Le financement du BBSRC est aimablement reconnu (numéro de subvention BB H011293 / 1).

Vue d&#39;ensemble Section 1 décrit la préparation de pH nanocapteurs sensibles et la caractérisation de la réponse de nanocapteurs à pH en utilisant la spectrométrie de fluorescence et leur taille au MEB. Section 2 décrit la préparation d&#39;échafaudages polymères électrofilées et caractérisation de leur morphologie et de la taille par MEB. Section 2 décrit également la préparation d&#39;échafaudages d&#39;auto-déclaration qui sont échafaudages électrofilées avec l&#39;inclusion des pH nanocapteurs sensibles. Les échafaudages auto-déclaration qui en résultent sont caractérisés par SEM d&#39;évaluer si des changements morphologiques dans les fibres électrofilées s&#39;est produite. La fluorescence à partir des échafaudages d&#39;auto-vérification qui résultent des nanocapteurs intégrés est évaluée par microscopie confocale. La section 3 décrit la culture de cellules sur l&#39;échafaud électrofilé et l&#39;échafaud de l&#39;auto-déclaration. Les échafaudages sont d&#39;abord stérilisés en préparation pour la culture cellulaire après quoi les échafaudages sont évaluées afin de déterminer si la stérilisation et la culture de cellules influent sur la capacité de la fluorescence des échafaudages d&#39;auto-vérification. Le protocole décrit également la livraison de nanocapteurs à des cellules qui sont cultivées sur des échafaudages électrofilées. Lysotracker colorant est utilisé pour s&#39;assurer que les nanocapteurs n&#39;ont pas été prises en compartiments acides cellulaires. Une. Préparation et analyse de pH Responsive nanocapteurs Sol-gel 1.1 Préparation des réactifs pH nanocapteurs Sol-gel Remarque: Cette préparation doit être effectuée dans une hotte de laboratoire. <ol><li> Préparer les fluorophores destiné à être utilisé dans le cadre des nanocapteurs de pH par dissolution de 5 - (et-6)-carboxyfluorescéine, ester de succinimidyle (FAM-SE) (1,5 mg) dans du diméthylformamide (DMF) (1 ml) dans un ballon à fond rond et 6-carboxytétraméthylrhodamine , ester de succinimidyle (TAMRA-SE) (1,5 mg) dans du DMF (1 ml) dans un autre ballon à fond rond.Ajouter 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) (1,5 ml) à chaque flacon et agiter sous une atmosphère d&#39;azote sec (21 ° C) pendant 24 heures dans l&#39;obscurité dire envelopper les échantillons dans du papier. </li><li> Ajouter à la fois des colorants ci-dessus (250 ul) à un mélange d&#39;éthanol (6 ml) et de l&#39;hydroxyde d&#39;ammonium (30% en poids, 4 ml) contenu dans un ballon à fond rond et on agite pendant 1 heure (21 ° C). </li><li> Ajouter lentement le tétraéthylorthosilicate (TEOS) (0,5 ml) au mélange, continuer l&#39;agitation pendant encore 2 h. Le mélange va devenir trouble. Les nanocapteurs peuvent être recueillies par evaporation rotative. Nanocapteurs peuvent être stockées dans un flacon en verre à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. ATTENTION: la manipulation ultérieure des nanocapteurs dans leur forme sèche doit être effectuée dans une hotte ou dans le cas de les peser la balance doit être fermée, par exemple dans un Weighsafe. </li></ol> 1.2 Réponse nanocapteur à pH <ol><li> Préparer les solutions tampons de phosphate de Sorensen allant de pH 5,5 à 8,0 par mixing ratios spécifiques de phosphate monosodique (0,2 M) et de phosphate disodique (0,2 M) de solutions mères. Vérifier le pH final à l&#39;aide d&#39;un pH-mètre. Faire les ajustements mineurs au pH à l&#39;aide d&#39;hydroxyde de sodium (NaOH) (4 M) ou de l&#39;acide chlorhydrique (HCl) (2 M). </li><li> Suspendre les nanocapteurs de pH dans les tampons de pH (5 mg / ml) en maintenant tout d&#39;abord la cuve contenant la solution de nanocapteur au vortex pendant 3 minutes, puis l&#39;immersion du récipient dans un appareil à ultrasons jusqu&#39;à ce que la solution devienne trouble (environ 5 min). Répétez ces étapes pour suspendre totalement les nanocapteurs en solution. </li><li> Placez la première solution dans une cuvette optique et utiliser des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation de 488 nm pour 5 - (et 6)-carboxyfluorescéine (FAM) et 568 nm pour 6 carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA). Recueillir les longueurs d&#39;onde d&#39;émission à 500-530 nm pour FAM et TAMRA 558 à 580 nm pour l&#39;aide d&#39;un spectromètre à fluorescence. </li><li> Changer les solutions dans la cuve optique de sorte que le pH peut être observée à un pH différent et continuer collecting les spectres d&#39;émission. </li><li> Calculer le rapport des maxima d&#39;émission produite à chaque valeur de pH pour produire une courbe d&#39;étalonnage. </li></ol> 1.3 SEM de nanocapteurs <ol><li> Placez un échantillon des