Nous tenons à remercier Steffen Koch pour son soutien technique et Shannon Lee Layland (à la fois Fraunhofer IGB Stuttgart) pour ses suggestions utiles sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu financièrement par le programme Attirer de la Fraunhofer-Gesellschaft et le BMBF (à la fois pour KS-L.).

1. Préparation de l&#39;échantillon biologique <ol><li> Préparation de cellules vivantes <ol><li> Préparation de cellules adhérentes <ol><li> Semences dans les cellules in vitro-culture ou fraîchement isolées sur un plat à fond de verre (Greiner BioOne / Allemagne) et les incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu&#39;à ce que la fixation des cellules est terminée. </li><li> Retirer milieu de culture et laver doucement trois fois avec du PBS mesure préalable. Maintenir les cellules couvertes avec soit PBS ou milieu de culture cellulaire pendant toute la procédure de mesure. </li></ol></li><li> Préparation de cellules en suspension <ol><li> Détachez in vitro des cellules cultivées selon des protocoles communs (par exemple la trypsine-EDTA, raclage cellulaire), centrifuger les cellules et remettre en suspension le culot cellulaire obtenu dans du PBS ou un milieu de culture cellulaire. </li><li> Transférer 100 ul de la suspension cellulaire (concentration: max. 100.000 cellules / ml) à un plat à fond de verre. </li></ol></li></ol></li><li> Préparation de la nattissus ive <ol><li> Après la récolte, les tissus, les transférer à stérile, PBS glacé et de les conserver plus de 12 heures à 4 ° C ou sur la mesure de la glace avant. Des expériences antérieures ont montré qu&#39;une durée de conservation prolongée (temps d&#39;ischémie froide de plus de 12 heures à 4 ° C) a entraîné des modifications spectrales dues à des processus de dégradation naturelle. </li><li> Les mesures doivent être effectuées avec le tissu recouvert de PBS ou moyen pour éviter d&#39;endommager des protéines de la MEC et les cellules en raison de séchage des tissus. </li></ol></li></ol> 2. Raman spectromètre Notre spectromètre Raman personnalisée combine un microscope standard à fluorescence (Olympus IX 71) avec un spectromètre Raman qui permet la comparaison directe des images lumineuses sur le terrain-et la fluorescence avec les spectres Raman. L&#39;ensemble de base se compose d&#39;un laser à 784 nm diode (Toptica photonique AG / Allemagne), un filtre à encoche pour la séparation de la lumière Raman diffusée de-la lumière d&#39;excitation, un microscope unend a. spectrographe (Kaiser Systems Inc optique, Ann Arbor / USA) avec un dispositif à couplage de charge (CCD) optimisé pour la détection de l&#39;information spectrale (F-voir de systèmes d&#39;imagerie soft / Allemagne) 3. Contrôle de la fonction laser <ol><li> Démarrez le logiciel Andor Solis (Andor / Royaume-Uni) et régler la température de la caméra CCD à -60 ° C afin de minimiser le bruit causé par les courants induits thermiquement dans la caméra. </li><li> Placer une plaquette de silicium sur la platine du microscope pour la procédure d&#39;étalonnage. </li><li> Allumez le laser et régler la puissance de 85 mW. </li><li> Utilisez la Cellule logiciel B (Olympus / Allemagne) pour focaliser le laser sur la plaquette jusqu&#39;à ce XY apparaît. </li><li> Mesurer la plaquette de silicium avec un temps d&#39;intégration unique de 1 sec à l&#39;aide d&#39;un objectif 60x air. </li><li> Changer l&#39;unité de l&#39;axe des x de nombre de pixels à décalage Raman (cm -1) dans le logiciel Andor Solis. </li><li> Variez la focalisation du laser du pic de silicium à 520 cm -1 dansl&#39;collectées spectre afin de trouver l&#39;intensité maximale possible pour cette bande Raman. Le montant minimum de chefs d&#39;accusation doit être supérieure à 11.000 à avoir un calibrage réussi. </li></ol> 4. Raman des mesures spectroscopiques Toutes les mesures sont réalisées à température ambiante. <ol><li> Les réglages de base <ol><li> Utilisez un objectif 60x de l&#39;eau d&#39;immersion (Olympus / Allemagne) avec une ouverture numérique de 1,2 pour recueillir le spectre des échantillons. </li><li> Modifiez les paramètres d&#39;acquisition de 10 intégrations / 10 secondes pour un total de 100 secondes par des mesures. </li></ol></li><li> Mesure de cellules adhérentes <ol><li> Sortez le plat à fond de verre avec les cellules et le