Les auteurs remercient Neil Whitehouse (WPI, atelier d&#39;usinage Higgins) pour son aide dans l&#39;usinage CNC. En outre, nous tenons à remercier Adriana Héra (WPI informatique et des communications Centre) pour son aide à la programmation MATLAB, ainsi que Kate boissons et Joseph Cotnoir (WPI Academic Technology Center) pour l&#39;assistance avec Camtasia. Sophie Burke et Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) à condition séquences vidéo supplémentaires. Ce travail a été financé par le National Institutes of Health (R15 HL097332), l&#39;UMass Medical School-WPI initiative de recherche pilote, l&#39;American Heart Association (bourse de recherche de premier cycle à JZH), et Worcester Polytechnic Institute (bourse de recherche de premier cycle à l&#39;été JZH et institutionnels fonds de démarrage pour MWR).

1. Fabrication de moules cellulaire d&#39;ensemencement Commencez par fraisage d&#39;une 1 / 2 &quot;morceau épais de polycarbonate pour créer 15, à fond rond, puits annulaire avec un diamètre poteau central de 2 mm. Les canaux sont fraisées de 6 mm de profondeur et 3,75 mm de large. Nettoyez et séchez le moule polycarbonate enlever tous les débris de plastique du processus de broyage. Mélanger polydiméthylsiloxane (PDMS) à un ratio 10:1 (p / p) de la base d&#39;agent de durcissement, Degas à supprimer toutes les bulles d&#39;air, et versez sur le moule en polycarbonate. Degas à nouveau pour éliminer les bulles restent, et de guérir dans l&#39;étuve à 60 ° C pendant 4 heures. Une fois durci, retirez soigneusement le modèle PDMS par lentement éplucher loin du polycarbonate, laver avec du savon et de l&#39;eau, et autoclave. Aussi l&#39;autoclave une solution de deux pour cent (p / v) agarose dissous dans le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM). Placer le gabarit de PDMS sur une surface plane et remplissez avec fondue aga<html> augmenté en commençant par pipetage agarose dans chacun des moules après le centre, puis pipetage dans l&#39;espace autour d&#39;elle. Laisser l&#39;agarose à solidifier (environ 15 minutes), puis inverser le moule pour libérer l&#39;agarose par le PDMS. Couper l&#39;excès d&#39;agarose à travers chacun des puits, et la place des puits d&#39;agarose en plaques de 12 puits. 2. La culture cellulaire et l&#39;ensemencement anneau Ajouter culture cellulaire médias (DMEM avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine) autour de l&#39;extérieur du moule d&#39;agarose, sans couvrir le haut du moule. Placer les plaques dans l&#39;incubateur et leur permettre de s&#39;équilibrer pendant environ 15 minutes pendant que vous préparez les cellules. À 90% de confluence, les cellules de rats trypsiniser du muscle lisse aortique (FFRS) et remettre à une concentration de 5x10 6 cellules / ml. Pipeter 100 pi de suspension cellulaire dans chaque puits de l&#39;annulaire d&#39;agarose, en utilisant un mouvement circulaire à appliquer aux cellules de chaque puits. contenu »&gt; Assurez-vous que les étagères sont incubateur niveau, puis placer les plaques dans l&#39;incubateur et à leur permettre de s&#39;asseoir tranquille pendant 24 heures. média d&#39;échange tous les deux jours suivants, en aspirant les médias de partout dans le bien, et re-remplissage de chaque bien jusqu&#39;à la agarose est bien complètement submergé. 3. La récolte anneau de tissus et de mesures d&#39;épaisseur A l&#39;issue de la culture, retirer l&#39;anneau du moule d&#39;agarose en le faisant glisser sur le dessus de la poste centrale. Placez l&#39;anneau dans une petite boîte de Petri avec un tampon phosphate salin (PBS), centre de l&#39;échantillon, et d&#39;acquérir une image en utilisant un système d&#39;imagerie numérique. Utilisez un programme d&#39;analyse d&#39;image pour la détection de contours et de mesurer l&#39;épaisseur de l&#39;anneau en 4 positions (haut, bas, gauche et droite) autour de sa circonférence. Calculer la valeur de l&#39;épaisseur moyenne (t) pour chaque anneau individuel, et utiliser cette valeur pour calculer la surface de section transversale(2π (t / 2) 2). 4. Essais mécaniques des anneaux Mettre en place la machine de traction (Instron EPS 1000) dans la position horizontale. Fixer une cellule de charge ± 1N 1mn et personnalisés poignées mince fil de fer (créée par la flexion fil d&#39;acier inoxydable). Mont de l&#39;échantillon anneau sur les deux poignées de fil mince. Étendre les poignées jusqu&#39;à ce qu&#39;un 5 mN tare charge est appliquée à l&#39;échantillon. Entrez dans la zone transversale (calculé à partir des mesures d&#39;épaisseur) et d&#39;enregistrer la longueur du calibre. Pré-cycle de l&#39;anneaux 8 fois entre la charge de tare et 50 kPa de stress à un taux de 10 mm / min. Après le huitième cycle de pré-, tirer à l&#39;échec à 10 mm / min. L&#39;échec est noté comme une diminution de la force par 40% d&#39;une mesure à l&#39;autre. Pour chaque échantillon, anneau, de mesurer la contrainte de traction (UTS) et déformation à la rupture et de calculer le module tangent maximum (MTM) à partir des données acquises. 