nanocapteurs sur un microscope électronique à talon recouvert de carbone et de projections manteau d&#39;or pendant 5 min sous atmosphère d&#39;argon. </li><li> Observer par microscopie électronique à balayage (MEB). Au cours de l&#39;imagerie de régler la distance de travail, de la tension et de l&#39;agrandissement d&#39;électrons pour réduire au minimum la charge (figure 1). </li></ol> 2. Préparation et analyse de PLGA échafaudages 2.1 Électrofilage PLGA échafaudages <ol><li> Dans une hotte dissoudre le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) dans du dichlorométhane (DCM) (20% (w / w)) avec le formiate de pyridinium (PF) (1% (p / p)). Placer la solution dans une seringue de 10 ml avec une aiguille émoussée de remplissage 18 G et en toute sécurité, en forme d&#39;une pompe à seringue. </li><li> Distance de la pointe de l&#39;aiguille 20 cm à partir d&#39;un 20cm x 15 cm plateau de collecte d&#39;aluminium. </li><li> Attachez l&#39;électrode d&#39;une alimentation électrique à haute tension à l&#39;extrémité de la seringue et de la terre à la plaque d&#39;aluminium de collecte. ATTENTION: Il faut faire attention que la haute tension est utilisé à savoir toujours couper l&#39;alimentation électrique avant de manipuler un des équipements de électrofilature. </li><li> Livrer la solution en utilisant un débit constant de 3,5 m / h à 12 kV pendant 2 heures. Électrofilage utilisant ces conditions donnera une profondeur d&#39;environ 60 um d&#39;échafaudage. </li><li> Laissez l&#39;échafaud dans une hotte pendant 24 heures pour permettre résidu de solvant s&#39;évapore. </li></ol> 2.2 Électrofilage pH Responsive PLGA échafaudages <ol><li> Préparer échafaudages incorporant pH nanocapteurs sensibles comme décrit dans la section 2.1, mais avec la modification de l&#39;ajout de nanocapteurs pour la solution de polymère (5 mg / ml). Suspendre les nanocapteurs dans la solution de PLGA avec l&#39;aide d&#39;ultrasons (environ 5 min) avant<html> à placer dans une seringue de 10 mL. </li></ol> 2.3 SEM de PLGA Échafaudages Échafaudages et pH Responsive <ol><li> Placez un échantillon de l&#39;échafaud PLGA ou pH échafaud sensible sur un électron revêtu microscope talon de carbone et procéder comme décrit pour SEM de nanocapteurs (Figure 1). </li></ol> 2.4 Étalonnage du pH Échafaudages Responsive <ol><li> Placez un échantillon de pH échafaud sensible dans une plaque de culture de 35 mm et plonger dans des solutions tampons appropriées. </li><li> Sur un microscope confocal en utilisant un laser à argon de 488 nm pour exciter la FAM et un laser à krypton 568 nm pour exciter le TAMRA à l&#39;intérieur des nanocapteurs. Observer l&#39;émission de fluorescence pour pH échafaudages sensibles à 500-530 nm pour FAM et 558-580 nm pour TAMRA. (Figure 2). Utilisation balayage séquentiel pour éviter la collecte de longueurs d&#39;onde d&#39;excitation. </li></ol> 3. Culture cellulaire sur PLGA échafaudages et pH Responsive PLGA échafaudages ntent &quot;&gt; Note: Ce qui suit doit être effectué dans une armoire de culture cellulaire. 3.1 Préparation de PLGA échafaudages pour la culture cellulaire <ol><li> Couper les PLGA ou pH sensibles échafaudages PLGA dans 2 cm 2 pièces. </li><li> Stériliser par irradiation d&#39;échafaudages avec des rayons ultraviolets (UV), à une distance de 8 cm pour 15 min de chaque côté. </li><li> Transférer les échafaudages sur une plaque de culture de 12 puits et placer un anneau en acier sur le dessus. Ajouter une solution de pénicilline / streptomycine (5% v / v) dans du tampon phosphate salin (PBS) à l&#39;intérieur et à l&#39;extérieur de la bague en acier, laisser incuber pendant une nuit (37 ° C, 5% CO 2). Notez l&#39;anneau d&#39;acier a été fabriqué à l&#39;Université de Nottingham et a les dimensions suivantes: diamètre extérieur de 2 cm, 1 cm de diamètre intérieur, 1 cm de profondeur. </li><li> Retirer la solution de stérilisation et de lavage avec du PBS. </li><li> Ajouter milieux de culture cellulaire à l&#39;intérieur (500 pl) et à l&#39;extérieur (500 ul) de la bague d&#39;acier, placer dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt;), tout en préparant une suspension de cellules. </li><li> Préparer une suspension de cellules et effectuer un comptage des cellules en utilisant un dosage d&#39;exclusion au bleu Trypan. </li><li> Créer une suspension de cellules pour obtenir un nombre de cellules de 1 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Retirez le support de l&#39;intérieur et à l&#39;extérieur de la bague d&#39;acier. </li><li> Remplacer préchauffé avec des milieux de culture cellulaire à l&#39;extérieur de la bague en acier (1 m). </li><li> Ajouter 300 ul de la suspension de cellules à l&#39;intérieur de la bague en acier - plaque