Nous tenons à remercier le Dr David Olivieri pour un examen critique de ce manuscrit, le Dr Nuno Moreno pour l&#39;aide logistique pour construire notre porte-animal et les coussins chauffants et Dr. Vijay K. Kuchroo pour le don en nature de Foxp3-KI GFP / GFP souris. Ce travail est soutenu par «Fundação para Ciência Tecnologia e&quot; (CFPI, Portugal), subvention no PTDC/EBB-BIO/115514/2009.

1. La préparation des animaux Notes importantes: suspensions cellulaires BM et les transplantations du thymus ont été réalisées dans des conditions aseptiques. Les suspensions ont été préparées BM à l&#39;intérieur du hottes de notre salle de culture cellulaire, tandis que la transplantation thymique a été réalisée dans la salle de chirurgie situés dans notre animalerie. Afin de maintenir et de garantir ces conditions aseptiques, nous n&#39;étions pas autorisés à enregistrer notre vidéo dans ces endroits. Cependant, tous les matériaux chirurgicaux ont été autoclavés et le banc chirurgicale a été préalablement nettoyé avec Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc) et 70% d&#39;éthanol. Toutes les procédures ont été approuvées par les soins des animaux et utilisation institutionnelle Comité (IACUC) et ils étaient en accord avec la Fédération européenne des associations de science de laboratoire animale (FELASA) des directives. Le numéro d&#39;identification d&#39;approbation est AO10/2010. Toutes les expériences ont été l&#39;image des procédures terminales et les animaux ont été euthanasiés immédiatement après la fin de l&#39;imaged&#39;acquisition. La procédure détaillée est la suivante: <ol><li> Irradier (avec un irradiateur γ-) 8 semaines vieilles souris Nude avec 900 rads pour détruire les précurseurs hématopoïétiques endogènes intérieur de l&#39;os courges (BM). Après irradiation, le retour des animaux dans leur cage jusqu&#39;à ce que vous préparent les cellules du donneur BM pour injection intraveineuse et la reconstitution d&#39;autres BM. Ce transfert a été effectué BM 1 h après l&#39;irradiation. </li><li> Séparer les animaux donneurs BM. Les tibias et les fémurs des pattes postérieures d&#39;un animal sont généralement suffisantes pour reconstituer jusqu&#39;à 3 animaux receveurs. Après l&#39;euthanasie avec le CO 2, retirez les pattes arrière, puis retirez la peau et le muscle de l&#39;os. </li><li> Couper l&#39;extrémité fermée de chaque os et le rincer avec du PBS (ou RPMI) ou les écraser tous les dans un mortier, avec un pilon, avec 2 ml de PBS (ou RPMI) pour supprimer le BM. </li><li> Perturber la structure BM en une suspension mono-cellulaires par des répétitions de l&#39;aspiration vigoureuse USIng d&#39;une pipette P1000. Alternativement, vous pouvez également passer le BM à travers une aiguille de seringue 21G plusieurs fois. Centrifuger (400 g, 5 min, RT), rétablir la suspension des cellules dans du PBS, et à injecter par voie intraveineuse dans votre nu-irradiés destinataires. Dans nos expériences, nous avons utilisé BM à partir Foxp3-GFP KI / souris GFP où toutes les cellules T régulatrices (Treg) va exprimer la GFP 1. </li><li> L&#39;acceptation de la BM donateurs se produit dans les premiers jours après le transfert, puisque les non-BM-reconstitué animaux ne peuvent pas survivre plus de 14 jours. Cependant, il faut attendre 4 à 6 semaines pour permettre la récupération complète de tous les compartiments BM. Bactrim (Roche) a été ajouté à l&#39;eau (2 mg / ml) pendant la première semaine après l&#39;irradiation pour diminuer le risque d&#39;infections bactériennes. </li><li> Embryonnaire du thymus de transplantation a déjà été décrit 2. En bref, commencer couples reproducteurs de souris isogéniques et vérifiez le branchement (preuves du coït) chaque jour. Séparés des femelles branchés et CO 2-les euthanasier le jour 15 de pregnAncy (observation de la fiche est le jour 1 de la grossesse). Retirez les embryons et le thymus. Placez le thymus embryonnaire dans PBS froid jusqu&#39;au transfert. </li><li> Pour effectuer la transplantation thymus, anesthésier BM-receveur souris Nude avec la kétamine (120 mg / g de poids de la souris) / xylazine (16 mg / g de poids de la souris) et de les garder sur le dessus d&#39;un coussin chauffant à 37 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils obtiennent inconscient. </li><li> Chirurgicalement exposer le rein pour effectuer la greffe de thymus de l&#39;. D&#39;abord frotter la peau avec ChloraPrep (CareFusion Inc) et 70% d&#39;éthanol. Ensuite, faire un 