Ce protocole est particulièrement adapté au dépistage génétique des mutants drosophiles déficients visuels. En effet, ils permettent la détection de petites anomalies dans la phototransduction de la drosophile, en particulier dans les niveaux de photopigments et les fonctions liées aux pairs. Cette technique est profonde in vivo, facile à exécuter et très robuste, permettant la détection de petits changements dans l’activité des protéines de phototransduction.
À mon avis, réparer les mouches tout en maintenant la viabilité est probablement la partie critique de cette méthode. Allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel Clampex. Allumez l’amplificateur et le générateur d’impulsions Master-8, puis allumez la lampe au xénon et le contrôleur de l’obturateur.
Allumez l’extracteur et placez un capillaire en verre dans l’extracteur et tirez-le. Retirez le capillaire en verre de l’extracteur. Remplissez le capillaire en verre avec une solution de sonnerie filtrée à l’aide d’une seringue à embout allongé.
Insérez l’électrode métallique dans le capillaire en verre. Assurez-vous que la solution dans le capillaire est en contact avec le fil d’argent. Insérez les porte-électrodes dans les deux micromanipulateurs d’électrodes.
Allumez l’alimentation du fer à souder. Réglez le courant sur environ 2,25 ampères. Ce courant devrait chauffer le filament platine-iridium de 0,25 millimètre à environ 55 à 56 degrés Celsius.
Placez une goutte de cire à basse température de fusion sur le fer à souder. Anesthésiez les mouches dans le flacon. Versez les mouches anesthésiées dans le récipient dormeur, choisissez une mouche et couvrez le reste des mouches avec une boîte de Pétri.
Tenez soigneusement la mouche par les ailes à l’aide d’une pince à épiler tranchante et placez-la sur le porte-mouche. Sur le porte-mouche, placez la mouche couchée sur le côté, le dos tourné vers la main. À l’aide d’une pince à épiler, soulevez la mouche de ses ailes et fixez ses ailes au porte-mouche à l’aide du fer à souder.
Connectez le dos de la mouche à la surface du support avec de la cire à l’aide du fer à souder. Abaissez la pointe du fer à souder jusqu’au point de jonction des jambes, puis faites fondre la cire pour couvrir toutes les jambes ensemble. Placez une petite goutte de cire entre la tête et le cou dans la région du cou.
Placez le porte-mouche dans une cage de faraday sombre sur un bloc magnétique et assurez-vous que la mouche se trouve à environ cinq millimètres de l’extrémité du guide de lumière. Placez l’électrode d’enregistrement au-dessus de l’œil de la mouche et l’électrode de masse sur le haut du dos de la mouche à l’aide des micromanipulateurs. Insérez ensuite l’électrode de masse à l’arrière de la mouche à l’aide des micromanipulateurs.
Insérez l’électrode d’enregistrement dans la périphérie externe de l’œil de la mouche, de préférence à l’aide des micromanipulateurs. Fermez la cage de faraday et éteignez les lumières de la pièce pour permettre une adaptation à l’obscurité pendant cinq minutes. Entrez les paramètres à partir d’une durée d’impulsion de 500 mètres par seconde, d’un intervalle d’impulsion de 60 secondes et du nombre d’impulsions réglé sur six.
Pour mesurer le PDA, réglez le générateur d’impulsions Master-8 en mode TRAIN, puis donnez une impulsion lumineuse de cinq secondes d’intensité maximale à l’aide d’un filtre orange. Vérifiez la réponse en tension. Remplacez le filtre orange par un filtre bleu large bande et donnez trois impulsions lumineuses de 5 secondes à intensité maximale.
Vérifiez la réponse en tension. Attendez au moins 60 secondes dans l’obscurité. Remplacez le filtre bleu par le filtre orange précédent.
Ensuite, donnez deux impulsions lumineuses de 5 secondes avec des intervalles de 60 secondes. Vérifiez la réponse en tension. Pour mesurer le potentiel M de l’ERP, donnez une impulsion de lumière bleue continue jusqu’à ce qu’une réponse de tension en régime permanent soit atteinte.
Donnez un bref flash lumineux intense d’une longueur d’onde comprise entre 350 et 700 nanomètres à l’aide d’un filtre passe-bande de 20 nanomètres. Mesurez ensuite l’amplitude maximale de la phase M1 de la réponse du potentiel M, qui reflète l’absorption de la métarhodopsine à cette longueur d’onde spécifique au photoéquilibre. Les réponses PDA ont été évaluées pour différentes mouches mutantes.
Les mouches de type sauvage ont montré une dépolarisation saturée dans l’obscurité qui est apparue comme un ERG cornéen négatif prolongé, à la suite d’une stimulation intense de la lumière bleue. Les lumières bleues suivantes ont produit de petites réponses superposées au PDA, dépourvues des transitoires marche et arrêt. Chez les mouches mutantes présentant une biogenèse photopigmentaire anormale telle que ninaE, la réponse en tension est revenue à la ligne de base après une stimulation intense de la lumière bleue, et la réponse à une lumière bleue supplémentaire n’a pas été supprimée et a montré des transitoires normaux.
L’ERP de type sauvage de la mouche est obtenu par le même protocole, mais un flash vert intense est appliqué pendant le PDA. Ce flash vert déclenche l’ERP et supprime le PDA. Le potentiel M a été obtenu par le flash vert après l’éclairage bleu, mais pas par un flash bleu après l’éclairage bleu chez la mouche de type sauvage.
Ce protocole a été répété chez les types sauvages, dans les mutations hypomorphes photopigmentaires ninaE, et dans les mutants déficients en phototransduction avec des niveaux normaux de photopigments norpA. Les spectres d’absorption relatifs de la rhodopsine volante et de la métarhodopsine ont été calculés à partir de mesures photométriques du spectre différent et du spectre de photoéquilibre. Il est important pour la survie des mouches de faire attention à la viscosité de la cire en s’abstenant de surchauffe.
Cette procédure convient à la génétique et au dépistage des mutants visuels défectueux. Les méthodes qui isolent et identifient au hasard les mutations visuelles peuvent faciliter la découverte de nouvelles protéines et de nouveaux mécanismes impliqués dans la phototransduction de la drosophile. Le protocole PDA a permis d’isoler des mécanismes visuels importants et nouveaux.
La participation n’aurait probablement pas été découverte ou même anticipée autrement.
