injectées dans la circulation sanguine (vu par compensation de sang). (C) l&#39;unité d&#39;imagerie contenant embryon aviaire avec la lamelle interfacé directement avec la CAM. (D) Avant l&#39;injection de nanoparticules, la vascularisation tumorale est évaluée en utilisant l&#39;imagerie intravitale après l&#39;injection de fluorescéine dextrane. (E) l&#39;unité d&#39;imagerie contenant l&#39;embryon placé sur la platine d&#39;un microscope confocal à droite au sein d&#39;une régulation de température mis enceinte à 37 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Visualisation de l&#39;absorption des nanoparticules intravitale dans les tumeurs humaines. Les tumeurs sont visualisées 7 heures après l&#39;injection de (a) CPMV-AF647 et (b) CPMV-PEG-AF647. d) L&#39;excision de la tumeur de l&#39;embryon aviaire pour une analyse ultérieure.

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La membrane chorio (CAM) de l&#39;embryon aviaire est un modèle utile pour évaluer la dynamique vasculaire et la pharmacocinétique de tumeurs humaines. La structure et la position de la came permet l&#39;acquisition de haute qualité d&#39;image et accueille de nombreux types de xénogreffes de cancer invasif, sans intervention chirurgicale. Par ailleurs, les xénogreffes de tumeurs cancéreuses implantées dans la membrane chorio devenu vascularisé dans les 7 jours, offrant un moyen rapide, peu coûteuse et semi-haut-débit pour évaluer l&#39;accumulation de nanoparticules dans le tissu tumoral. Depuis xénogreffes de cancer implanté dans la CAM d&#39;embryons de poulet sans coquille sont accessibles à l&#39;optique à haute résolution d&#39;un microscope confocal à épifluorescence ou debout, l&#39;information contextuelle et temporelle sur la fixation des nanoparticules dans la vascularisation tumorale peut être facilement obtenu. Xénogreffes de cancer dans ce modèle ont tendance à croître latéralement à travers la CAM, résultant dans des tumeurs qui sont grandes, tout en restant inférieure à 200 m de profondeur. Cela les rend particulièrement bien adapté pour l&#39;imagerie intravitale parce norme microscopes à épifluorescence peut pénétrer efficacement la masse tumorale entier. En revanche, les tumeurs implantées dans des sites soit superficielle ou orthotopique dans la souris prolifèrent en trois dimensions, il est difficile de localiser précisément des nanoparticules profonde au sein de ces tumeurs par des techniques non invasives. Nous avons utilisé ce modèle pour évaluer l&#39;absorption des quantum dots, des liposomes, des nanoparticules d&#39;oxyde de fer et dans un certain nombre de xénogreffes tumorales humaines, soulignant le potentiel de ce modèle soit adapté à l&#39;analyse in vivo d&#39;une large gamme de formulations de nanoparticules.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom Réactif / Equipement </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Oeufs fécondés Leghorn </td><td> Écloserie Frey `s, St. Jacobs </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Outil rotatif Dremel </td><td> Dremel </td><td></td><td> Peut utiliser n&#39;importe quel modèle </td></tr><tr><td> Roues de coupure Dremel pas. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman Hatcher </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman incubateur </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Éthanol </td><td></td><td></td><td> 70% (vol / vol) </td></tr><tr><td> Polystyrène pèsent bateaux </td><td> VWR </td><td> 12577-01 </td><td></td></tr><tr><td> Place des boîtes de Pétri </td><td> Simport, VWR </td><td> 25378-115 </td><td></td></tr><tr><td> Rubbermaid caoutchouc contenant avec couvercle </td><td> Guillevin </td><td> RH3-228-00-BLU </td><td> des trous percés dans les côtés </td></tr><tr><td> Verticale pipette extracteur </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modèle 720 </td><td> Réglages: 16,3 (chauffage) et 2.3 (solénoïde) </td></tr><tr><td> Tubes en verre de borosilicate de sodium capillaires </td><td> Instrument Sutter </td><td> BF100-58-10 </td><td> (OD, 1,0 mm; 0,58 mm ID; 10 cm longueur) </td></tr><tr><td> 1X Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS-D) (1X), liquide </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> La trypsine, 0,05% (1X) avec de l&#39;EDTA 4NA, liquide </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Invitrogen </td><td> 12483-020 </td><td> Chauffer inactiver </td></tr><tr><td> Hématimètre </td><td> Hausser scientifique, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse </td><td> Eppendorf modèle 5810R </td><td> 5811 000.010 </td><td></td></tr><tr><td> Beaux-point forceps </td><td> VWR </td><td> 25607-856 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon R-3603 tube </td><td> VWR </td><td> 63009-983 </td><td> 50 pi (1/32-inch diamètre intérieur, 3/32-inch diamètre extérieur, épaisseur de la paroi 1/32-inch </td></tr><tr><td> Aiguilles hypodermiques pour des injections de 18 aiguilles de calibre </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td> Boîte de 100 </td></tr><tr><td> Seringues de 1 ml pour les injections </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> Boîte de 100 </td></tr><tr><td> Illuminateur de microscope à fibre optique </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> VWR </td><td> 10805-905 </td><td></td></tr><tr><td> Graines de V. unguiculata (Californie noir oeil non. 5) </td><td> Burpee </td><td> 51771A </td><td></td></tr><tr><td> Les lumières de croissance intérieure </td><td> Sunlite, alimentation du jardinier </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Méthyl-PEO4-ester de NHS </td><td> Pierce </td><td> PI22341 </td><td></td></tr><tr><td> mPEG-NHS, le PEG succinimidyl ester, MW 2000 </td><td> NANOCS </td><td> PEG1-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 carboxylique (succinimidyl ester) </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 ester succinimidyle * 6-isomère * </td><td> Invitrogen </td><td> O-6149 </td><td></td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Dibasique monohydrogénophosphate </td><td> Sigma </td><td> 379980 </td><td> K2HPO4 (pour le tampon phopshate) </td></tr><tr><td> Monobasique dihydrogénophosphate </td><td></td><td> P5655 </td><td> KH2PO4 (pour le tampon phopshate) </td></tr><tr><td> Superose 6 colonnes d&#39;exclusion de taille </td><td> GE Healthcare Life Sciences </td><td> 17-0673-01 </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA Explorer 100 Chromatographe </td><td> GE Amersham Pharmacia </td><td> WS-AKTA100 </td><td></td></tr><tr><td> Kit ÄKTA haut débit </td><td> GE Healthcare Life Sciences </td><td> 18-1154-85 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuger </td&gt; <td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SW 28 Ti rotor </td><td> Beckman </td><td> 342204 </td><td> Seau de swing </td></tr><tr><td> 50.2 Ti rotor </td><td> Beckman </td><td> 337901 </td><td> Angle fixe </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 unités de filtration centrifuge </td><td> Millipore </td><td> UFC910008 </td><td> 100 kDa coupé </td></tr><tr><td> Dégradé anciens </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> dextrane, la fluorescéine, 70.000 MW, anioniques </td><td> Invitrogen </td><td> D1823 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning microscope à fluorescence confocale disque </td><td> Quorum; Yokogawa CSU 10, Yokogawa </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Épifluorescence à champ large de microscope </td><td> Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD </td><td> Quorum; Hamamatsu </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Unité de boîtier Température pour microscope </td><td> Precision Plastics </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Graisse à vide </td><td> VWR </td><td> 59344-055 </td><td></td></tr><tr><td> De verre circulaire lamelles pas. 1 (18 mm) </td><td> VWR </td><td> 16004-300 </td><td></td></tr><tr><td> Logiciels Volocity </td><td> Perkin Elmer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Boîtier d&#39;embryon de poulet </td><td></td><td> fabriqués sur mesure </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux délicats </td><td> VWR </td><td> 25608-203 </td><td></td></tr><tr><td> Formol </td><td> Bioshop </td><td> FOR201.500 </td><td> Utilisation dans hotte </td></tr><tr><td> Coupe optimale </td><td> Fisher; Tissue Tek </td><td> 1437365 </td><td></td></tr><tr><td> Température (PTOM) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Moules plastiques </td><td> Fisher </td><td> 22-038217 </td><td></td></tr><tr><td> VWR VistaVision HistoBond adhésif Diapositives </td><td> VWR </td><td> 16004-406 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongez l&#39;or avec du DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Lames jetables pour cryostat </td><td> Fisher </td><td> 12-634-2 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Leica CM 3050 S </td><td> 14047033518 </td><td></td></tr></table>

evaluation of nanoparticle uptake in tumors in real time using intravital imaging