de roche vers l&#39;arrière et vers l&#39;avant en douceur pour distribuer des cellules. </li><li> Placer la plaque de culture cellulaire dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2) - la fixation des cellules aurait dû avoir lieu dans les 24 heures, mais continuer la culture pour aussi longtemps que l&#39;expérience nécessite - rafraîchissant les médias tous les 2-3 jours. </li></ol> 3.2 nanocapteur livraison de cellules cultivées sur PLGA Échafaudages <ol><li> cellules de semences donnant sur PLGA échafaud, comme décrit dans la section 3.1. Pour cette étude, un échafaudage PLGA vierge (non containanocapteurs ning) a été utilisé en raison du chevauchement de l&#39;émission de fluorescence lors de l&#39;imagerie. </li><li> Placez la cellule échafaudage tête de série dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2) pendant 72 heures pour permettre aux cellules de se développer et migrent à travers l&#39;échafaud avant nanocapteur livraison. </li><li> Avant nanocapteur livraison laver les cellules avec du PBS et changer le support du milieu de culture standard pour des médias libres antibiotiques et de sérum, incuber (37 ° C, 5% CO 2) pendant 1 heure. Remarque: les milieux de culture standard pour les cellules 3T3 comprend de Eagle modifié de milieu de Dulbecco additionné de sérum de veau foetal (10% (v / v)), solution de L-glutamine (2 mM), de pénicilline / streptomycine (1% (v / v)) . </li><li> Au cours de la période d&#39;incubation préparer le complexe nanocapteur-liposomes par sonication brièvement nanocapteurs (5 mg) avec Optimem (50 pi) pour créer la solution A. </li><li> Créer une solution B en ajoutant Lipofectamine 2000 (5 pi) de Optimem (45 ul), incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Ajouter solutionA à la solution B, incuber à température ambiante pendant 20 min pour former une solution C, qui est le complexe liposome-nanocapteur. </li><li> Ajouter la solution C (100 ul) aux cellules et incuber (37 ° C, 5% CO2) pendant 3 heures. </li><li> Retirez les échafaudages ensemencés de cellules de l&#39;incubateur, les médias aspirer et laver deux fois avec du PBS avant d&#39;ajouter PBS (1 ml) pour permettre la visualisation des cellules vivantes par microscopie confocale. Note: Le PBS a été utilisé dans ce protocole pour que l&#39;indicateur rouge de phénol présent dans les milieux de culture cellulaire n&#39;a pas causé autofluorescence et aussi parce qu&#39;un étalonnage à différents pH a été effectuée. Cependant phénol médias libres rouges pourraient être utilisés pour analyse à plus long terme de cultures cellulaires. </li><li> Plonger la cellule échafaudage tête de série dans les tampons de pH différents et surveiller la réponse des nanocapteurs associés aux cellules. </li><li> Surveiller le pHi par la détermination du rapport des intensités de fluorescence de la FAM et TAMRA par l&#39;observation de la fluorescence en utilisant la microscopie confocale (Figure 3). </li></ol> 3.3 nanocapteur Situation dans les cellules de mammifères <ol><li> Incuber les cellules avec nanocapteurs ne contenant que le colorant FAM comme décrit dans la section 3.2 (c&#39;est parce que l&#39;émission de fluorescence de TAMRA est dans la même région spectrale que le Lysotracker rouge). Préparer ces nanocapteurs comme décrit dans la section 1.1, mais avec l&#39;omission de la préparation et en ajoutant TAMRA. </li><li> Après la période de livraison nanocapteur diluer la solution mère Lysotracker Rouge à 50 nM. </li><li> Ajouter une fraction aliquote de la solution diluée (2 ul) de cellules cultivées sur des échafaudages de PLGA. </li><li> Incuber les cellules avec Lysotracker rouge pendant 1 heure (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Après la période d&#39;incubation, retirer le support et laver les cellules deux fois avec du PBS (pH 7,4) avant de changer le média de PBS (pH 7,4) (2 ml) en vue de la visualisation en utilisant la microscopie confocale. Remarque: phénol médias libres rouges pourraient être utilisés à la place de PBS. </li><li> Ajouter le colorant nucléaire Draq5 au PBS de sorte que la concentration finale est de 5 uM et incuber avec les cellules pendant 3 min (à 37 ° C, 5% CO 2). Il n&#39;est pas nécessaire de changer les médias après la période d&#39;incubation avec DRAQ5. </li><li> Utilisez un laser 488 nm de l&#39;argon pour exciter le FAM ne nanocapteurs, un laser krypton 568 nm pour exciter le Lysotracker rouge et 633 nm hélium / néon laser pour exciter le chromophore DRAQ5 et observer la fluorescence à 500-530 nm, 580-600 nm, 650 -750 nm, respectivement (Figure 3). Utilisation balayage séquentiel pour éviter la collecte de longueurs d&#39;onde d&#39;excitation. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

