L&#39;auteur remercie le Dr Gao Jin pour la synthèse des PGS, le Dr Peter Crapo pour la discussion fructueuse pour l&#39;installation bioréacteur, les Drs. Mohamed Ezzelarab et Wei Wu pour explantation babouin artères carotides. Cette étude a été soutenue par une subvention des National Institutes of Health (R01 HL089658).

1. Tubulaire d&#39;échafaudage de fabrication <ol><li> Préparer un tube de verre (longueur = 70 mm, diamètre extérieur = 9,0 mm, épaisseur = 1,0 mm; petites pièces, Miramar, Floride) comme un moule pour échafaud. </li><li> Préparer 1,0 pds / vol% d&#39;acide hyaluronique (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en dissolvant 100 mg de HA dans 10 ml d&#39;eau déminéralisée. Mélanger à l&#39;aide d&#39;un rotateur nuit jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y ait pas de bulles d&#39;air dans la solution. </li><li> Verser la solution HA 1,0% dans le haut du tube de verre. Laissez couler lentement le long de la paroi intérieure du moule. Retourner sur le tube lorsque la solution atteint le fond du moule en utilisant le rotateur et répétez cette étape jusqu&#39;à ce que la paroi intérieure du moule est uniformément recouvert par la solution. </li><li> Après le revêtement, sec tous les tubes de verre dans l&#39;étuve sous vide à 37 ° C pendant 24 h. </li><li> Broyer et des particules de sel tamis (taille = 25 à 32 um), utilisé comme porogènes. </li><li> Réunir un tube de verre (couché avec à l&#39;intérieur HA solution à 1,0%), un mandrin (en acier inoxydable recouvert par un tube en PTFE), thermorétractable (SH) manche, et l&#39;anneau de PTFE comme décrit précédemment 8. </li><li> Ajouter particules de sel de la taille souhaitée pour le moule en verre à l&#39;aide d&#39;une spatule à travers l&#39;entonnoir en caoutchouc de silicium. Appuyez sur le moule doucement pour assurer une distribution uniforme des particules de sel. Gratter les particules excès de sel sur le dessus du moule en utilisant le côté de la spatule. </li><li> Allumez l&#39;incubateur d&#39;hybridation pour 30 min avant de transférer le moule sel emballé. Éteignez l&#39;incubateur d&#39;hybridation et le sel Mettez-emballés moule dans l&#39;incubateur d&#39;hybridation pour la fusion du sel. </li><li> Retirer les moules de l&#39;incubateur d&#39;hybridation et les sécher dans le four sous vide à 37 ° C pendant 24 h. </li><li> Retirer les moules sel emballé du four sous vide et laissez-les refroidir à température ambiante. Retirez le mandrin en acier inoxydable en le poussant vers le bas avec la tenue de l&#39;anneau en PTFE. Si le mandrin est trop serré pour le moule, utilisez la pince à aiguille pour la retirer. Retirer la bague PTFE du fond du moule. </li><li> Mettez les moules dans le four à 120 ° C pendant 5 min à rétrécir manches SH. Vérifiez si le manchon HS est rétréci. Retirer le manchon HS à partir des moules sel emballé et les laisser refroidir à température ambiante. Gardez les moules dans le dessiccateur jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient utilisés. </li><li> Préparer la solution PGS en dissolvant 3 g de PGS dans 15 ml de tétrahydrofurane (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) pour former une masse 20 / solution% vol. </li><li> Ajouter la solution PGS dans la lumière de sel-emballés moules en les déposant en utilisant