placer sur la platine du microscope. </li><li> Afin d&#39;obtenir un meilleur signal et garantir la reproductibilité, le laser se concentrer sur le noyau de la cellule, tourner à la lumière du microscope hors tension et commencer à recueillir le spectre. </li><li> Mesurer un spectre de référence de l&#39;e fond10 spectres très en déplaçant la focalisation du laser à côté de la cellule. Il est important de considérer que lorsque vous changez le focus un nouveau fond doivent être collectées pour chaque profondeur de champ. </li></ol></li><li> Mesure des cellules en suspension <ol><li> Transférer 100 ul de la suspension cellulaire dans le plat à fond de verre et le placer sur la platine du microscope. </li><li> La mise au laser sur le centre de la cellule, tourner à la lumière du microscope hors tension et commencer à recueillir le spectre. </li><li> Mesurer un spectre de référence de l&#39;arrière-plan tous les 10 spectres en déplaçant la focalisation du laser à côté de la cellule. Lorsque vous changez le focus, un nouveau fond doivent être collectées pour la profondeur nouvelle orientation. </li></ol></li><li> Mesure des tissus indigènes <ol><li> Prenez l&#39;échantillon et le placer dans un plat à fond de verre. La région d&#39;intérêt (ROI) devrait être orientée vers le bas de la parabole. </li><li> Remplissez le plat avec suffisamment de PBS pour couvrir l&#39;échantillon. </li><li> Placez un couvercle en verre sur l&#39;échantillon afin d&#39;éviter toute movement de l&#39;échantillon pendant les mesures. </li><li> Définir la focalisation du laser dans la structure d&#39;intérêt (résolution en profondeur est laser et le tissu-dépendant) et commencer à recueillir les spectres. </li><li> Collecter un spectre de référence de l&#39;arrière-plan à chaque spectres 10 en déplaçant le laser focaliser sur la zone de tissu ensemble. Lorsque vous changez le focus, un nouveau fond doivent être collectées pour la profondeur nouvelle orientation. </li></ol></li><li> Mesure de l&#39;immunofluorescence (IF)-étiquetés cryosections <ol><li> Section frais, des échantillons de tissus composant logiciel enfichable congelés en utilisant une norme cryotom et les monter sur des lunettes de couverture de silice revêtues. </li><li> Colorer les cryocoupes suivant un protocole de routine pour SI, employant seulement une étape de fixation court (max. 10 minutes avec le paraformaldéhyde 4%) et en utilisant des anticorps appropriés pour la détection de la protéine d&#39;intérêt. </li><li> Effectuer des mesures Raman se concentrant dans la région où se produit la fluorescence. </li></ol></li><li> Expériences dégradation de l&#39;élastine <ol><li> PlaCE l&#39;ventricularis des feuillets porcine disséqués valve aortique (élastine-riche, le sang d&#39;entrée du côté de la couche de valve de valvule cardiaque) faisant face au fond de la cuvette fond de verre. </li><li> Mesurer le tissu natif comme un «non incubé de contrôle» à 30 points aléatoires à travers toute la surface du tissu se concentrant dans les structures fibrillaires. </li><li> Diviser l&#39;échantillon en 3 sections et les placer dans des tubes Eppendorf 2,5 distincts ml remplie avec 2 ml d&#39;une solution d&#39;élastase (5 U / ml, Worthington / Allemagne). </li><li> Incuber le tissu pour 15 ou 30 minutes à 37 ° C. </li><li> Après une incubation de 15 ou 30 minutes, retirer les tissus du tube Eppendorf et laver soigneusement avec du PBS pour arrêter complètement la réaction enzymatique. </li><li> Mesurer chaque échantillon à 30 points aléatoires, en se concentrant dans les structures fibrillaires. </li></ol></li></ol> 5. Traitement et analyse des données <ol><li> Le traitement des spectres Raman Le pré-traitement de l&#39;spectres générés a été réalisée en utilisant le logiciel OPUS (Bruker Optik GmbH / Allemagne). <ol><li> Afin de réduire les signaux parasites du verre et moyennes ainsi que pour éviter des variations provoquées par les changements de l&#39;orientation au cours de mesures, soustraire le spectre de bruit de fond correspondant à partir des spectres recueillis. </li><li> Réduire les spectres de la région entre les nombres d&#39;onde 400-1800 cm -1, ce qui offre la plus grande quantité d&#39;informations. </li><li> Si nécessaire, normaliser le spectre du pic maximum. Facteurs de normalisation sur les fluctuations d&#39;intensité et les échecs systématiques, ce qui simplifie la détection des changements structurels dans les spectres de l&#39;échantillon. </li><li> Effectuer une correction de base pour accroître la comparabilité entre les différentes expériences. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des spectres Raman Les spectres Raman ont été analysées à l&#39;aide APC avec The Unscrambler (CAMO / Norvège) du logiciel. Cette analyse multivariée détecte les différences et les similitudes au sein des données spectralesensembles. Chaque spectre est tracé comme un seul point dans un espace multidimensionnel basé sur les chiffres recueillis pour chaque quart de travail Raman. Chaque composante principale (PC) décrit une certaine quantité de l&#39;information totale contenue dans les données originales. Le premier PC est celui qui contient la plus grande source de variation. Chaque PC contient ce qui suit, dans l&#39;ordre, moins d&#39;informations que la précédente. Chaque variable a un score et un chargement sur chaque PC. En traçant PC (= scores), les corrélations d&#39;échantillon importantes peuvent être exposés. Les charges de décrire la contribution de chaque variable analysée à l&#39;APC. <ol><li> Étiquetez chaque groupe de mesures par la création de gammes de ligne pour chaque groupe d&#39;échantillons. </li><li> Utilisez les réglages de base suivants pour l&#39;APC: ski de validation, l&#39;algorithme NIPALS, pas de rotation et de commencer l&#39;analyse. Ces paramètres sont des spectres dépend. </li><li> Effectuez l&#39;APC. </li></ol></li></ol> 6. Les résultats représentatifs Raman spECTRA générée à partir de cellules adhérentes révèlent souvent un faible rapport signal-sur-bruit et un signal de faible intensité globale (Fig. 1) 11. En raison du fait que la focalisation du laser doit être situé à proximité du fond de verre, l&#39;influence de l&#39;interférence signal de verre est assez élevé, ce qui provoque de masquage du signal réelle de l&#39;échantillon. Par conséquent, le signal de l&#39;échantillon peut être réduite ou même éliminée au cours d&#39;une arrière-plan après la soustraction. Ainsi, nous préférons utiliser des cellules en suspension pour notre analyse spectroscopique Raman, car ils permettent la détection de plus amples renseignements spectrale détaillée. Cependant, les spectres de cellules adhérentes et la suspension présentent les mêmes pics principaux ne diffèrent que par leurs intensités. Pour la caractérisation des différents types de cellules au sein d&#39;une suspension, pas de pré-traitement est nécessaire. Les spectres Raman moyenne et les écarts types de fibroblastes humains, les cellules souches mésenchymateuses (CSM), les chondrocytes et les kératinocytes mesurée en suspension sontreprésentée sur la figure 2. Tous les spectres Raman ont une structure similaire, avec des pics provenant de biomolécules typiques tels que les protéines, les acides nucléiques et des lipides (voir tableau 1). 12 Pour ces types de cellules, la région spectrale entre 600 et 1800 cm -1 contient la plus pertinente l&#39;information spectrale, par où les différences claires entre les sont détectables différents types de cellules (Fig. 2A). Exemplaire, nous avons souligné une région spectrale (1280-1350 cm -1) affichant de nettes différences structurelles, ce qui n&#39;est plus assignable à des vibrations moléculaires de collagène et des lipides. En revanche, les analyses morphologiques ne sont pas adaptés pour l&#39;identification et la distinction de la plupart des cellules (Fig. 2B-I). Bien que la différence entre les chondrocytes et les cellules de la peau est observable (Fig. 2D, H par rapport à B, F et E, I), les fibroblastes et les MSC sont difficiles à séparer en utilisant uniquement champ lumineux micrsocopier (Fig. 2B, F par rapport à C, G) 13. Raman analyse spectroscopique de tissu natif, en particulier des protéines ECM, exige que le retour sur investissement peut être visualisée par imagerie à champ clair afin d&#39;être en mesure de se concentrer sur la structure respective. Pour l&#39;attribution d&#39;une protéine à un large empreinte spécifique, nous avons généré des spectres Raman disponibles dans le commerce des protéines pures et cryosections immunohistologically colorées. Ici, nous avons identifié les spectres d&#39;empreintes