5. Anneau de tissu commesemblée pour fabriquer des tubes de tissu Porte-tubes personnalisés sont usinées à partir de 5 disques ronds en polycarbonate cm avec découpes rectangulaires (2 cm x 3 cm). Percez des trous filetés à travers ces disques pour permettre à deux détenteurs d&#39;être vissés ensemble. Autoclaver les porte-tubes personnalisés, puis transfert à l&#39;enceinte de sécurité biologique et les placer dans un plat de Petri vides. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper les extrémités des tubes de 1,9 mm de diamètre en silicone à un angle de créer des bords biseautés, puis l&#39;autoclave les tubes de silicone. Alors que les tubes sont autoclavés, remplir une boîte de Pétri avec les médias. Retirer les bagues dans les puits d&#39;agarose et les placer dans la boîte de Pétri avec les médias. Placer l&#39;autoclave tubes de silicone dans le même plat de Pétri pour les mouiller avant de l&#39;utiliser. Utilisez une pince pour placer une extrémité biseautée d&#39;un tube de silicone dans le centre d&#39;un anneau et faites glisser doucement l&#39;anneau sur le tube de silicone. Répéter avec le nombre souhaité de riNGS. Faites glisser les anneaux en contact avec eux par les poussant délicatement successivement dans les deux directions le long du tube. Cette méthode peut être utilisée pour les anneaux récoltés après une seule journée dans la culture. Une fois que les anneaux sont montés, d&#39;aligner les tubes de silicone dans les porteurs de polycarbonate et visser les deux parties du titulaire ensemble. Placez le support dans un plat de Pétri de 100 mm et ajouter 55 ml de milieu. Échange des médias tous les 3 jours pour la durée de la culture. Pour enlever les tubes des tissus, des tubes de silicone communiqué du détenteur de polycarbonate et de l&#39;utilisation des forceps pour faire glisser le tube de tissu hors du tube de silicone et dans une boîte de Petri remplie de PBS. 6. Les résultats représentatifs: Lorsque le protocole est réalisé correctement, les cellules s&#39;agrègent pour former des anneaux de tissu avec un diamètre intérieur égal au diamètre du moule correspondant au poste dans les 24 heures. Les bords anneau sont habituellement lisses en apparence et (si la cultured sur une surface plane), sont d&#39;épaisseur uniforme sur toute la circonférence. Les anneaux de tissu sont faciles à manipuler et peut être démis de leurs puits pour l&#39;analyse mécanique et histologiques ultérieures (voir en Gwyther et al., 2011 8). Morphologie anneau de tissus, composition de la matrice, et les propriétés mécaniques varient selon le nombre et le type de cellules ensemencées. Les résultats représentatifs à partir des anneaux de tissu fabriqué à partir divers types de cellules, l&#39;ensemencement des conditions, et la longueur de la culture sont présentés au tableau 1. Deux anneaux mm ID créé à partir de 5x10 5 FFRS présentaient une UTS supérieur anneaux créés à partir de notre publiés antérieurement 2 anneaux mm (fabriqués à partir de 5 6.6x10 FFRS). Similaire à 8 cellules de rat, cellules musculaires lisses humaines (HSMC) facilement agrégées pour former des tissus anneaux, qui contenait une grande quantité de collagène après seulement 14 jours de culture (données non présentées). Les cellules souches mésenchymateuses (hMSC) également regroupées et forment des anneaux cohérent, mais lala force mécanique et cked brisé pendant les phases initiales de test précyclage traction uniaxiale. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td> Le nombre de cellules </td><td> Epaisseur (mm) </td><td> Longueur de la culture (jours) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> Déformation à la rupture (mm / mm) </td></tr><tr><td> anneaux FFRS </td><td> 6 </td><td> 660000 </td><td> 0,94 ± 0,12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0,50 ± 0,08 </td></tr><tr><td> anneaux FFRS </td><td> 4 </td><td> 500000 </td><td> 0,53 ± 0,02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0,88 ± 0,05 </td></tr><tr><td> anneaux HSMC </td><td> 3 </td><td> 750000 </td><td> 0,51 ± 0,05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0,92 ± 0,08 </td></tr><tr><td> anneaux hMSC </td><td> 3 </td><td> 750000 </td><td> 0,40 ± 0,07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Tableau montrant les paramètres de la culture et des propriétés mécaniques de deux anneaux mm générées par différents types cellulaires, les concentrations de l&#39;ensemencement, la culture et des durées. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" /> Figure 1. (A) Schéma du processus de génération des tissus anneau. (B) personnalisé en polycarbonate moule avec fraisé puits annulaire. Diamètres de poste central sont de 2 mm. (C) modèle de PDMS après qu&#39;il a été décollé du moule en polycarbonate. (D) anneau de tissus cultivés agrégées dans un moule d&#39;agarose avec un poste de 2 mm. (E) mm Deux anneaux de tissu de diamètre dans du PBS. Barres d&#39;échelle = mm 6 mm (B, C) et 2 (D, E). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" /> Figure 2. Tracé représentatif de la courbe contrainte-déformation producteursced des essais de traction uniaxiale.

<ol>
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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Récemment, il ya eu un intérêt accru dans la cellule, ou «échafaudage moins&quot; méthodes de l&#39;ingénierie tissulaire pour répondre à certaines des limitations des approches basées sur échafaudage de l&#39;ingénierie tissulaire. Étant donné que les cellules dérivées des tissus sont créées à partir de cellules et la matrice qu&#39;ils produisent, ils contiennent des densités cellulaires intrinsèquement beaucoup plus élevé, ne contiennent pas de matériaux exogènes, et peut être faite entièrement à partir de cellules humaines et des protéines. Greffons vasculaires fabriqués à partir de cellules humaines peuvent atteindre une résistance mécanique importante en l&#39;absence d&#39;échafaudages exogènes (par exemple, la pression d&#39;éclatement 3400 mmHg par rapport à 1600 mmHg pour les veines saphènes humaines) 12. Bien que basé sur des cellules tissus vasculaires présentent densité cellulaire améliorée et la résistance mécanique, méthodes de fabrication les plus courants (comme &quot;feuille de base de l&#39;ingénierie&quot; 3,4,12 ou &quot;bioprinting« 5,13) nécessitent des périodes de culture extensive (&gt; 3 mois) ou des équipements spécialisés pour la construction du tissu 3D. L&#39;anneau de tissus dérivés de cellules méthodesod décrite ici permet rapidement cellulaires auto-assemblage pour former des constructions robustes tissus 3D dans un court laps de temps et sans l&#39;utilisation d&#39;équipement spécialisé. Ce protocole détaille la procédure que nous avons développé pour créer 2 mm rats diamètre intérieur des cellules musculaires lisses dérivées des anneaux de tissu. Dans le présent exemple, les anneaux de tissu ont été cultivées pendant 7 jours (ensuite cultivés pendant 7 jours supplémentaires pour la fusion anneau et la formation de tube). Cependant, 2 rats mm (et humain) en douceur anneaux cellules musculaires peuvent être retirés des puits et sont cohésives assez pour manipulation (par exemple, le transfert sur des tubes de silicone) dès le premier jour après l&#39;ensemencement des cellules. En outre, les anneaux de tissu robuste avec différents diamètres intérieurs (2, 4 et 6 mm) peuvent être créés avec cette méthode en changeant simplement le diamètre message du moule original en polycarbonate. 8 Nous avons aussi récemment modifié la conception du moule en polycarbonate pour permettre à cinq 2 puits d&#39;ensemencement mm et d&#39;être jeté dans une chambre unique multi-puits d&#39;agarose, quiutilise moins de PDMS et d&#39;agarose, et s&#39;inscrit dans un puits d&#39;une plaque à 6 puits (données non présentées). Les changements dans le diamètre de poste, la largeur de l&#39;ensemencement ainsi, le rayon de courbure du fond arrondi, le nombre de puits de semis, ou la profondeur des puits de semis peuvent tous être modifiés en changeant simplement le cahier des charges dans le fichier CAO pour CNC Usinage du moule en polycarbonate. Enfin, un moule unique en polycarbonate peut être utilisé pour fabriquer un nombre illimité de modèles PDMS, et chaque modèle de PDMS peuvent être nettoyés, autoclavés et réutilisés des dizaines de fois. En plus de modifier la taille des anneaux de tissu, nous avons fait des anneaux à partir de nombreux types cellulaires différents, y compris: SMC primaires de rat (Applications Cell, R354-05), primaire humaine SMC artère coronaire (Lonza, CC-2583), primaires humains fibroblastes dermiques 11 (don généreux de broches George Dr, WPI Département de génie biomédical), les fibroblastes de poumon de rat (RLF-6, ATCC CCL-192), et les cellules souches mésenchymateuses (Lonza, PT-2501). Chacun de ces types cellulaires agrégats et des contrats dans le centre de messages pour former des anneaux de tissu, bien que l&#39;organisation cellulaire, la composition d&#39;ECM, et les propriétés mécaniques des constructions varient pour chaque type de cellule. Les paramètres d&#39;ensemencement pour chaque type de cellule doit être déterminé de manière empirique basée sur la taille des cellules et leur capacité à s&#39;agréger. Par conséquent, tout ce système de création de bagues tissus dérivés de cellules est extrêmement polyvalent, le protocole peut avoir besoin de légers ajustements à la formation tissulaire optimale avec différents types cellulaires. La géométrie des tissus anneau facilite l&#39;installation et l&#39;évaluation des propriétés des matériaux des tissus par des tests de traction uniaxiale, tel que décrit. Il ya aussi un précédent important pour l&#39;utilisation de segments de vaisseaux sanguins anneau pour mesurer la contraction vasculaire et la fonction physiologique. Des études préliminaires indiquent que les anneaux de tissus dérivés de cellules peut être monté sur un dispositif myographe fils pour la mesure de la réactivité pharmacologique etcontractiles de génération de force (données non présentées). Au total, la capacité de rapidement fabriquer des anneaux de cellules auto-assemblés pour l&#39;analyse histologique, mécaniques, physiologiques et biochimiques suggèrent un nouvel outil puissant qui peut être utile pour la modélisation de la structure des tissus vasculaires et fonction dans la santé et la maladie.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif / équipements </th><th> Société </th><th> Catalogue # </th></tr><tr><td> Polydiméthylsiloxane (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15 à 017-CV </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (FBS) </td><td> AAP </td><td> A05-201 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Mediatech </td><td> 30 à 002-CI </td></tr><tr><td> Système d&#39;imagerie numérique </td><td> DVT Corporation </td><td> Modèle 630 </td></tr><tr><td> Machines d&#39;essais uniaxiaux </td><td> Instron </td><td> ElectroPuls E1000 </td></tr><tr><td> Logiciel détection de contour </td><td> DVT Corporation </td><td> Cadre 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering

Chaque année, des centaines de milliers de patients subissent un pontage coronarien dans les États-Unis. 1 Environ un tiers de ces patients n&#39;ont pas adaptée navires donneurs autologues en raison de la progression de la maladie ou de la récolte précédente. Le but de l&#39;ingénierie des tissus vasculaires est de développer une source de remplacement appropriées pour ces pontages. En outre, les tissus vasculaires conçues peuvent s&#39;avérer utiles en tant que modèles vivants vasculaires pour étudier les maladies cardio-vasculaires. Plusieurs approches prometteuses pour les vaisseaux sanguins d&#39;ingénierie ont été explorées, avec de nombreuses études récentes portant sur ​​le développement et l&#39;analyse des cellules à base de méthodes. 2-5 Ici, nous présentons une méthode pour s&#39;auto-assembler rapidement les cellules en bagues tissus 3D qui peuvent être utilisés dans in vitro pour modéliser les tissus vasculaires. Pour ce faire, des suspensions de cellules musculaires lisses sont ensemencées dans des puits à fond rond annulaire agarose. Les propriétés non adhésives de l&#39;agarose permettent èmecellules e à régler, des agrégats et du contrat autour d&#39;un poteau au centre du puits pour former un anneau de tissu cohésifs. 6,7 Ces anneaux peuvent être cultivées pendant plusieurs jours avant la récolte pour les mécaniques, physiologiques, analyse biochimique, ou histologique. Nous avons montré que ces anneaux de tissu cellulaire dérivée des rendements à 100-500 kPa ultime résistance à la traction 8 qui dépasse la valeur déclarée pour les constructions autres tissus vasculaires conçu pour des durées de culture similaire (&lt;30 kPa) 9,10. Nos résultats démontrent que des cellules robustes dérivés de génération vasculaires anneau de tissu peut être atteint dans un court laps de temps, et offre la possibilité pour l&#39;évaluation directe et quantitative de la contribution des cellules dérivées de cellules et de matrice (MDP) pour la structure du tissu vasculaire et la fonction.