un spoid dans la hotte Hume. Lean le moule en verre d&#39;environ 45 ° et chute de la solution PGS dans la lumière intérieure avec rotation du moule lentement. Vérifier si la solution PGS descend le long du mur de moisissure. Si endroit sec est observé, ajouter plus de solution. </li><li> Après avoir ajouté la solution PGS, placer les moules dans la hotte Hume pendant au moins 30 min pour l&#39;évaporation du THF. </li><li> Mettez les moules dans le four à vide pour temps de cuisson pré-déterminé (ex. 24 / 36 / 48 h) à 100 mTorr et 150 ° C pour PGS durcissement. </li><li> Après durcissement, enlever les moules et les placer à température ambiante pour refroidir. Tremper chaque moule dans l&#39;eau déminéralisée avec la position verticale lentement. Ne pas les plonger dans l&#39;eau rapidement, car les bulles d&#39;air peut causer la déchirure de l&#39;échafaud. </li><li> Transférer les moules au bain d&#39;eau soigneusement et les placer à un angle de 1 h en utilisant le tube de silicone pour dissoudre HA facilement. Vérifiez si HA est dissous à partir du moule. Si aucun HA est libéré à partir du moule, poussez la fin l&#39;un des échafaudages lentement en utilisant une spatule pour le démoulage. Répétez cette étape à l&#39;autre bout de l&#39;échafaud et secouer le moule avant et en arrière lentement dans l&#39;eau du bain. Vérifiez si l&#39;échafaudage est déplacé à l&#39;intérieur du moule. </li><li> Transfert l&#39;échafaud pour un autre bain d&#39;eau avec agitateur attentivement. Ne pas saisir fermement l&#39;échafaud, qui peut-être craquer l&#39;échafaud. Placez l&#39;échafaud dans le bain d&#39;eau pendant au moins 3 jours à l&#39;évolution de l&#39;eau pour lessiver les particules de sel. </li><li> Après le lessivage des particules de sel, le transfert de chaque échafaudage pour le tube à centrifuger de 15 ml remplie de l&#39;eau désionisée et placez-les dans la boîte de glace sèche pendant 1 h à geler. Mettez des tubes à centrifuger dans le lyophilisateur (toutes les cabines tube doit être ouvert) et de les lyophiliser pendant 2 jours. </li><li> Mettez tous les échafaudages dans le dessicateur avant jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient utilisés. </li></ol> 2. Préparation d&#39;échafaudage pour l&#39;ensemencement cellulaire <ol><li> Sortez échafaudages du dessiccateur et les couper en 25-30mm de longueur. </li><li> Préparer deux bouchons en caoutchouc de silicone (diamètre = 20 mm, épaisseur = 6,35 mm, diamètre du trou du milieu = 3 mm) et de connecter deux tubes en PTFE (diamètre extérieur = 3,97 mm, diamètre intérieur = 2,38 mm, épaisseur = 0,79 mm, longueur = 60 mm et 40 mm) à travers les trous au milieu de chaque bouchon. </li><li> Couper un anneau SH comme 1,5 mm de longueur et de le mettre sur le dessus d&#39;une extrémité de l&#39;échafaud. Poussez une tube PTFE (connecté bouchon de caoutchouc de silicone) dans l&#39;une des extrémités de l&#39;échafaudage comme portion qui se chevauchent plus petit possible. </li><li> Mettez les tubes d&#39;échafaudage et de PTFE dans le four à 120 ° C pendant 10 min à rétrécir anneau de SH. Vérifiez si anneau de HS est rétréci et les échafaudages sont reliés à un tuyau en PTFE fermement. </li><li> Sortez les tubes d&#39;échafaudage et le PTFE et les placer à température ambiante pour refroidir. Mettez