Cette recherche a été soutenue par l&#39;INSERM, l&#39;Université d&#39;Aix-Marseille et un prix de développement de carrière à partir HFSPO obtenu par CL Forestier.

Déclaration éthique: Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et protocoles qui ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle de l&#39;Université d&#39;Aix-Marseille, France. Femme C57BL / 6 à 8 - 10 semaines d&#39;âge ont été commercialement obtenue et traitée conformément aux règles du Décret N ° 87-848 8, le 19 Octobre 1987, Paris. Toutes les expériences utilisant L. parasites donovani LD1S ont été menées conformément à la réglementation en matière de biosécurité de la législation française et l&#39;Union européenne. 1. Infection de souris avec L. donovani Promastigote parasites <ol><li> Préparation du milieu de culture in vitro pour le maintien de L. donovani parasites promastigotes, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D). <ol><li> Utilisez milieu M199. Supplément milieu M199 avec 10% de sérum de veau foetal (inactivé par la chaleur à 56 ° C pendant 30 min), 25 mM HEPES pH 6,9, 12 mM NaHCO 3, 1 mM glutamine, 16,040 RPMI mélange de vitamines, l&#39;acide folique 10 mM, 100 mM d&#39;adénosine, 7,6 mM d&#39;hémine, 50 U / ml de pénicilline et 50 mg / ml de streptomycine. </li></ol></li><li> Culture LD1S parasites dans 10 ml de milieu complet M199 à 26 ° C dans un ballon de 25 cm 2 ventilé. </li><li> Utilisation étapes de centrifugation différentielle successives, préparer une population de parasites promastigotes qui sont enrichies en formes métacycliques. <ol><li> Récolter une culture de phase parasite mi-journal. Comptez sur un hemocytomer. Remettre en suspension 5 x 10 5 parasites / ml dans 10 ml de milieu complet M199. Cultiver la culture du parasite dans des conditions anaérobies jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la phase stationnaire tardive (dans environ 5-6 jours). </li><li> Faites tourner la culture LD1S à 1200 g pendant 10 min à 26 ° C pour sédimenter les parasites non-métacycliques, récupérer le surnageant et tourner de nouveau à 2500 g à 26 ° C pendant 10 min. Remarque: Ce culot final est fortement enrichie en parasites promastigotes métacycliques. </li><li> Reprendre le culot dans 100 ul de PBS. Retirer une petite aliquote de fixation avec 25% de glutaraldéhyde 1/100 v: v et compter les parasites en utilisant un hémocytomètre. </li></ol></li><li> Diluer la population de parasites enrichi en métacyclique à 1 x 10 7/100 ul dans du PBS. Injecter la suspension du parasite dans la veine de la queue d&#39;une souris anesthésiée (voir ci-dessous) en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de 30 G. Pour les animaux de contrôle, d&#39;injecter 100 pi de PBS dans la veine de la queue. </li></ol> 2. Interventions chirurgicales <ol><li> Désinfecter l&#39;espace de travail avec un spray désinfectant biocide et tous les instruments chirurgicaux avec 70% d&#39;éthanol pendant 30 min. </li><li> Préparer une solution anesthésique, en fonction du poids de l&#39;animal, contenant 125 mg / kg de kétamine et 12,5 mg / kg de xylazine dilué dans du PBS. </li><li> Peser la souris et par voie intrapéritonéale injecter la dose appropriée d&#39;anesthésique en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 30 G. </li><li> Garder la souris chaude et vérifiez que la souris est complètement anestheacquisition amorti en pinçant le coussinet plantaire avant de poursuivre. Re-injecter une dose de moitié de la solution anesthésique chez la souris toutes les 60 min. </li><li> Raser l&#39;abdomen de la souris et nettoyez-le avec Vetedine. Faire une petite incision dans la peau et la musculature sous la cage thoracique du côté gauche de l&#39;abdomen. </li><li> Placez un morceau de gaze humide sur l&#39;abdomen juste en dessous de la zone ouverte. Exposer le foie et le placer sur la gaze. Disposez un