digitales des fibres élastiques dans les tissus natifs comparant élastine lyophilisée et immunofluorescence tachés de cryosections employant un anticorps dirigé contre l&#39;élastine. Cependant, depuis l&#39;élastine dispose d&#39;un autofluorescence élevée, ce qui se reflète dans les spectres Raman, l&#39;analyse des données est difficile (figure 3A). Afin de réduire l&#39;échec systématique due à l&#39;échantillon des propriétés spécifiques telles que l&#39;autofluorescence, un traitement approprié des ensembles de données est cruciale. Dans nos données, unealyses, nous avons utilisé la normalisation afin d&#39;éliminer l&#39;intensité du signal significativement plus élevé de la protéine pure élastine, et donc, nous étions en mesure de générer comparables spectres Raman (Fig. 3B). L&#39;élastine est une des protéines de la MEC les plus stables dans le corps et est donc très difficile à se dégrader. 14 Dans notre dispositif expérimental, nous avons provoqué la dégradation de l&#39;élastine dans les tracts porcine sains de la valve aortique en effectuant une digestion enzymatique. L&#39;application de l&#39;analyse multivariée PCA, nous avons identifié des différences significatives entre les spectres Raman de enzymatiquement échantillons traités et les contrôles natifs (figure 3C). Ces différences spectrales ont été observées dans le spectre de chargement à 861, 1003 et 1664 cm -1. Attendus des changements structurels dans les fibres d&#39;élastine contenant dus aux délais de exposition prolongée à l&#39;élastase ont été présentés par coloration HART (fig. 4), qui ont également été traduit dans plus de groupes distincts marquer séparables (Fig. 3C). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" /> Figure 1. Moyenne des spectres Raman des fibroblastes détachées et adhérente. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" /> Figure 2. (A) moyenne des spectres Raman et écarts-types des quatre différents types de cellules primaires isolées (fibroblastes, cellules souches mésenchymateuses, les chondrocytes et les kératinocytes). La trame met en évidence la région spectrale de 1280 - 1350 cm -1 avec des différences de structure. (BE) Bright images en champ de détachés (B) des fibroblastes, (C) MSCS, (D) et les chondrocytes (E) kératinocytes. La barre d&#39;échelle est égal à 20 um. (FI) à champ clair des images de adhérentes (F), des fibroblastes (G) MSCS, (H) et les chondrocytes (I) kératinocytes. La barre d&#39;échelle est égal à 200 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" /> Figure 3. (A) des spectres Raman sans normalisation des lyophilized élastine (ligne bleue), immunofluorescence (IF)-étiquetés cryosections (ligne orange) et des fibres élastiques (ligne rouge) mesurées dans les natifs des tracts de la valve aortique. L&#39;intensité du signal élevé de l&#39;élastine lyophilisée est causée par autofluorescence. (B) des spectres Raman après la normalisation en vue d&#39;éliminer les défaillances systémiques. (C) Les scores et les charges de la comparaison entre la non-traitée de contrôle (rouge) et enzymatiquement dégradé (bleu et vert) fibres élastiques au sein du tissu natif. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" /> Figure 4. HART&#39;s tachés tracts porcine valve aortique. Les fibres élastiques sont visualisées en noir. (A) et (B) démontrer la non-traité le contrôle et (C) et (D) représentent des échantillons de tissus qui ont été exposés à l&#39;élastase enzyme dégradant pour l&#39;élastine-30 minutes. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre d&#39;onde en cm -1 </strong&gt; </td><td colspan="2"> Affectation 12 </td></tr><tr><td> 717-719 </td><td> CN </td><td> Les phospholipides </td></tr><tr><td> 785-788 </td><td> ADN / ARN de bases, Épine dorsale OPO </td><td> ADN / ARN </td></tr><tr><td> 1003 - 1005 </td><td> Phénylalanine </td><td> Protéine </td></tr><tr><td> 1220-1280 </td><td> Amide III </td><td> Protéine </td></tr><tr><td> 1445-1447 </td><td> CH 2 </td><td> Protéine / lipide </td></tr><tr><td> 1655-1680 </td><td> Amide IC = C </td><td> Des lipides Protéines </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Bandes Raman qui sont détectés dans les spectres de tous les types de cellules (fibroblastes, cellules souches mésenchymateuses, les chondrocytes et les kératinocytes).