l&#39;assemblage tube échafaudage PTFE dans le tube en polycarbonate (diamètre extérieur = 15,5 mm, diamètre intérieur = 9 mm, longueur = 50 mm) comme une chambre de bioréacteur. </li><li> Connectez l&#39;autre extrémité du tube PTFE à l&#39;échafaud comme des étapes 2.3) et 2.4). </li><li> Ajuster deux bouchons en caoutchouc de silicone pour attacher leurs surfaces intérieures aux deux extrémités du tube en polycarbonate. Attachez les deux surfaces extérieures des bouchons en caoutchouc de silicone à deux plaques en alliage d&#39;aluminium (haut et bas, largeur = 20 mm, longueur = 70 mm, épaisseur = 6,35 mm). Mettez deux tiges filetées dans les trous côté de la plaque et fixer le tube en polycarbonate (inclus à l&#39;intérieur d&#39;échafaudage) pour les plaques en serrant la vis écrou de pouce sur la plaque. </li><li> Mesurez la longueur de chaque seedable échafaudage (une longueur entre les anneaux SH deux) et de calculer la surface intérieure (π x diamètre interne x longueur seedable) de chaque échafaudage pour l&#39;ensemencement des cellules. </li><li> Enroulez une unité de chambre bioréacteur avec feuille d&#39;aluminium et stériliser à l&#39;autoclave à 120 ° C pendant 30 min. Stériliser chaque partie (réservoir moyennes, les tubes de la pompe, l&#39;échangeur de gaz, collecteurs, et le pointeau) du bioréacteur à l&#39;autoclave à 120 ° C pendant 30 min et les assembler à l&#39;intérieur du capot de la culture cellulaire. </li><li> Pré-traiter et rincer échafaudages avec une série de perfusions (70, 50 et 25% d&#39;éthanol pendant 1 h, un tampon phosphate salin (PBS; Mediatech, Herndon, VA) pendant 2 h, et un milieu de culture pendant 24 h SMC en utilisant une pompe péristaltique à 1,0 ml / min dans le circuit d&#39;écoulement. </li></ol> 3. Ensemencement de cellules et de la Culture <ol><li> Isoler primaires cellules musculaires lisses artérielles (SMC) de l&#39;artère carotide de juvéniles mâles babouins (Papio anubis) et les caractériser en deux dimensions (2D) et de la culture avant repiquage de semis, comme décrit précédemment 9. </li><li> Développer SMC utilisant le milieu MCDB 131 (Mediatech, Herndon, VA) avec 10% sérum de veau fœtal (Lonza, Walkersville, MD), 1% de L-glutamine (Mediatech), 50 pg / ml d&#39;acide ascorbique (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), et une solution antibiotique-antimycosique (10 000 UI / ml de pénicilline, 10.000 pg / ml de streptomycine, et 25 pg / ml d&#39;amphotéricine B; Mediatech). </li><li> Détachez chaque chambre bioréacteur à partir du circuit d&#39;écoulement dans le bioréacteur. SMC semences (passage 4-6) à l&#39;échafaud avec une densité de 2x10 6 cellules / cm 2 par l&#39;injection de suspension avec seringue de 5 ml dans la lumière d&#39;échafaudages après avoir coupé deux abluminal (entrée) et luminales (sortie) des flux. </li><li> Mettez toutes les chambres de bioréacteur dans l&#39;incubateur d&#39;hybridation à 37 ° C et les faire tourner à 2 tours pendant 4 h pour permettre aux cellules de manière uniforme se répandre dans l&#39;échafaudage. </li><li> Sortez chambres bioréacteur de l&#39;hybridation incubateur rattacher leur départ du circuit du bioréacteur dans la hotte. Transférez tous les système de bioréacteur en incubateur de culture cellulaire. </li><li> Raccordez le tuyau de la pompe (diamètre