1 cm coupure sur la peau de la partie du corps en arrière-latéral de l&#39;animal, de 2 mm dessous de la dernière côte thoracique. </li><li> Couper la cavité péritonéale et sortir le rein de cette cavité. Faire une petite entaille superficielle dans la capsule du rein avec une lame de bistouri. En utilisant une pince avec une pointe très fine faire une pochette sous la capsule rénale de souris destinataire et ajoutez jusqu&#39;à 4 lobes thymiques dans cette pochette. </li><li> Mettez le b du rein<html> ack à sa place, la suture de la cavité péritonéale avec un ou deux points de suture, puis fermez la peau de souris en utilisant la méthode de suture même. Alternativement, les sutures peuvent être fait en utilisant de la colle chirurgicale. </li><li> Injecter analgésique (butorphanol à 5 ​​mg / kg) par voie sous cutanée dès la fin de la chirurgie pour éviter la douleur animale et de garder les animaux dans un coussin chauffant jusqu&#39;à ce qu&#39;ils commencent à se remettre de l&#39;anesthésie. Les souris sont en cage individuelle pour les 3 premiers jours après la transplantation pour éviter compagnons de cage d&#39;enlever les points de suture. Enlever points de suture après 1 semaine. </li><li> Souris Nude n&#39;ont pas les cellules T. Par conséquent, vous pouvez évaluer l&#39;acceptation du greffon par le thymus contrôle le pourcentage de CD4 + ou cellules T CD8 + dans le sang. Une fois par semaine, 2 semaines après la transplantation du thymus, qui saignent les animaux et les taches de sang avec l&#39;anti-CD4 et anti-CD8 anticorps monoclonaux (AcM). Lorsque les CD4: CD8 ratio est d&#39;environ 2h01, le thymus greffé est parfaitement fonctionnel (figure 1). </li></ol>&quot;&gt; 2. Acquisition d&#39;image intravitale Préparer tous les matériaux dont vous aurez besoin à l&#39;avance et les mettre de côté. <ol><li> Anesthetize animaux avec la kétamine / xylazine (mêmes doses décrite au point 1.5) et les placer sur le dessus d&#39;un coussin chauffant à 37 ° C. Injecter 100 ml de rhodamine B isothiocyanate-dextran (20 mg / ml dans du PBS) par voie intraveineuse pour permettre la visualisation avenir de la circulation sanguine. </li><li> Exposer le rein transplanté contenant du thymus selon le protocole précédemment décrit dans le point 1.6. </li><li> Afin d&#39;éviter le rein de revenir à sa position initiale, près des côtés latéraux de l&#39;incision cutanée avec des points de suture. </li><li> Placez un morceau de coton imbibé de PBS sur le dessus de l&#39;orgue pour le garder humide. </li><li> Mettez le coussin chauffant au-dessus de la scène détenteur des animaux (figure 2A). </li><li> Mettez l&#39;animal sur le dessus du coussin chauffant dans le support d&#39;animaux, jusqu&#39;à l&#39;organe (figure 2B). </li><li> Pincez l&#39;orgue à deux faces avec une pince made de feuille mince d&#39;aluminium (figure 2C). </li><li> Fermez le porte-animal et placer la sonde radiateur dessus aussi près que possible de votre tissu (figure 2D). Cette sonde radiateur mesure en permanence la température de l&#39;organe et envoie cette information à l&#39;appareil de chauffage à ajuster le courant électrique, le garder à 37 ° C. </li><li> Retirer le coton imbibé de PBS et ajouter bas point de fusion d&#39;agarose (2% dans PBS) à 30 ° C sur le dessus de votre préparation. </li><li> Couvrir toute la préparation avec le chauffe-dessus (figure 2E). Dans l&#39;ouverture de ce chauffe il ya une lamelle d&#39;isoler l&#39;agarose de l&#39;objectif (figure 2F). Surveiller l&#39;anesthésie de la souris et d&#39;injecter un coup de pouce demi-dose toutes les 40 minutes. Après l&#39;acquisition de l&#39;image, euthanasier l&#39;animal avec du CO 2. </li></ol> Remarque: les images du clip du papier d&#39;aluminium et le chauffe-dessus sont présentés dans la figure 3. 3. Deux photons d&#39;acquisition d&#39;imagerie Nous avons utilisé un modèle upright &quot;Prairie Ultima XY&quot; à deux photons microscope. Notre système est équipé d&#39;un Ti: saphir au laser, quatre PMT supérieure pour une utilisation simultanée de 4 canaux d&#39;acquisitions et d&#39;un objectif 20x immersion dans l&#39;eau. <ol><li> Allumez le Ti: saphir laser et le système de microscope entier. </li><li> Ajouter des miroirs dichroïques et des jeux de filtres en fonction de la longueur d&#39;onde désirée. Dans notre cas nous avons utilisé un porte-Olympus-BX2 Chroma contenant un miroir dichroïque 565 nm, un 525/50 nm (pour Foxp3-GFP du signal) du filtre, et un 595/50 nm