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La spectroscopie Raman est un outil approprié pour analyser les échantillons biologiques, tels que in vitro des cultures de cellules et des protéines ECM ainsi que les cellules dans les tissus natifs. 11,15,16 Ici, nous avons démontré que ce contact non, sans étiquette technique permet la la discrimination des différents types de cellules et la détection de la dégradation des protéines ECM fondée uniquement sur la composition biomoléculaire intrinsèque de ces échantillons biologiques. Le principal avantage de la spectroscopie Raman est la capacité à quantifier de manière non invasive l&#39;empreinte biochimique d&#39;un échantillon par son spectres Raman qui en résulte. Contrairement à la spectroscopie infrarouge, ce qui donne des informations similaires, les spectres Raman peuvent être recueillies à partir d&#39;échantillons aqueux, comme la dispersion Raman de l&#39;eau est faible. En outre, la spectroscopie Raman est uniquement sur la base de la détection de la rétrodiffusion de la lumière monochromatique, par conséquent, aucun traitement d&#39;échantillonnage est nécessaire de mesure précédent. Ces attributs font de Raspectroscopie homme une alternative prometteuse pour le potentiel dans les applications d&#39;imagerie in vivo. À ce sujet, anti-Stokes cohérente spectroscopie Raman (CARS) est une technique très intéressante car elle permet d&#39;accélérer et d&#39;acquisition plus sensible des données basées sur les mêmes signaux vibratoires utilisés dans nos expériences. 15,16 D&#39;autres méthodes alternatives, y compris multiphotonique induite par autofluorescence et imagerie de seconde génération d&#39;harmoniques ont déjà été avérée appropriée pour le suivi des échantillons biologiques non invasive ou minime 17. Cependant, ces modalités d&#39;imagerie sont associés à des coûts très élevés et sont limités à autofluorescence génératrices de molécules. En outre, spectromètre Raman est facile à combiner avec microscopes optiques conventionnels. Ces caractéristiques font de la spectroscopie Raman un outil précieux pour étudier des échantillons biologiques dans les environnements physiologiques. Une des limites actuelles de notre spectroscopie Raman est mis en placela mise au point laser relativement petite (250 nm au maximum à moitié pleine largeur (FWHM) latérale et 700 nm FWHM axiale) qui est créé par un objectif à grande ouverture numérique (NA = 1,2). Même si une grande ouverture numérique permet de couvrir une bonne quantité de la lumière émise Raman cédant dans un fort rapport signal sur bruit, la haute NA ne produit qu&#39;une petite collection accent sein de l&#39;échantillon qui est généralement beaucoup plus petite qu&#39;une cellule. Afin de comparer les spectres Raman de différentes cellules, la collection d&#39;un éventail représentatif est essentiel, qui est difficile à obtenir avec une zone de petit foyer. Pour résoudre ce problème, nous travaillons sur un processus visant à automatiser la collecte de signal à différents points de la cellule (= cartographie spectroscopique Raman), résultant en une moyenne spectrale et se livrant à un éventail représentatif. En outre, cette technique vous donnera un aperçu de la répartition des bandes Raman spécifiques, par exemple de la distribution des protéines dans une cellule. Bioléchantillons LOGIQUE sont très complexes et se composent d&#39;un mélange hétérogène de biomolécules qui contribuent à la spectres Raman recueillis. Par conséquent, le motif spectrale est grande complexité et la surveillance d&#39;un type unique d&#39;une molécule dans un spectre Raman est difficile à atteindre avec le chevauchement de signaux différents molécule. En outre, la fluorescence intrinsèque de l&#39;échantillon peut masquer des informations précieuses sur les plus faibles signaux Raman. Fait intéressant, dans certains de nos études précédentes, nous avons identifié autofluorescence dans les spectres Raman comme le principal facteur de différenciation entre les types cellulaires (cellules souches mésenchymateuses et les fibroblastes) en utilisant un outil d&#39;analyse appropriée 13. Nous avons également identifié que les changements dans l&#39;intensité du signal Raman globale peut servir un indicateur de l&#39;état de collagène et des fibres de collagène au sein de l&#39;ECM de tracts de la valve aortique. 9 Toutefois, lorsque l&#39;on analyse l&#39;état de l&#39;élastine dans ces tissus, nous n&#39;étions pas en mesure de détecter des résultats similaires. Comme mentionné dans le résultatla section s, nous étions seulement capables de détecter des altérations de bandes spécifiques Raman dans les échantillons traités par l&#39;élastase par rapport aux contrôles natifs. Nous n&#39;avons pas vu une diminution du signal global Raman dans les échantillons traités par voie enzymatique comme prévu. Ces observations entraîné dans un complot score qui n&#39;a pas révélé de la formation de grappes clair comme on le voit dans l&#39;étude précédente. 9 En revanche, l&#39;influence du traitement enzymatique est détectable dans les résultats de l&#39;ACP. Nous supposons que ces divergences entre les deux protéines de la MEC, l&#39;élastine et le collagène, sont basées sur les différences morphologiques et différents processus de dégradation enzymatiques: dans le dépliant de la valve aortique, la zone riche en collagène (fibreuse) est une couche continue qui devient desserré en raison de la traitement enzymatique, grâce à quoi l&#39;élastine contenant la zone (ventricularis) présente une configuration de réseau qui apparaît après une exposition à une fragmentation de l&#39;élastase (fig. 4). Des mesures ponctuelles simples ne sont donc pas appromangé à détecter de telles ruptures de petits au sein du réseau d&#39;élastine. Ici, une cartographie Raman du tissu aiderait à identifier les pannes de réseau. Un autre défi en spectroscopie Raman d&#39;échantillons biologiques est de réduire les temps de mesure. Une solution consiste à augmenter la puissance du laser, qui est adapté aussi longtemps que les échantillons biologiques ne sont pas affectés par la photo-dommages. Toutes nos expériences actuelles sont la preuve de principe des études portant sur ​​la recherche fondamentale, mais notre objectif global est de mettre en œuvre la spectroscopie Raman pour des applications cliniques, y compris la médecine régénérative (contrôle de la qualité par exemple de l&#39;ingénierie tissulaire produits), suivi du greffon pré-transplantation et le diagnostic du cancer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> élastase </td><td> Worthington </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps anti-élastine </td><td> Sigma </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75; tampon citrate </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> plats à fond de verre </td><td> Greiner BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> The Unscrambler </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opus </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-contact, label-free monitoring of cells and extracellular matrix using raman spectroscopy