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Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Cet article décrit une méthode souple pour créer des anneaux de tissu cellulaire dérivée par auto-assemblage cellulaire. Les cellules musculaires lisses ensemencées dans annulaires global d&#39;agarose des puits et des contrats pour former robustes en trois dimensions (3D) des tissus dans les 7 jours. Anneaux de tissu à l&#39;échelle millimétrique sont propices à des essais mécaniques et de servir comme blocs de construction pour l&#39;assemblage des tissus.

Réalisé cellulaire auto-assemblage pour fabriquer des anneaux de tissus dérivés de cellules pour l&#39;analyse biomécanique et génie tissulaire

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.7K vues.  Worcester Polytechnic Institute. Cet article décrit une méthode souple pour créer des anneaux de tissu cellulaire dérivée par auto-assemblage cellulaire. Les cellules musculaires lisses ensemencées dans annulaires global d'agarose des puits et des contrats pour former robustes en trois dimensions (3D) des tissus dans les 7 jours. Anneaux de tissu à l'échelle millimétrique sont propices à des essais mécaniques et de servir comme blocs de construction pour l'assemblage des tissus.

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Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS élastomère échafaudages en génie tissulaire artérielle

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Recherche

Bio-ingénierie

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Champ électrique contrôlé par les migrations des Réalisé cellules progénitrices neurales dans des environnements 2D et 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capillaire de travail lithographie pour l&#39;ingénierie tissulaire cardiaque

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

génie tissulaire d&#39;un être humain 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Système de tumeur de test

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microenvironnements sandwich à exploiter cellulaires / Interactions matérielles

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Génie tissulaire par Intrinsic vascularisation dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Chambre Ingénierie

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Synthèse de cationisé Magnetoferritin pour magnétisation ultra-rapide des cellules

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...