filtre (dextran-rhodamine-B signal à l&#39;intérieur des vaisseaux sanguins ). La gamme de longueur d&#39;onde laser utilisé était entre 880 à 900 nm. </li><li> Ajouter le détenteur des animaux au microscope, se connecter et allumer tous les appareils de chauffage, ajouter de l&#39;eau sur le radiateur de l&#39;ouverture supérieure, soigneusement inférieure à l&#39;objectif dans l&#39;eau, et se concentrer sur un navire ou une GFP-Tregs. </li><li> Avec le microscope à x, y, z de contrôle externe, rapide enquête sur le tissu pour localiser une région<html> d&#39;intérêt. </li><li> Réglez le gain sur la PMT pour optimiser la séparation des couleurs et minimiser la quantité de laser requise pour obtenir un signal suffisamment sur fond. Essayez d&#39;utiliser la quantité minimale de laser pour éviter la photo-dommages de votre tissu. </li><li> Une fois la région d&#39;intérêt est située, commencent imagerie time-lapse. Dans notre cas, un type 5D (x, y, z, t, et la couleur) protocole d&#39;acquisition consiste à acquérir des images séquentielles d&#39;un volume de 50 um profondeur des tissus, divisé en 4,0 um z-étapes, x et y de longueur de 140 um chacun d&#39;eux. Chaque volume est d&#39;environ 30 secondes pour être acquis. Par conséquent, 60 acquisitions se produiront environ 30 min d&#39;acquisition des images. </li><li> Transférer les données vers le serveur institutionnel et l&#39;utilisation ImageJ, Imaris, ou un logiciel pour effectuer Volocity multi-dimensionnelle de rendu et de suivi des cellules. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <html> g1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. . Embryonnaire du thymus acceptation et la fonction Après BM récupérer, thymus embryonnaires ont été transplantés à BM animaux reconstitués; deux semaines après la transplantation de thymus, ces souris ont été saignées une fois par semaine pour surveiller les pourcentages de sous-types de lymphocytes T par coloration avec des anti-CD4 ou anti-CD8 MAbs. Nous avons considéré le thymus a été accepté chez les animaux avec un taux de CD4: CD8 Ratio autour 1.5-2.0:1 (A). Pour confirmer sa fonctionnalité, nous avons sacrifié quelques animaux thymus transplantés et comparé le pourcentage de différentes sous-populations thymocytes des souris WT (B). Les pourcentages de double négatif (DN; CD4 - CD8 - thymocytes) sous-populations (par coloration avec des anti-CD25 et anti-CD44 anticorps monoclonaux), double-positifs (DP; CD4 + CD8 + thymocytes) et simple positif (SP) CD4 + ou CD8 + thymocytes ont été similaires entre ces animaux. ig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Ensemble porte-animaux. Après profondément anesthésiés, l&#39;animal est mis sur le dessus d&#39;un coussin chauffant, précédemment monté sur le dessus de la scène détenteur des animaux (A). Le rein transplanté contenant du thymus est vers le haut (B). Une pince aluminium pincées délicatement le rein entier (C) pour maintenir en place. Fig. 1C insert montre en détail la pince. La partie supérieure du porte-animal est mis en place (D). Le coton imbibé de PBS est retiré de la partie supérieure de l&#39;organe, remplacé par chaleureuse bas point de fusion d&#39;agarose, et le chauffe-dessus est ajouté (e). Enfin, l&#39;ensemble est transféré à la loupe, représenté ici par l&#39;objectif (F). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" /> Figure 3. Détails des pièces de titulaire. Ces images montrent la pince feuille d&#39;aluminium (A) la tenue du rein (B). Notez également la région où le thymus est situé transplantés. Cela indique approximativement la régionpour couper la capsule du thymus et de faire la poche pour mettre le thymus embryonnaire. La lamelle chauffe supérieure (C) a été fixée avec de la colle silicone pour sa partie inférieure (D). Vidéo 1. Imagerie intravitale de Foxp3-GFP + thymocytes à l&#39;intérieur du thymus où les niveaux physiologiques de l&#39;oxygénation et la température (37 ° C) ont été maintenues durant tout le processus. Notez le flux sanguin et la circulation des Treg. Ces vitesses peuvent être mesurés et comparés avec les données publiées. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">Cliquez ici pour voir le film.</a> Movie 2. Intravitale imagerie des Treg dans un thymus où les images ont été acquises à 30 ° C. Notez l&#39;absence de mouvement et la forme ronde des cellules malgré le maintien du flux sanguin. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">Cliquez ici pour voir le film.</a>