Technologies non-destructive, sans contact et sans étiquette pour surveiller cultures cellulaires et tissulaires sont nécessaires dans le domaine de la recherche biomédicale. 1-5 méthodes de routine Cependant, actuellement disponibles nécessitent des étapes de traitement et de modifier l&#39;intégrité des échantillons. Spectroscopie Raman est un procédé rapide qui permet la mesure d&#39;échantillons biologiques, sans la nécessité d&#39;autres étapes de traitement. . Cette technologie à base de laser détecte la diffusion inélastique d&#39;une lumière monochromatique 6 tant chaque vibration chimique est affecté à une bande de fréquences spécifique Raman (nombre d&#39;onde en cm -1), chaque échantillon biologique comprend un motif typique spectrale en raison de leur composition biochimique inhérente 7. - 9 Dans les spectres Raman, les intensités des pics en corrélation avec le montant des obligations actuelles moléculaires. 1 Similitudes et différences des ensembles de données spectrales peuvent être détectés en utilisant une analyse multivariée (par exemple l&#39;analyse en composantes principales (ACP)) 10. </sup&gt; Ici, nous effectuons la spectroscopie Raman de cellules vivantes et de tissus natifs. Les cellules sont ensemencées sur des boîtes soit à fond de verre ou maintenues en suspension dans des conditions normales de culture cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2) avant la mesure. Tissus autochtones sont disséqués et conservés dans un tampon phosphate salin (PBS) à 4 ° C des mesures préalables. En fonction de notre dispositif expérimental, nous avons alors soit porté sur le noyau de la cellule ou de la matrice extracellulaire (ECM) des protéines telles que l&#39;élastine et du collagène. Pour toutes les études, un minimum de 30 cellules ou 30 points aléatoires d&#39;intérêt au sein de l&#39;ECM sont mesurés. De données des étapes de traitement de soustraction du fond incluses et la normalisation.