L&#39;ingénierie tissulaire aspire à créer des substituts biologiques pouvant être utilisé à la fois in vivo comme des modèles in vitro de tissus et dans la thérapie de remplacement de tissu à réparer, de remplacer, de maintenir ou d&#39;améliorer la fonction d&#39;un tissu ou d&#39;un organe particulier. Substituts synthétiques ont été utilisés pendant de nombreuses années pour remplacer ou réparer des tissus de l&#39;aide, mais ceux-ci échouent souvent en raison de la faible intégr...

Une stratégie clé dans l&#39;ingénierie tissulaire est l&#39;utilisation de matériaux biocompatibles pour fabriquer des échafaudages dont la morphologie ressemble le tissu qu&#39;il va remplacer et est également capable de soutenir la croissance et la fonction 1,2 cellule. La matrice de support fournit un support mécanique en permettant la fixation des cellules et la prolifération permet encore de la migration des cellules à travers les interstices d&#39;une construction cellulaire 3D. L&#39;échafaudage doit également permettre le transport de masse de nutriments cellulaires et pas inhiber l&#39;enlèvement des déchets métaboliques 3. Électrofilage a émergé comme un procédé prometteur pour la fabrication d&#39;échafaudages polymères capables de soutenir la croissance cellulaire de 4-6. Les fibres électrofilées non tissées produites sont appropriées pour la croissance cellulaire car elles sont souvent poreuses et permettent l&#39;interaction cellule-cellule, ainsi que la migration des cellules à travers les interstices d&#39;une construction 3D cellulaire 7. Il est important de surveiller la viabilité des cellules au cours de til période de culture et de faire en sorte que la viabilité cellulaire est maintenue tout au long de l&#39;ensemble de la construction 3D. Par exemple, des conditions de culture, tels que l&#39;oxygène et le pH nécessitent un contrôle soigneux, que les gradients de concentration de l&#39;analyte peut exister dans le produit de construction 3D. Bioréacteurs ou des systèmes de perfusion peuvent être utilisés pour mimer les conditions in vivo de débit interstitiel et en tant que résultat de l&#39;augmentation transfert des nutriments et l&#39;élimination des déchets du métabolisme 8. La question de savoir si ces systèmes sont en s&#39;assurant des conditions de micro constants peut être adressée en évaluant le microenvironnement cellulaire en temps réel. Les principaux paramètres de micro-environnement qui pourraient être surveillés en temps réel comprennent: la température, la composition chimique du support de cellules, la concentration de l&#39;oxygène dissous et le gaz carbonique, le pH et l&#39;humidité. Parmi ces paramètres, la température peut être plus facilement contrôlée en utilisant des sondes in situ. Méthodes de suivi des mesures énumérées restants couramment dansenlèvement de volve d&#39;une aliquote d&#39;échantillonnage et donc perturbent la culture cellulaire et d&#39;augmenter le risque de contamination. , Les méthodes en temps réel en continu sont recherchés. Méthodes actuelles de surveillance s&#39;appuient généralement sur des instruments qui sondent physiquement la construction cellulaire comme un moniteur de pH ou de la sonde d&#39;oxygène. Cependant, ces méthodes intrusives peuvent endommager la construction cellulaire et perturber l&#39;expérience en cours. Surveillance non invasive des concentrations de l&#39;analyte dans la construction 3D pourrait permettre un suivi en temps réel des différents aspects environnementaux tels que l&#39;épuisement des nutriments 9. Cela permettrait une évaluation de l&#39;apport de nutriments à l&#39;intérieur des régions plus profondes de la structure et déterminer si les déchets métaboliques a été éliminé efficacement 10,11. Les systèmes qui tentent de répondre à la question de l&#39;invasivité impliquent généralement l&#39;utilisation d&#39;une chambre de perfusion qui passe à travers un milieu de culture à la fois du récipient de culture et à des capteurs externes pour surveiller le pH, l&#39;oxygène et le glucose, 12. Lare un intérêt croissant dans le développement de capteurs qui peuvent être directement intégrées dans le récipient de culture qui ne nécessitent pas l&#39;élimination d&#39;une partie aliquote de l&#39;échantillonnage et en tant que tel serait d&#39;assurer une surveillance in situ. Pour remédier à ces lacunes pour in situ et de la surveillance non invasive des conditions micro-environnementales que nous avons incorporés analyte nanocapteurs sensibles dans les échafaudages électrofilées à produire des échafaudages d&#39;auto-déclaration 13. Les échafaudages qui agissent dispositifs comme de détection par contrôle de l&#39;activité de fluorescence ont été préparés préalablement, où le dispositif de détection est soit l&#39;échafaudage polymérique réelle créée par électrofilage ou par l&#39;utilisation d&#39;un colorant sensible à l&#39;analyte, qui est incorporé dans le polymère avant la formation de l&#39;échafaudage 14,15 . Cependant, ces dispositifs de détection ont le potentiel d&#39;améliorer les sorties optiques erronées causées par des interférences provenant d&#39;autres analytes possible. L&#39;utilisation d&#39;un dispositif de détection ratiométrique such que ceux préparés dans le protocole décrit détient le potentiel d&#39;éliminer ces effets indésirables possibles et apporter une réponse spécifique à l&#39;analyte en question. Les échafaudages électrofilées présentés ici ont été préparés à partir de poly co-polymère synthétique (acide lactique-co-glycolique) (PLGA), choisi en raison d&#39;avoir Food and Drug Administration (FDA), en raison de ses propriétés biodégradables et biocompatibles et une piste enregistrement de soutenir la croissance et la fonction des divers types de cellules 16 à 18. Les analytes quotientométrique nanocapteurs sensibles préparés sont sensibles au pH. Les nanocapteurs incorporent deux colorants fluorescents dans une matrice sol-gel biocompatible, où un colorant, FAM est sensible au pH et l&#39;autre, TAMRA agit comme étalon interne car il n&#39;est pas sensible aux pH. En outre, la fluorescence des deux FAM et TAMRA peut être analysé séparément car elles ne se chevauchent pas de manière significative. La détermination du rapport de la fluorescence de emission de deux colorants à des longueurs d&#39;onde spécifiques donne une réponse de pH indépendant d&#39;autres conditions environnementales. Les échafaudages d&#39;auto-déclaration pourraient permettre l&#39;évaluation de la répétition de pH in situ et en temps réel sans perturber le modèle 3D développé. Nous avons démontré que ces échafaudages sont capables de supporter la fixation et la prolifération cellulaire et restent sensibles à l&#39;analyte en question. La cinétique de sous-produits acides dans les constructions du génie reste peu étudié et en tant que tel en utilisant les réactifs pH échafaudages peuvent considérablement faciliter ces études 19. En outre, l&#39;utilisation des échafaudages d&#39;auto-déclaration pour les applications d&#39;ingénierie tissulaire présente la possibilité de comprendre, surveiller et optimiser la croissance de modèle constructions de tissu 3D in vitro, de manière non invasive et en temps réel. Les pH nanocapteurs sensibles ont également été livrés à l&#39;environnement intracellulaire de fibroblastes cultivés sur électrofilé scaffol PLGAds. Le ratio de l&#39;émission de fluorescence à partir des colorants ont été utilisés pour surveiller le pHi et comparée à un échafaudage nanocapteurs Incorporation de pH d&#39;auto-vérification. La livraison des nanocapteurs de cellules cultivées dans un environnement 3D peut permettre la surveillance de la concentration de substance à analyser en profondeur dans le produit d&#39;assemblage d&#39;une manière non destructive. Par conséquent nanocapteurs peuvent être un outil d&#39;imagerie viable pour évaluer de façon non destructive comportement des cellules tout au long de 3D construit permettant l&#39;analyse à long terme. La sélection de la concentration en analyte de cellules individuelles au sein d&#39;une construction 3D pourrait assurer qu&#39;ils reçoivent en nutriments et en oxygène des concentrations suffisantes. paramètres du procédé de surveillance pourraient aider dans le développement de techniques normalisées pour le transport de masse efficace de l&#39;oxygène et de nutriments. La livraison des nanocapteurs à l&#39;environnement intracellulaire et l&#39;incorporation de nanocapteurs dans échafaudages polymères pourrait être combinée à permettre l&#39;évaluation de la viabilité des cellules ainsi que la performance de l&#39;échafaudage dans const 3Dructs au cours du processus de croissance de tissu. Cela peut conduire à une meilleure connaissance de ces constructions et progresser la fabrication de produits de remplacement de tissus biologiques pertinents.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="481">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">32221</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Anhydrous dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">270547</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:137px;">35574</td>
			<td style="width:79px;">diluted to 30% (v/v) with pure water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">TEOS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">13190-3</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A3648</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1311</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1171</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate monobasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-0876</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaOH</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S8045</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T4174</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P0781</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D6046</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:137px;">Batch-213-101992</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G7513</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Optimem</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11058-021</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">LysoTracker Red</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">L-7528</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Draq5</td>
			<td style="width:71px;">Biostatus Ltd</td>
			<td style="width:137px;">DR50050</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DCM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">320269</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">TFA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T6508</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="211">
			<td height="211" style="height:211px;width:195px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica TCS-SP</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">UV light</td>
			<td style="width:71px;">UVLS28 UVP, USA</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Stirrer plate</td>
			<td style="width:71px;">SB161-3 Jencons-PLS</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:71px;">Jenway model 3510</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Rotary Evaporator</td>
			<td style="width:71px;">Buchi Rotary Evaporator R200</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Centrifuge (nanosensors)</td>
			<td style="width:71px;">Hermle Z300</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">Centrifuge (cell culture)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Whirlimixer Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Ultrasonicator</td>
			<td style="width:71px;">FB11021 Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Aluminum sheet</td>
			<td style="width:71px;">Nottingham University</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">35mm cell culture plate</td>
			<td style="width:71px;">Iwaki</td>
			<td style="width:137px;">3000035</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickenson</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">3T3 Fibroblast cells</td>
			<td style="width:71px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">PLGA</td>
			<td style="width:71px;">Lakeshore Biomaterials</td>
			<td>7525 DLG 7E</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pyridinium formate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P8535</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-reporting scaffolds for 3-dimensional cell culture