<ol>
	<li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells.">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current protocols in immunology. , (2006).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Hugues, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+T+cell+dynamics+in+lymph+nodes+during+the+induction+of+tolerance+and+immunity.">Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity.</a> 5, 1235-1242 (2004).</li><li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice.">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li><li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li><li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo.">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li><li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

Dans ce papier, nous avons démontré les procédures d&#39;imagerie à deux photons de thymocytes dans un animal vivant. Nous avons également décrit certains paramètres que l&#39;on doit contrôler soigneusement, comme la continuation du flux sanguin et le maintien de la température de l&#39;organe pendant les procédures d&#39;imagerie. Néanmoins, malgré les efforts de soin de garder l&#39;orgue stable, les artefacts de mouvement tels que «l&#39;organe à la dérive» peut se produire. Correction d&#39;image postérieure peut être effectuée par le développement d&#39;algorithmes spécialement conçu à cet effet. L&#39;analyse d&#39;images supplémentaires pourraient également être la source du développement de nouveaux protocoles qui cherche à minimiser les erreurs. Le thymus est l&#39;organe où toutes les cellules T sont produites et, par conséquent, il est l&#39;organe où immunologistes intéressés à comprendre la génération de γδ, lymphocytes CD4 ou lymphocytes T CD8 se concentreront leur attention. La plupart des études concernant les cellules T sont basées sur des différences dans le nombre et / ou la stabilité de ces caunes, après différents in vitro / in vivo des manipulations. Cependant, seulement après la visualisation in vivo nous avons pu observer l&#39;interaction entre les cellules du système immunitaire impliquées dans le maintien de l&#39;homéostasie 3-7. Par conséquent, l&#39;observation in vivo des thymocytes est probablement l&#39;une des informations les plus importantes manquent pour mieux comprendre la biologie des cellules T. Intravitale TPM fournit une image détaillée des mouvements des cellules T et les interactions, et nous démontrons ici comment il peut être utilisé pour des études détaillées thymocytes. Cependant, chaque technique a ses limites. Alors que l&#39;acquisition d&#39;imagerie intravitale est le système le plus précis pour refléter le comportement des cellules à l&#39;intérieur du corps, il est vrai aussi que l&#39;acquisition d&#39;images explantées d&#39;organes est moins laborieuse et a été utilisé pour recueillir des informations importantes sur le système immunitaire 8,9. Par ailleurs, on ne peut nier les méthodes d&#39;imagerie intravitale nécessiter une intervention chirurgicale afin d&#39;exposer les tissus et les vaisseaux sanguins chez les animaux anesthésiés,qui en soi pourrait entraîner une altération de l&#39;organe entier la physiologie 10. Néanmoins, il existe des méthodes non-invasive qui abolissent les artefacts causés par l&#39;intervention chirurgicale 11 et de nouvelles méthodes sont en cours de développement à mieux se préparer à l&#39;avance les animaux devant être utilisés 12. Par conséquent, de nouvelles procédures chirurgicales et des péages sera de minimiser ou de contourner les limitations réelles de l&#39;acquisition d&#39;imagerie intravitale et deviennent de plus en plus accessible à la communauté scientifique. Nous avons démontré que la méthode que nous avons décrit est faisable et ce tous les rapports des manipulations in vivo systémique, l&#39;administration de médicaments tels, que nous avons utilisés. Ainsi, nous suggérons l&#39;utilisation de cette méthode ainsi que des techniques ex vivo déjà disponibles afin de compléter et renforcer d&#39;autres études concernant le développement des thymocytes.