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Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

La spectroscopie Raman est une technique appropriée pour le contact non-, sans étiquette analyse de cellules vivantes, de l&#39;ingénierie tissulaire constructions et des tissus indigènes. Source spécifiques empreintes spectrales peuvent être générées et analysées en utilisant une analyse multivariée.

Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

non-contact-label-free-monitoring-cells-extracellular-matrix-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.8K vues.  Eberhard Karls University, Tübingen. La spectroscopie Raman est une technique appropriée pour le contact non-, sans étiquette analyse de cellules vivantes, de l'ingénierie tissulaire constructions et des tissus indigènes. Source spécifiques empreintes spectrales peuvent être générées et analysées en utilisant une analyse multivariée.

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Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Recherche

Bio-ingénierie

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Une biopuce microfluidique électrochimique à base d&#39;analyse ADN hybridation Sans étiquette

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Une technique Label-free pour l&#39;imagerie spatio-temporelle de cellule unique sécrétions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Préparation de la matrice extracellulaire des fibres de protéines pour Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabrication d’un Hydrogel de dérivés de matrice extracellulaire rein Cortex

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

Mise en œuvre de la microscopie de réflexion sur les interférences pour l'imagerie à haute vitesse sans étiquette des microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric field of metallic nanostructures. Salt-induced silver nanoparticle aggregation is the most popular method for generating SERS-active substrates; however, it is limited by poor reproducibility, stability, and biocompatibility. The present protocol integrates optical manipulation and SERS detection to develop an efficient analytical platform to address this. A 1064 nm trapping laser and a 532 nm Raman probe laser are combined in a microscope to assemble silver nanoparticles, which generate plasmonic hotspots for in situ SERS measurements in aqueous environments. Without aggregating agents, this dynamic plasmonic silver nanoparticle assembly enables an approximately 50-fold enhancement of the analyte molecule signal. Moreover, it provides spatial and temporal control to form the SERS-active assembly in as low as 0.05 nM analyte-coated silver nanoparticle solution, which minimizes the potential perturbation for in vivo analysis. Hence, this optical trapping-integrated SERS platform holds great potential for efficient, reproducible, and stable molecular analyses in liquids, especially in aqueous physiological environments.

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

The present protocol describes a convenient approach to integrating optical trapping and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) to manipulate plasmonic nanoparticles for sensitive molecular detection. Without aggregating agents, the trapping laser assembles plasmonic nanoparticles to enhance the SERS signals of target analytes for in situ spectroscopic measurements.

Piégeage optique de nanoparticules plasmoniques pour la caractérisation in situ de la spectroscopie Raman améliorée en surface

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric ...