Ce travail a été soutenu par une subvention de projet Wellcome (078043/Z/05/Z) à ROJW

PARTIE A: haut débit croissance des cultures bactériennes. 1. Les bactéries se développer nuit dans 2 ml de milieu d&#39;auto-induction utilisant des plaques 24 puits <ol><li> Stériliser les plaques à 24 puits par micro-ondes. </li><li> Inoculer 1,5 ml de milieu d&#39;auto-induction (Nuit Moyen Express) fraîchement cultivés colonies bactériennes ou des stocks de glycérol congelés. Normalement, nous inoculer trois puits par mutant avec trois différentes colonies clonées. Réserve six puits pour les contrôles positifs et négatifs. Pour les contrôles positifs nous grandissons trois clones de type sauvage et pour les contrôles négatifs nous grandissons 2 clones qui ont été transformées avec un plasmide exprimant non. Vérifier la stérilisation suffisante de la plaque en laissant une ébauche et pour la commande à moyen seulement. </li><li> Cultiver les cellules pendant 18 heures à 37 ° C et sous agitation à 250 rpm. Nous utilisons lac inductible par BL21 (DE3) Rosetta 2 cellules. Moyen d&#39;auto-induction contient un mélange de glucose et de lactose. Les bactéries initialementse nourrissent de glucose et ensuite commencer à utiliser le lactose, ce qui induit également l&#39;expression des protéines recombinantes. </li><li> Retirez le couvercle et placez la plaque sur la plate-forme robotique. </li></ol> PARTIE B: Robotic purification de protéines recombinantes. 2. Préparer la plate-forme robotique <ol><li> Compenser le tampon de lavage constitué de 20 mM d&#39;imidazole, 0,1% de Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acétate, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, glycérol 10%, et le tampon d&#39;élution constitué par de 0,5 M d&#39;imidazole, 0,1% de Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acétate, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, glycérol 10%. Ces tampons seront utilisés pour laver les billes après que les protéines marquées ont été liés à eux, ou pour éluer les protéines à partir des billes, respectivement. </li><li> Maquillage du diluant bactérienne (100 ml d&#39;eau distillée avec 15 ul de réactif anti-mousse). Cette solution sera utiliséepour faire des dilutions des cultures bactériennes nuit de la densité optique (A600) mesures. La présence d&#39;anti-mousse dans le diluant d&#39;éviter la formation de bulles d&#39;air qui pourraient interférer avec les mesures de lecteur de plaques. </li><li> Faire remonter la solution de lyse composée de réactif FastBreak 10x, 2 lysonase pi par échantillon et 15 mM MgOAc 2. FastBreak contient un mélange de détergents et de sels qui dégradent les parois cellulaires des bactéries et de faciliter la libération des protéines intracellulaires. Lysonase est un mélange exclusif de lysozyme et une nucléase. Le lysozyme aide à perturber la paroi cellulaire et la nucléase digère les acides nucléiques bactériens libérés. </li><li> Facultatif: Préparez une solution 6 M de chlorhydrate de guanidine. Certaines protéines recombinantes ont tendance à coller aux aiguilles revêtus de téflon de pipetage. Les guanidine hydrochloride dénature les protéines et les solutions se lave plus efficacement que l&#39;eau qui est couramment utilisée pour rincer les conseils de pipetage robotique lavables après chaque mep. </li><li> Préparer la BCA (acide bicinchoninique) réactif quantification des protéines par une solution d&#39;acide bicinchoninique mélange (réactif A) et la solution de sulfate de cuivre (réactif B): réduire les liaisons peptidiques Cu 2 + à partir du CuSO 4 composant présent dans le réactif BCA de Cu 1 + lequel la quantité de Cu 1 + est proportionnelle au nombre de liaisons peptidiques présentes dans la solution. Dans une deuxième étape, deux molécules d&#39;acide bicinchoninique chélate Cu 1 + résultant en un changement d&#39;absorbance à 562 nm, ce qui entraîne une coloration pourpre. La réaction colorée est dépendante du temps et nécessite souvent plusieurs heures pour être définitive. Après que la couleur est stable pendant plusieurs heures. </li><li> Remplissez auges ou des plaques de la bonne taille et les placer dans leurs positions pré-affectées sur la plate-forme robotique. </li><li> Placer une plaque de 24 puits pour les déchets chlorhydrate de guanidine, deux claires plaques à 96 puits pour l&#39;OD 600 et les mesures d&#39;absorbance et un bleu plaque de 96 puits pour ee protéines purifiées sur leurs positions sur la plate-forme. Placer une plaque 96-puits profonds sur le support magnétique. </li><li> Diluer MagneHis Ni-particules qui se lient les protéines en formant des chélates avec leurs Ses mots-5-plis dans l&#39;eau distillée et de les remplir dans l&#39;unité de perles d&#39;agitation. Mettez l&#39;agitateur pour maintenir les billes en suspension. </li><li> Mettez la plate-forme robotique et rincer les aiguilles de pipetage pour plusieurs minutes pour éliminer les bulles d&#39;air qui seraient autrement interférer avec la précision de pipetage. Les aiguilles de pipetage réutilisables sont rincés entre les étapes de pipetage individuels. Alternativement, embouts jetables peuvent être utilisés. Toutes les étapes suivantes sont réalisées par robot. Le protocole robotique est disponible sur demande. </li></ol> 3. La croissance cellulaire est vérifiée en mesurant la DO600 <ol><li> 10 pl de culture d&#39;une nuit est dilué dans 90 ul de solution de diluant. </li><li> Mesurer la densité optique 600 afin de s&#39;assurer que les bactéries sont cultivées à des densités similaires(Figure 1). </li></ol> 4. Les cellules sont Cassé vers le haut pour libérer les protéines et l&#39;autorisation de perle contraignant <ol><li> 100 pl de suspension Ni-bille magnétique est distribué dans chaque puits d&#39;une seconde plaque de 24 puits. </li><li> 900 pi de chaque culture à petite échelle