<table border="1"><thead><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr></thead><tbody><tr><td> Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> préparer les actions à 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Deux photons microscope </td><td> Technologies Inc Prairie </td><td> Prairie Ultima XY </td><td></td></tr><tr><td> Ti: saphir au laser </td><td> Coherent, Inc </td><td> Caméléon Ultra Famille </td><td></td></tr><tr><td> 20x/1.00 objectif à immersion NA </td><td> Olympus Inc </td><td> XLUMPLFLN 20XW </td><td></td></tr><tr><td> Titulaire (Filtres / dichroïque) </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 91018 BX2 (U-MF2) </td><td></td></tr><tr><td> 525 nm/50 filtre </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> ET525/50m </td><td></td></tr><tr><td> 595 nm/50 filtre </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> ET595/50m </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 565 nm dichroïque </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 565dcxr </td><td></td></tr><tr><td> Imaris logiciels </td><td> Bitplane AG Inc </td><td> Imaris </td><td></td></tr><tr><td> Volocity </td><td> PerkinElmer, Inc </td><td> Volocity </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> NIH, Etats-Unis </td><td> ImageJ </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy

Microscopie à deux photons (TPM) offre d&#39;acquisition d&#39;image dans les zones profondément à l&#39;intérieur des tissus et des organes. En combinaison avec le développement d&#39;outils et de nouvelles procédures stéréotaxique chirurgicale, TPM devient une technique performante pour identifier des «niches» à l&#39;intérieur des organes et de documenter cellulaire &quot;comportements&quot; des animaux vivants. Alors que l&#39;imagerie intravitale fournit des informations qui ressemble le mieux le comportement réel cellulaire à l&#39;intérieur de l&#39;orgue, il est à la fois plus laborieux et techniquement exigeants en termes d&#39;équipement requis / procédures d&#39;acquisition de l&#39;ex alternatives imagerie in vivo. Ainsi, nous décrivons une nouvelle procédure chirurgicale et titulaire »stéréotaxique&quot; organe qui nous permet de suivre les mouvements des cellules Foxp3 + dans le thymus. Foxp3 est le régulateur maître pour la génération de cellules T régulatrices (Treg). Par ailleurs, ces cellules peuvent être classés selon leur origine: c&#39;est à dire. thymus différenciés Tregs sont appelés «naturels Tregs&quot; (nTregs), que l&#39;opposed au périphérique convertis Tregs (pTregs). Bien que beaucoup de recherches ont été rapportés dans la littérature concernant le phénotype et la physiologie de ces cellules T, on sait très peu sur leurs interactions in vivo avec d&#39;autres cellules. Cette carence peut être due à l&#39;absence de techniques qui permettraient de telles observations. Le protocole décrit dans ce document fournit un remède à cette situation. Notre protocole consiste à utiliser des souris nude qui n&#39;ont pas d&#39;thymus endogènes car ils ont une mutation ponctuelle dans la séquence d&#39;ADN qui compromet la différenciation de certaines cellules épithéliales, y compris les cellules épithéliales thymiques. Souris Nude ont été irradiés par rayons gamma et reconstituées avec des courges osseuse (MO) de Foxp3-KI GFP / GFP souris. Après la récupération BM (6 semaines), chaque animal a reçu la transplantation embryonnaire du thymus à l&#39;intérieur de la capsule rénale. Après l&#39;acceptation du thymus (6 semaines), les animaux ont été anesthésiés; le rein contenant lesthymus transplanté a été exposé, fixée dans notre porte-orgue, et maintenu dans des conditions physiologiques pour l&#39;imagerie in vivo par TPM. Nous avons utilisé cette approche pour étudier l&#39;influence de drogues dans la génération de cellules T régulatrices.

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Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Nous avons développé des outils de laboratoire roman et de protocoles pour l&#39;acquisition d&#39;imagerie intravitale du thymus. Notre technique devrait aider à l&#39;identification de «niches» dans le thymus où le développement des cellules T se produit.

Imagerie intravitale du Thymus souris utilisant la 2-microscopie biphotonique

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

intravital-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K vues.  Instituto Gulbenkian de Ciência. Nous avons développé des outils de laboratoire roman et de protocoles pour l'acquisition d'imagerie intravitale du thymus. Notre technique devrait aider à l'identification de «niches» dans le thymus où le développement des cellules T se produit.

Vidéo: Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Recherche

Immunologie et infection

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

Observation directe de la phagocytose et NET-formation par les neutrophiles dans les poumons infectés en utilisant deux microscopie biphotonique

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopie intravitale de la rate: Analyse quantitative de la mobilité des parasites et la circulation sanguine

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imagerie intravitale du ganglion lymphatique poplité souris

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Microscopie intravitale imagerie du foie suivante<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Une évaluation de l&#39;hémodynamique hépatiques

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analyse de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effecteur translocation dans les cellules hôtes à l&#39;aide de bêta-lactamase effecteur Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage Utilisation de IL-1ß conduit promoteur-DsRed Souris Reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...