intérieur = 1,6 mm) pour le cartilage de la pompe péristaltique et charger milieu de culture frais dans le réservoir. Démarrer la perfusion à travers les murs (luminal au abluminal) à 1,0 ml / min pendant 15 min suivi par le flux luminal seulement. </li><li> Augmenter le débit et la pression graduellement de 1,0 ml / min (stress de cisaillement luminal: 1,1 dynes / cm 2) et 20 mmHg du jour 1 au 14,2 ml / min (15,3 dynes / cm 2) et 120 mmHg à 21 jours, respectivement. Changer le tuyau de la pompe (diamètre intérieur = 3,2 mm) au jour 4 et le support une fois par semaine. </li></ol> 4. La récolte de tissus et de préparation des échantillons pour l&#39;analyse de <ol><li> Après culture de 21 jours, arrêter la pompe et les tuyaux de serrage (entrée et sortie) du réservoir à moyen terme. Détachez le tuyau de la pompe à partir du cartilage de pompe péristaltique et système de bioréacteur de transfert dans le capot. </li><li> Pince d&#39;entrée et de sortie de tuyaux de chaque chambre bioréacteur et le détacher de la boucle d&#39;écoulement. Ouvrez la tubulure d&#39;entrée et de préparer une boîte de Petri à la tubulure de sortie pour recueillir milieu de culture à l&#39;intérieur du tube en polycarbonate. Ouvrez le tube de sortie lentement et éliminer le milieu de la chambre. </li><li> Détachez une aiguille de calibre abluminal et silicone luminale de la chambre et détacher les plaques d&#39;aluminium en libérant vis de pouce. Retirer le tube de polycarbonate et de détacher un bout de tissu construire à partir de la tubulure de PTFE. </li><li> Préparez une boîte de Petri remplie de 10 ml de PBS et de détacher l&#39;autre extrémité de la construction du tube PTFE. Mettez de construire dans le PBS et rincer trois fois. </li><li> Couper le construire avec une lame de rasoir que de 5 mm de longueur. Congelez au congélateur à -80 ° C pour le dosage biochimique ou le transférer à 15 tube de centrifugeuse ml remplie avec 5 ml de milieu frais pour les tests mécaniques ou congeler s&#39;enclenchent dans le Tissue-Tek composé température optimale de coupe (Sakura Finetek Inc, Torrance, CA ) pour l&#39;histologie / immunoflucoloration orescence. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Les échafaudages tubulaires PGS ont été fabriqués en utilisant des élastomères biodégradables selon la méthode de fusion du sel (Fig. 1A). Chaque chambre de bioréacteur à condition d&#39;échafaudages avec des flux à la fois luminale et abluminal et pourrait être détaché comme une unité distincte d&#39;une boucle d&#39;écoulement principal (Fig. 1B). Bioréacteur système a été conçu pour la culture des échafaudages quatre à la fois par le contrôle et la surveillance des flux ainsi que la pression (Fig. 1C et D). Schéma de la culture a été bioréacteur Fig. 2. Après le semis SMC, chaque chambre bioréacteur a été tourné à 37 ° C pendant 4 h pour distribuer des cellules de manière uniforme dans le lumen de l&#39;échafaudage. Et puis, le flux pulsatile a été appliquée à des échafaudages jusqu&#39;au jour 14 avec le débit en augmentant progressivement (figure 2A) et de pression (figure 2B). Après 14 jours, débit et la pression reste constante jusqu&#39;à la fin de la culture (jour 21). Morphologie de la surface de l&#39;échafaud PGS a été examinée par microscopie électronique à balayage (MEB). Microscopie électronique à balayage a montré que échafaudage avait murale compatibles épaisseurs (539 ± 18 um) (Fig. 3A) et répartis au hasard macro-et micro-pores sur la surface luminale (figure 3B). Paramètres morphométriques de l&#39;échafaud a été mesuré à partir de microtomographie (micro-CT) et l&#39;analyse d&#39;imagerie. Taille moyenne des pores est de 23,3 ± 3,9 um et l&#39;interconnectivité des pores est de 99,4 ± 0,62%, ce qui signifie que tous les pores sont totalement interconnectés dans échafaud. Porosité mesurée par le déplacement d&#39;éthanol est de 75,6 ± 2,7%. La morphologie cellulaire de la construction PGS a été examinée par MEB (Fig. 4). SMC multicouches complètement recouvert la surface luminale et ils ont été orienté perpendiculairement à la direction du flux. Ces résultats montrent que le conditionnement mécanique de bioréacteur flux pulsatile soutient l&#39;orientation SMC dans l&#39;échafaud. La présence de la matrice extracellulaire (ECM) et de fibres élastiques ont été examinés par coloration H &amp; E et d&#39;élastine autofluorescence (fig. 5). Coloration H &amp; E a démontré que les cellules et les protéines ECM complètement couvert de la lumière du PGS construire. L&#39;élastine autofluorescence ont également montré circonférentiellement organisée fibres élastiques à la surface luminale de la construction. Production de protéines ECM dans les constructions PGS ont été mesurés à partir des dosages biochimiques. L&#39;élastine insoluble et le contenu de collagène ont été de 20,2 ± 9,1 pg / mg de tissu et de 6,3 ± 1,9 pg / mg de tissu, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Échafaudage de fabrication et système de bioréacteur. (A) Schéma d&#39;échafaudage tubulaire fabrication. (B) chambre de bioréacteur. Les échafaudages ont été connectés au tube PTFE, placé dans le tube en polycarbonate, et fixés par des bouchons en caoutchouc de silicone et des plaques en alliage d&#39;aluminium. Chaque chambre dispose de deux voies d&#39;écoulement: flux luminal (par un tube de silicone) et abluminal (par aiguille de la jauge). Système de bioréacteur (C) placé à l&#39;intérieur de l&#39;incubateur. Il comprend réservoir moyennes, le module de pompe péristaltique, l&#39;échangeur de gaz, des capteurs de pression, deux collecteurs (haut et bas), et le pointeau. (D) système de bioréacteur placé à l&#39;extérieur de l&#39;incubateur. Il inclut de surveiller la pression, l&#39;unité de contrôle de flux, système d&#39;acquisition de données, et l&#39;ordinateur. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Schéma de la culture bioréacteur. (A) du protocole de la Culture. (B) appliquée profils de pression à chaque point de temps (jour 1, 4, 7 et 14). <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Morphologie de la surface de l&#39;échafaud PGS. (A) de la Croix-section. (B) Lumen. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. La morphologie cellulaire de l&#39;ES construire. (A) Lumen. (B) Coupe transversale de 45 coupés °. Les flèches dans les deux chiffres représentent le sens d&#39;écoulement. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Figure 5. Histologie et d&#39;élastine autofluorescence des PGS construire. (A) coloration H &amp; E. (B) autofluorescence élastine correspondant. L: lumière. Grossissement: 40X. Barre d&#39;échelle: 50 um.

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La technique de fabrication en utilisant un élastomère biodégradable décrit ici a plusieurs caractéristiques. (1) Nous avons utilisé l&#39;acide hyaluronique (HA) comme un agent de démoulage. Depuis HA est soluble dans l&#39;eau, un échafaudage a été facilement libérée du moule en verre après le trempage dans l&#39;eau. Dans ce rapport, nous avons utilisé 1,0 pds / vol% de la solution HA parce que la concentration est faible (&lt;0,5 pds / vol%) de la solution n&#39;est pas visqueux et s&#39;écoule si vite quand nous la verser sur le dessus du tube de verre. Pour solution HA robe uniformément, nous avons renversé sur le tube de verre lorsque la solution a volé bas au fond du tube et répété cette étape. Ce revêtement HA est un essentiel à notre procédé de fabrication pour la libération des échafaudages finale. (2) Nous avons utilisé thermorétractable (SH) douille pour le maintien des sels dans les tubes de verre. Depuis sels ont été denses dans l&#39;espace entre la paroi interne du tube et le manchon de verre SH, SH manches conservé après le retrait des sels mandrin et anneau de PTFE dans le fond du tube. Nous pourrions supprimer manches HS facilement en mettant le moule dans un four à 120 ° C pendant 5 min, puis obtenir des modèles de sel tubulaire. (3) Nous avons utilisé la méthode de fusion du sel. Il est bien connu que la méthode de fusion du sel peut améliorer l&#39;interconnectivité des pores et les propriétés mécaniques en faisant varier le temps de fusion 10. Par ailleurs, depuis que nous avons utilisé PGS, les macro-pores ont été produits par les particules de sel pendant le processus de lixiviation, tandis que les micro-pores étaient probablement généré par la vapeur du glycérol formé lors de PGS guérir comme nous l&#39;avons décrit précédemment 11. Ainsi, cette méthode a un potentiel pour fabriquer des échafaudages tubulaires poreuses avec des macro-et micro-structures différentes en faisant varier des particules de sel ainsi que PGS guérir condition. Le conditionnement mécanique du bioréacteur a fourni perfusion flux pulsatile (moyenne maximale de débit = 14 ml / min, la contrainte de cisaillement maximale = 15,3 dynes / cm 2, fréquence = 0,5 à 1,7 Hz) et physiologiquement pertinents de pression avec l&#39;échafaudage PGS, qui a conduit à la croissance de SMC et de l&#39;orientation (Fig. 4). Ces résultats sont cohérents avec les études antérieures des rapports cycliques qui s&#39;étendent à cette fréquence et la contrainte de cisaillement augmente la prolifération SMC 12, et la production de protéines ECM 13,14. En plus de la croissance de SMC et de l&#39;orientation, de construire PGS a appuyé la production de protéines ECM, surtout circonférentiellement organisée fibres élastiques (fig. 5) dans les 3 semaines de culture dans le bioréacteur. Certaines études utilisant un échafaudage en élastomère comme une construction de faible diamètre artériel ont démontré une résistance mécanique et la pression d&#39;éclatement comparable à artères natives 15, et l&#39;intégration rapide de SMC dans les échafaudages conformes à l&#39;aide de spinner flacon 16,17, tandis qu&#39;aucune fibres élastiques ont été trouvés dans ces constructions. Nos résultats suggèrent que la distension radiale cyclique du bioréacteur améliorée transduction du signal mécanique plus efficacement à SMC de PGS échafaudage, qui a probablement contribué à l&#39;élastine synthèse et d&#39;organisation. Depuis SMC vasculaires ont été les seules cellules qui produit des protéines ECM dans notre approche, l&#39;endothélium quiescent et d&#39;améliorer la résistance mécanique sont nécessaires pour développer une clinique réussie de petit diamètre construit artérielle. Nous avons signalé que les cellules endothéliales co-cultivées avec SMC a généré une monocouche confluente et soutenu l&#39;expression des protéines phénotype dans nos conditions de culture et le conditionnement mécanique 9. Par conséquent, la base de notre approche décrite ici, la modification des conditions d&#39;expérimentation de co-culture serait une prochaine étape pour améliorer les fonctions de constructions et de générer résultante non thrombogène, robuste et conforme artérielle similaire à construire des artères natives.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Le sel de sodium d&#39;acide hyaluronique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H7630 </td></tr><tr><td> Tétrahydrofurane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td></tr><tr><td> MCDB 131 </td><td> Mediatech </td><td> 15 à 100-CV </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin </td><td> Lonza </td><td> BW14-502F </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Mediatech </td><td> 25 à 005-CV </td></tr><tr><td> L&#39;acide ascorbique </td><td> Fisher Scientific </td><td> A62-500 </td></tr><tr><td> Antibiotiques antimycosiques solution </td><td> Mediatech </td><td> 30 à 004-CI </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS) </td><td> Mediatech </td><td> 21 à 031-CV </td></tr><tr><td> Tissue-Tek composé température optimale de coupe, 4583 </td><td> Sakura Finetek </td><td> 25608-930 </td></tr></tbody></table>