bactérienne est transférée dans la plaque de 24 puits contenant les billes. Ajouter 100 ul de la FastBreak 10x / lysonase mélange. </li><li> La plaque 24-puits est transférée à la table d&#39;agitation pour agitation rapide (800 rpm) pendant 30 min à température ambiante. Les parois des cellules bactériennes sont perturbés par une combinaison de forces mécaniques et aux agents chimiques et les protéines produites par recombinaison sont libérés dans la solution. Avec leurs étiquettes d&#39;affinité ils ont immédiatement lier les billes paramagnétiques nickel chélateurs. </li></ol> 5. Les billes sont lavées <ol><li> Les lysats cellulaires contenant les billes magnétiques sont remises en suspension transférés dans une plaque 96-puits profonds, qui est disposée sur un support avec mtiges agnétique qui glissent entre les puits. Les plaques à 96 puits ont obtenu une place en forme de cône inférieur qui facilite l&#39;élimination du surnageant. Les puits peut contenir des volumes allant jusqu&#39;à 2,1 ml, mais sont remplis avec des volumes beaucoup plus faibles. Cela nous permet d&#39;effectuer des mesures vigoureuses secousses, sans contamination croisée par les éclaboussures. </li><li> Les pointes de pipette sont lavés entre chaque étapes de pipetage avec 6 M de guanidine-HCl. Cette étape est cruciale pour la purification de TFIIB et autres &quot;collantes&quot; protéines pour éviter la contamination croisée. Avec d&#39;autres protéines, il peut être suffisant de rincer abondamment les aiguilles avec de l&#39;eau entre les étapes de pipetage. </li><li> Les tiges magnétiques du support magnétique d&#39;attirer les billes paramagnétiques, les tirant à l&#39;écart des centres des puits et permettre aux aiguilles de pipetage libre accès au surnageant. Le surnageant est éliminé. </li><li> 500 pi de tampon de lavage est d&#39;abord ajouté à la plaque de 24 puits, puis transférée à la plaque de 96 puits à eNsure le transfert complet des billes. La plaque 24-puits est éliminé de l&#39;agitateur. </li><li> Un autre ul 500 de tampon de lavage est ajouté directement à la plaque de 96 puits, la plaque est transférée à l&#39;shaker et agiter vigoureusement pendant 1 min. La plaque est déplacée vers le support magnétique et le tampon de lavage mis au rebut. </li><li> Cette étape est répétée deux fois, et la procédure de lavage est terminé par l&#39;élimination de tous les restes de la plaque de tampon. </li></ol> 6. Éluer les protéines dans le tampon d&#39;élution <ol><li> 100 pi de tampon d&#39;élution est ajouté aux billes, la plaque est déplacée vers le shaker et agiter vigoureusement pendant 30 min à température ambiante. </li><li> La plaque est déplacée en arrière de l&#39;agitateur et l&#39;éluat, contenant la protéine recombinante purifiée, est transférée à un nouveau cliché. </li></ol> 7. Mesurer les concentrations des protéines purifiées <ol><li> 190 ul de mélange réactif BCA est transféré à une claire plaque de 96 puits et 10 ul de la protéines solution ajoutée. </li><li> Après plusieurs heures d&#39;incubation (en général 5-6 ou toute la nuit), mesurer l&#39;absorbance et la comparer aux normes BSA pour déterminer les concentrations de chacune des préparations de protéines purifiées (figure 2). </li><li> Les protéines purifiées peuvent maintenant être utilisés pour des applications en aval aux concentrations appropriées (Figure 3). </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Le protocole de purification offre deux étapes de contrôle de qualité, dont des exemples sont présentés. Nous sommes en mesure d&#39;identifier et de documenter les problèmes potentiels à l&#39;étape de la croissance bactérienne (Figure 1) et plus tard lors de l&#39;évaluation des rendements des protéines purifiées (figure 2). En général, nous purifier des protéines et de les tester en trois exemplaires. Ceci, en combinaison avec les deux étapes de contrôle de qualité, nous donne confiance que toute variation, nous avons observé dans nos tests fonctionnels sont dus à la phenotyp mutante (figure 3) et non causées par les variations expérimentales ou purifications ont échoué. Les rendements obtenus varient généralement de 50 à 200 ug et sont plus que suffisants pour divers tests fonctionnels. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> Figure 1. Histogramme des mesures de DO d&#39;une plaque de 24 puits avec des cultures durant la nuit. Trois clones de six variantes mutantes TFIIB ainsi que de la TFIIB type sauvage ont été cultivés. Deux clones portant un plasmide non-expression et un puits avec un milieu ne servent de témoins négatifs. Les mesures de DO montrent qu&#39;il existe de petites variations dans les taux de croissance entre les différentes cultures. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> Figure 2. Rendements protéiques obtenus à partir de ces cultures tel que déterminé par un dosage BCA et confirmée par SDS-PAGE. L&#39;une des variantes n&#39;est pas exprimé à des niveaux élevés. En comcombinaison avec la figure 1, on peut conclure que ce n&#39;était pas à cause de la croissance cellulaire différencié, mais en raison de l&#39;expression de protéines ne sont pas induits correctement. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> Figure 3. Représentant résultat d&#39;un essai de transcription. Nous avons mesuré l&#39;activité de stimulation des variantes TFIIB sur la production de petits transcrits abortifs par ARNP. Ici, les effets de stimulation d&#39;une bibliothèque complète de simples substitutions d&#39;acides aminés de résidus TFIIB K87 sont affichés. Le degré élevé de reproductibilité est confirmée par les taux d&#39;erreur de petite taille. Un gel de l&#39;échantillon montrant la performance de trois mutants par rapport aux type sauvage (wt), les contrôles négatifs (NC) et le tampon d&#39;élution contrôle seulement est représenté en dessous.

<ol>
	<li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain.">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li><li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+polymerase+factory:+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes.">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li><li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases.">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40 (2008).</li><li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions.">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li><li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+Function+of+TFIIB.">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , (2011).</li><li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea.">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li><li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II.">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li><li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II.">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li><li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center.">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li><li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism.">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li><li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation.">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li><li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors.">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode automatisée de purification des protéines recombinantes décrit ici permet la production et la purification d&#39;un grand nombre de protéines mutantes dans un format à petite échelle dans des conditions hautement reproductibles avec une intervention humaine minimale. Figures 1 et 2 montrent les résultats de contrôles systématiques de qualité-et des exemples de la protéines purifiées. Figure 3 montre que les facteurs de transcription purifiés utilisés dans cet exemple effectuer d&#39;une manière hautement reproductible dans des tests fonctionnels. Même si la procédure a été développé pour la purification de l&#39;archaea TFIIB, il est largement applicable pour la purification des protéines par affinité marqués. L&#39;utilisation de ces protocoles de purification automatiques seront ainsi considérablement faciliter l&#39;analyse biochimique des protéines recombinantes et ainsi améliorer notre compréhension des interactions protéine-protéine à une échelle qui est difficile à réaliser manuellement.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Nuit Moyen express tuberculose instantanée </td><td> Merck Chemicals Ltd </td><td> 71491-4 </td><td></td></tr><tr><td> FastBreak </td><td> Promega Ltd </td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> Réactif bioprocédés Lysonase / 1 ml </td><td> Merck Chemicals Ltd </td><td> 71230 </td><td></td></tr><tr><td> Antimousse 204 </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHis Ni-Particules </td><td> Promega </td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazole </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> 56750 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma de base </td><td> Sigma-Aldrich Comptout Ltd </td><td> 93362 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Bicinchoninic détermination de la protéine acide </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> BCA1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> Plaque Deep Well 2,2 ml Place Wells PP PK10 </td><td> Anachem Ltd </td><td> 1810-1800 </td><td></td></tr><tr><td> Polystyrène microplaques MicroWell 96 puits à fond plat non traité 12 manches de 5 plaques clair 0,4 volume ml et 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td> Microplaques Bleu </td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> 24-RB Eh bien Blocs (24) </td><td> Qiagen </td><td> 19583 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorhydrate de guanidine </td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille lavable pour TheOnyx </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td> Réactif pour rack billes magnétiques </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td> Lecteur de plaque Synergy HT </td><td> BioTek </td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td> Plate-forme robotique TheOnyx 44OH/150/100 </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td> Microplaques Agitateur Variomag Teleshaker </td><td> Inheco </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> 96-A et Type d&#39;aimant </td><td> Qiagen </td><td> 36915 </td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput purification of affinity-tagged recombinant proteins