Les technologies actuelles d&#39;imagerie des tumeurs, comme l&#39;échographie, IRM, PET et CT, sont incapables de donner des images haute résolution pour l&#39;évaluation de l&#39;absorption des nanoparticules dans les tumeurs au niveau microscopique 1,2,3, soulignant l&#39;utilité d&#39;un modèle de xénogreffe adaptée dans lequel pour effectuer des analyses détaillées absorption. Ici, nous utilisons l&#39;imagerie haute résolution intravitale pour évaluer l&#39;absorption des nanoparticules dans les xénogreffes de tumeurs humaines dans une modification, le modèle d&#39;embryon de poulet sans coquille. Le modèle d&#39;embryons de poulet est particulièrement bien adaptée pour ces analyses in vivo, car elle soutient la croissance de tumeurs humaines, est relativement peu coûteux et ne nécessite pas une anesthésie ou une chirurgie 4,5. Les cellules tumorales forment totalement xénogreffes vascularisé dans les 7 jours lorsqu&#39;ils sont implantés dans la membrane chorio (CAM) 6. Les tumeurs qui en résultent sont visualisés par imagerie non invasive en temps réel, haute résolution qui peut être maintenue jusqu&#39;à 72 heures avec peu d&#39;impact sur l&#39;hôte ou des systèmes de tumeur. Les nanoparticules avec une large gamme de tailles et de formulations administrées à la tumeur distale peuvent être visualisées et quantifiées comme ils par la circulation sanguine, de la vascularisation tumorale s&#39;extravaser qui fuient, et s&#39;accumulent dans le site tumoral. Nous décrivons ici l&#39;analyse de nanoparticules dérivées de virus de la mosaïque du niébé (CPMV) décoré avec le proche infrarouge colorants fluorescents et / ou polymères de polyéthylène glycol (PEG) 7, 8, 9,10,11. Après administration par voie intraveineuse, ces nanoparticules virales sont rapidement internalisées par les cellules endothéliales, entraînant l&#39;étiquetage global de la vascularisation à l&#39;extérieur et au sein de l&#39;7,12 tumeur. PEGylation des nanoparticules virale augmente leur demi-vie plasmatique, s&#39;étend de leur temps dans la circulation, et accroît leur accumulation dans les tumeurs via la perméabilité accrue et la rétention (EPR) Effet 7, 10,11. Le taux et l&#39;étendue de l&#39;accumulation de nanoparticules dans une tumeur est mesurée au cours du temps en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image. Cette technique fournit une méthode à la fois visualiser et de quantifier la dynamique des nanoparticules dans les tumeurs humaines.

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Nous présentons une nouvelle approche pour quantifier la localisation des nanoparticules dans le système vasculaire des tumeurs humaines xénogreffées aide dynamique, imagerie en temps réel intravitale dans un modèle d&#39;embryon aviaire.

Evaluation de la fixation des nanoparticules dans les tumeurs en temps réel par imagerie intravitale

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

evaluation-nanoparticle-uptake-tumors-real-time-using-intravital

Research

JoVE Journal

Medicine

18.1K vues.  University of Western Ontario. Nous présentons une nouvelle approche pour quantifier la localisation des nanoparticules dans le système vasculaire des tumeurs humaines xénogreffées aide dynamique, imagerie en temps réel intravitale dans un modèle d'embryon aviaire.

Vidéo: Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical excision of the tumor with a full lymphadenectomy in the drainage area of the tumor. However, removal of lymph nodes is associated with increased morbidity due to infection, wound breakdown and lymphedema.4,5 As an alternative, the sentinel lymph node procedure (SLN) was developed several decades ago to detect the first draining lymph node from the tumor.6 In case of lymphogenic dissemination, the SLN is the first lymph node that is affected (Figure 1). Hence, if the SLN does not contain metastases, downstream lymph nodes will also be free from tumor metastases and need not to be removed. The SLN procedure is part of the treatment for many tumor types, like breast cancer and melanoma, but also for cancer of the vulva and cervix.7 The current standard methodology for SLN-detection is by peritumoral injection of radiocolloid one day prior to surgery, and a colored dye intraoperatively. Disadvantages of the procedure in cervical and vulvar cancer are multiple injections in the genital area, leading to increased psychological distress for the patient, and the use of radioactive colloid.
Multispectral fluorescence imaging is an emerging imaging modality that can be applied intraoperatively without the need for injection of radiocolloid. For intraoperative fluorescence imaging, two components are needed: a fluorescent agent and a quantitative optical system for intraoperative imaging. As a fluorophore we have used indocyanine green (ICG). ICG has been used for many decades to assess cardiac function, cerebral perfusion and liver perfusion.8 It is an inert drug with a safe pharmaco-biological profile. When excited at around 750 nm, it emits light in the near-infrared spectrum around 800 nm. A custom-made multispectral fluorescence imaging camera system was used.9.
The aim of this video article is to demonstrate the detection of the SLN using intraoperative fluorescence imaging in patients with cervical and vulvar cancer. Fluorescence imaging is used in conjunction with the standard procedure, consisting of radiocolloid and a blue dye. In the future, intraoperative fluorescence imaging might replace the current method and is also easily transferable to other indications like breast cancer and melanoma.

Fluorescence imaging is a promising innovative modality for image-guided surgery in surgical oncology. In this video we describe the technical procedure for detection of the sentinel lymph node using fluorescence imaging as showcased in gynecologic oncologicy. A multispectral fluorescence camera system, together with the fluorescent agent indocyanine green, is applied.