elastomeric pgs scaffolds in arterial tissue engineering

Les maladies cardiovasculaires sont l&#39;une des principales causes de mortalité aux Etats-Unis et surtout, de maladie coronarienne augmente avec une population vieillissante et une augmentation de l&#39;obésité. Actuellement, un pontage utilisant des navires autologues, des allogreffes, et greffons synthétiques sont connus en tant que couramment utilisé pour des substituts artériels 2. Toutefois, ces greffes ont des applications limitées lors d&#39;un diamètre intérieur des artères est inférieure à 6 mm en raison de la faible disponibilité, des complications thrombotiques, l&#39;inadéquation de conformité, et la fin de l&#39;hyperplasie intimale 3,4. Pour surmonter ces limitations, l&#39;ingénierie tissulaire a été appliquée avec succès comme une alternative prometteuse pour développer les constructions de petit diamètre qui sont des artères non thrombogène, robuste et conforme. Plusieurs études antérieures ont développé des constructions de faible diamètre artériel avec tri-lamellaire structure, d&#39;excellentes propriétés mécaniques et de la pression d&#39;éclatement comparables à 5,6 artères natives. Bien résistance à la traction élevée et une pression d&#39;éclatement en augmentant la production de collagène à partir d&#39;un matériau rigide ou une feuille de cellules échafaudage, ces constructions avaient encore la production d&#39;élastine et de faible conformité, qui est un problème majeur pour provoquer échec de la greffe après l&#39;implantation. Compte tenu de ces enjeux, nous avons supposé que l&#39;élastomère biomatériau combiné avec climatisation mécanique serait de fournir l&#39;élasticité et la conduite des signaux mécaniques plus efficacement aux cellules vasculaires, qui augmentent la production de matrice extracellulaire et de soutenir l&#39;orientation cellulaire. L&#39;objectif de ce rapport est de présenter une technique de fabrication d&#39;échafaudages poreux tubulaire et d&#39;une climatisation mécanique dynamique pour les appliquer à l&#39;ingénierie des tissus artériels. Nous avons utilisé un élastomère biodégradable, le poly (sébaçate de glycérol) (PGS) 7 pour la fabrication d&#39;échafaudages tubulaires poreuses de la méthode de fusion du sel. Adulte cellules primaires babouin musculaires lisses (SMC) ont été ensemencées sur la lumière d&#39;échafaudages, qui en culture dans notre bioréacteur de flux pulsatile conçus pour 3 semaines. Échafaudages PGS a une épaisseur uniforme et répartis au hasard macro-et micro-pores. Climatisation mécanique de bioréacteur flux pulsatile soutenue SMC orientation et améliorée ECM de production dans des échafaudages. Ces résultats suggèrent que des échafaudages en élastomère et le conditionnement mécanique de la culture bioréacteur peut être une méthode prometteuse pour l&#39;ingénierie tissulaire artérielle.

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Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

PGS élastomère échafaudages avec des cellules musculaires lisses vasculaires en culture dans un bioréacteur flux pulsatile peut conduire à prometteurs de petit diamètre artériel construit avec une production ECM natif dans une période relativement courte de la culture.

PGS élastomère échafaudages en génie tissulaire artérielle

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

elastomeric-pgs-scaffolds-in-arterial-tissue-engineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.5K vues.  University of Pittsburgh. PGS élastomère échafaudages avec des cellules musculaires lisses vasculaires en culture dans un bioréacteur flux pulsatile peut conduire à prometteurs de petit diamètre artériel construit avec une production ECM natif dans une période relativement courte de la culture.

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Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

Génie tissulaire de l&#39;intestin dans un modèle murin

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

Gradient de densité multicouche de polymérisation (DGMP): une nouvelle technique pour la création multi-compartiment, échafaudages personnalisables pour l&#39;ingénierie tissulaire

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capillaire de travail lithographie pour l&#39;ingénierie tissulaire cardiaque

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

génie tissulaire d&#39;un être humain 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Système de tumeur de test

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Électrofilé Fort échafaudages de poly (glycérol-dodécanedioate) pour l&#39;ingénierie des tissus neuronaux De Souris cellules souches embryonnaires

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microenvironnements sandwich à exploiter cellulaires / Interactions matérielles

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Épithéliale repeuplement cellulaire et préparation des rongeurs matrice extracellulaire échafaudages pour le développement de tissu rénal

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Génie tissulaire par Intrinsic vascularisation dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Chambre Ingénierie

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...