Cristallographie aux rayons X est la méthode de choix pour obtenir une vue détaillée de la structure des protéines. Ces études doivent être complétées par d&#39;autres analyses biochimiques pour obtenir un aperçu détaillé en relations structure / fonction. Les progrès de la technologie de synthèse d&#39;oligonucléotides et de gènes faire des stratégies de mutagenèse à grande échelle de plus en plus réalistes, y compris la substitution de résidus cibles par les 19 autres acides aminés. Gain ou de la perte de fonction des phénotypes alors permettre des conclusions systématiques à tirer, tels que la contribution de résidus particuliers à la stabilité activité de la protéine catalytique, et / ou la spécificité d&#39;interaction protéine-protéine. Afin d&#39;attribuer les différents phénotypes de la nature de la mutation - plutôt que de la fluctuation des conditions expérimentales - il est essentiel de purifier et analyser les protéines d&#39;une manière contrôlée et reproductible. À haut débit stratégies et l&#39;automatisation des protocoles manuels surrobotiques de manipulation des liquides plates-formes ont créé des opportunités pour réaliser de telles procédures complexes moléculaires biologiques avec peu d&#39;intervention humaine et les taux d&#39;erreur minimum de 1-5. Ici, nous présentons une méthode générale pour la purification de l&#39;His-tag protéines recombinantes de façon à haut débit. Dans une étude récente, nous avons appliqué cette méthode à une structure détaillée-fonction d&#39;enquête de TFIIB, un composant de la machinerie de transcription basale. TFIIB est indispensable pour le promoteur de la transcription dirigée in vitro et est essentiel pour le recrutement de l&#39;ARN polymérase dans un complexe 6-8 préinitiation. TFIIB contient un domaine de liaison flexible qui pénètre dans la fente du site actif de l&#39;ARN polymérase 9-11. Ce domaine de liaison confère deux biochimiquement activités quantifiables sur TFIIB, à savoir (i) la stimulation de l&#39;activité catalytique lors de la &quot;avortée&quot; stade de l&#39;initiation transcription, et (ii) une contribution supplémentaire à l&#39;recrutement spécifique de l&#39;ARN polymérase dans le complexe préinitiation 4,5,12. Nous avons exploité le procédé de purification à haut débit afin de générer unique, double ou triple substitution et mutations des délétions au sein du groupe de liaison TFIIB et de les analyser par la suite dans des tests fonctionnels pour leur effet de stimulation de l&#39;activité catalytique de la polymérase d&#39;ARN 4. Au total, nous avons généré, purifié et analysé 381 mutants - une tâche qui aurait été fastidieux et laborieux à effectuer manuellement. Nous avons produit et testé les protéines dans multiplicates qui nous a permis d&#39;apprécier les variations expérimentales et nous a donné une idée claire de la reproductibilité de nos résultats. Cette méthode sert de protocole générique pour la purification de protéines His-tag et a été utilisé avec succès pour purifier autres protéines recombinantes. Il est optimisé pour la purification de protéines 24 mais peut être adaptée à purifier jusqu&#39;à 96 protéines.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins at JoVE.com

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Nous décrivons une méthode pour la purification par affinité marquée de protéines recombinantes utilisant la robotique de manipulation des liquides. Cette méthode est généralement applicable à la purification à petite échelle de l&#39;solubles dans l&#39;His-protéines marquées dans un format à haut débit.

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

high-throughput-purification-of-affinity-tagged-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K vues.  Imperial College London. Nous décrivons une méthode pour la purification par affinité marquée de protéines recombinantes utilisant la robotique de manipulation des liquides. Cette méthode est généralement applicable à la purification à petite échelle de l'solubles dans l'His-protéines marquées dans un format à haut débit.

Vidéo: High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Recherche

Biologie

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expression de protéines recombinantes dans le levure méthylotrophe<emPichia pastoris></em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Haut débit écran surexpression plasmide de levure

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

À haut débit microinjections oursins zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

La production efficace et purification de recombinant murin Kindlin-3 à partir de cellules d&#39;insectes pour les études biophysiques

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening Expression quantitative et purification appliquée à recombinant disulfure riches protéines venin produit dans<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Purification non chromatographique de polypeptides recombinants élastine et de leurs fusions avec des peptides et des protéines<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Le titrage à haut débit de la luciférase-virus recombinants exprimant

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...