Multispectrale en temps réel d&#39;imagerie par fluorescence pour la détection peropératoire du ganglion sentinelle en oncologie gynécologique

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

Recherche

Médecine

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Détection MicroRNA dans les tumeurs prostatiques par quantitative PCR en temps réel (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular patterns responsible for governing the movement performance. This motor learning can be enhanced through a number of methods that are utilized in research and clinical settings alike. In general, verbal feedback of performance in real-time or knowledge of results following movement is commonly used clinically as a preliminary means of instilling motor learning. Depending on patient preference and learning style, visual feedback (e.g. through use of a mirror or different types of video) or proprioceptive guidance utilizing therapist touch, are used to supplement verbal instructions from the therapist. Indeed, a combination of these forms of feedback is commonplace in the clinical setting to facilitate motor learning and optimize outcomes.
Laboratory-based, quantitative motion analysis has been a mainstay in research settings to provide accurate and objective analysis of a variety of movements in healthy and injured populations. While the actual mechanisms of capturing the movements may differ, all current motion analysis systems rely on the ability to track the movement of body segments and joints and to use established equations of motion to quantify key movement patterns. Due to limitations in acquisition and processing speed, analysis and description of the movements has traditionally occurred offline after completion of a given testing session.
This paper will highlight a new supplement to standard motion analysis techniques that relies on the near instantaneous assessment and quantification of movement patterns and the display of specific movement characteristics to the patient during a movement analysis session. As a result, this novel technique can provide a new method of feedback delivery that has advantages over currently used feedback methods.

Retraining abnormal movement patterns following injury or disease is a key component of physical rehabilitation. Recent advances in technology have permitted accurate assessment of movement during a variety of tasks, with near instantaneous quantification of results. This provides new opportunities for modification of faulty movement patterns in real time.

Mouvement recyclage en utilisant rétroaction en temps réel de la performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo L&#39;imagerie optique de tumeurs cérébrales et l&#39;arthrite Utilisation fluorescent SAPC-DOPS nanovésicules

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Induits par la chimiothérapie vasculaire Toxicité - en temps réel<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie de déficience navire

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting and sustaining this phenotype is critically important in normal alveolar growth and gas exchange throughout life. Several in vitro studies have characterized the role of key regulatory proteins, signaling molecules, and steroid hormones that can influence the rate of lung fluid clearance. However, in vivo examinations must be performed to evaluate whether these regulatory factors play important physiological roles in regulating perinatal lung liquid absorption. As such, the utilization of real time X-ray imaging to determine perinatal lung fluid clearance, or pulmonary edema, represents a technological advancement in the field. Herein, we explain and illustrate an approach to assess the rate of alveolar lung fluid clearance and alveolar flooding in C57BL/6 mice at post natal day 10 using X-ray imaging and analysis. Successful implementation of this protocol requires prior approval from institutional animal care and use committees (IACUC), an in vivo small animal X-ray imaging system, and compatible molecular imaging software.

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

En temps réel d&#39;imagerie à rayons X du poumon Volumes fluide dans néonatale Souris Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Analyse quantitative [18F]-Naf-PET-MRI pour l'évaluation du chiffre d'affaires dynamique d'os dans un patient présentant la douleur lombaire facetogenic

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still in need. In recent years, mass spectrometry has become a method of choice for untargeted profiling of discriminatory compound as potential biomarkers of a disease. Biofluids are generally considered as preferable matrices given their accessibility and easier sample processing while direct tissue profiling provides more selective information about a given cancer. Preparation of tissues for the analysis via traditional methods is much more complex and time-consuming, and, therefore, not suitable for fast on-site analysis. The current work presents a protocol combining sample preparation and extraction of small molecules on-site, immediately after tumor resection. The sampling device, which is of the size of an acupuncture needle, can be inserted directly into the tissue and then transported to the nearby laboratory for instrumental analysis. The results of metabolomics and lipidomics analyses demonstrate the capability of the approach for the establishment of phenotypes of tumors related to the histological origin of the tumor, malignancy, and genetic mutations, as well as for the selection of discriminating compounds or potential biomarkers. The non-destructive nature of the technique permits subsequent performance of routinely used tests e.g., histological tests, on the same samples used for SPME analysis, thus enabling attainment of more comprehensive information to support personalized diagnostics.

The manuscript presents on-site sampling of human brain tumors with solid phase microextraction followed by their biochemical profiling towards the discovery of biomarkers.

Échantillonnage et extraction sur place de tumeurs cérébrales pour l’analyse de la métabolomique et de la lipidomique

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...