La culture de cellules en 3D sur des échafaudages appropriés est pensé pour mieux imiter le microenvironnement in vivo et augmenter les interactions cellule-cellule. La construction cellulaire 3D obtenu peut souvent être plus pertinent d&#39;étudier les événements moléculaires et interactions cellule-cellule que des expériences similaires étudiés en 2D. Pour créer des cultures 3D efficaces avec la viabilité cellulaire élevée tout au long de l&#39;échafaud les conditions de culture tels que l&#39;oxygène et le pH ont besoin d&#39;être soigneusement contrôlé que les gradients de concentration de l&#39;analyte peuvent exister tout au long de la construction 3D. Nous décrivons ici des procédés de préparation de pH biocompatibles adaptés nanocapteurs sol-gel et leur incorporation dans le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) échafaudages électrofilées ainsi que leur préparation ultérieure pour la culture de cellules de mammifères. Les échafaudages pH sensibles peuvent être utilisés comme outils pour déterminer microenvironnement pH dans une construction cellulaire 3D. En outre, nous détaillons la livraison de pH nanose sensiblensors à l&#39;environnement intracellulaire de cellules de mammifères dont la croissance a été soutenue par des échafaudages PLGA électrofilé. La localisation cytoplasmique des pH nanocapteurs sensibles peut être utilisé pour contrôler le pH intracellulaire (pHi) lors de l&#39;expérimentation en cours.

La distribution de taille des pH nanocapteurs sensibles préparés a été caractérisé par MEB, où la population de nanocapteurs imagées ont été mesurés et ont des dimensions nanométriques dans la gamme de 240 à 470 nm (figure 1A). La réalisation d&#39;un petit diamètre et assez petit est conforme à l&#39;aide de la méthode Stöber pour préparer des nanoparticules. Il a été trouvé que l&#39;utilisation d&#39;un environnement à pH basique au cours de la synthèse de nanoparticules I...

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Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

PH biocompatibles adaptés nanocapteurs sol-gel peuvent être incorporés dans le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) échafaudages électrofilées. Les échafaudages d&#39;auto-déclaration produits peuvent être utilisés pour la surveillance in situ des conditions micro-environnementales dans tout la culture de cellules sur l&#39;échafaud. Cela est bénéfique que la construction cellulaire 3D peut être contrôlé en temps réel sans perturber l&#39;expérience.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

self-reporting-scaffolds-for-3-dimensional-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K vues.  University of Nottingham.  PH biocompatibles adaptés nanocapteurs sol-gel peuvent être incorporés dans le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) échafaudages électrofilées. Les échafaudages d'auto-déclaration produits peuvent être utilisés pour la surveillance in situ des conditions micro-environnementales dans tout la culture de cellules sur l'échafaud. Cela est bénéfique que la construction cellulaire 3D peut être contrôlé en temps réel sans perturb...

Vidéo: Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS élastomère échafaudages en génie tissulaire artérielle

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Recherche

Bio-ingénierie

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Une méthode pour l&#39;encapsulation follicule ovarien et de la Culture dans un protéolytiquement dégradable 3 Système dimensionnelle

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

Polymères à mémoire de forme pour la Culture cellule active

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypiques de collagène I Dosage: Une plate-forme malléable pour évaluer le comportement des cellules dans un contexte 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Rotation systèmes de culture cellulaire de la culture de cellules humaines: les cellules du trophoblaste humain comme modèle

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Préparation de la 3D pour les applications de fibrine Échafaudages CULTURE DE CELLULES SOUCHES

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

La culture de cellules progénitrices neurales humaines dans un hydrogel en 3 dimensions Peptide auto-assemblage

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D hydrogel échafaudages pour articulaire chondrocytes Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Épithéliale repeuplement cellulaire et préparation des rongeurs matrice extracellulaire échafaudages pour le développement de tissu rénal

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Synthèse de cristaux liquides biocompatibles mousses élastomères comme échafaudages cellulaires pour les cultures de cellules spatiales 3D

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...