autre morceau de gaze humide du foie. </li><li> Placer un 24 x 60 mm 2 à 150 um d&#39;épaisseur lamelle, cyanoacrylate lié à une structure métallique, sur le foie pour la visualisation au microscope. </li><li> Protégez les yeux de la souris avec une gaze humide. </li><li> Après la session d&#39;imagerie, euthanasier l&#39;animal anesthésié par dislocation cervicale. </li></ol> 3. Microscopie intravitale imagerie du foie de l&#39;Architecture <ol><li> Effectuer les expériences de microscopie intravitale sur un microscope confocal inversé équipé d&#39;auhermostatic contrôlée chambre, un 63X glycérol d&#39;huile immersion objectif apochromatique (NA 1.4), Argon (488 nm) et HeNe (543 nm, 633 nm) et une diode laser bleu (405 nm). </li><li> Placez la souris sur la scène du microscope avec la lamelle couvrant le visage du foie vers le bas sur l&#39;objectif. Réglez la température de la chambre à 29 ° C. Réglez la mise au point avec l&#39;autofluorescence du foie pour permettre la visualisation des sinusoïdes. </li><li> Pour visualiser le système vasculaire, préparer une solution de 500 ug de BSA-Alexa 647 dilué dans 100 ul de PBS, pour chaque souris. Injecter cette solution par voie intraveineuse dans la veine caudale de la souris sous anesthésie en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 30 G. </li><li> Pour visualiser les cellules des noyaux du foie, préparer une solution de Hoechst 33342 dans du PBS. Injecter cette solution à 8 mg / kg par voie intraperitoneale de souris en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 30 G. </li><li> Utilisez le mode séquentiel normal, l&#39;objectif à immersion 63X et le scanner à 400 Hz à l&#39;image de la hépatiqueles noyaux des cellules et le système vasculaire du foie. Tournez sur la diode bleue 405 nm pour Hoechst excitation et le laser de 633 nm pour BSA-Alexa 647 excitation. Allumez le laser à argon 488 nm et de définir une large bande d&#39;acquisition de visualiser l&#39;autofluorescence du foie. </li></ol> 4. Microscopie intravitale imagerie du foie pour la mesure de vitesse de débit sanguin <ol><li> Ouvrez le logiciel LAS du microscope (LAS-AF spectateur version 3.1.0 build 8587). Sélectionnez le mode de scanner à résonance lors de l&#39;ouverture du logiciel de microscope. </li><li> Cliquez sur l&#39;onglet de configuration pour définir le matériel. Cliquez sur le laser et sélectionnez le laser HeNe 633. Cliquez sur paramètres et sélectionner la résolution 12 bits. </li><li> Cliquez sur le menu d&#39;acquisition. Dans la fenêtre des paramètres de la voie de faisceau, sélectionnez l&#39;objectif 63X et mettre en place la puissance laser 633 à 100%. Activer le gain du signal et désactiver des paramètres de réglage en sélectionnant Alexa-633 dans le menu déroulant PM1-3. </li><li> Dans l&#39;onglet acquérir, sélectionnez l&#39;acquisition &#39;XYT&#39;Mode. Réglez largeur du format au 1024 x 1024. Sélectionnez la vitesse à 8000 Hz. Sélectionnez le sténopé de 3 unités Airy. Sélectionnez un facteur de zoom de 3. Ne pas sélectionner le mode bidirectionnel. </li></ol> 5. Analyse quantitative de RBC vitesse en utilisant les XYT Images (Méthode 1) <ol><li> Cliquez sur l&#39;icône &#39;Live&#39; pour visualiser le flux sanguin sur un mode direct. Choisissez la zone d&#39;intérêt et sélectionnez un vaisseau sanguin spécifique pour analyse. Réglez le navire d&#39;intérêt à la position horizontale en ajustant le &#39;X&#39;, &#39;Y&#39; et de rotation de terrain coordonnées de numérisation sur le panneau de contrôle USB. </li><li> Arrêtez le mode «Live» une fois que le navire d&#39;intérêt est fixé. Modifiez le format ensemble largeur 1024 x 256 en mode d&#39;acquisition fenêtre, line average = 1, moyenne de cadre = 1 réglage, sélectionnez &quot;piles&quot; 150. Cliquez sur «start» pour acquérir des images. </li><li> Pour l&#39;analyse quantitative de la vitesse RBC en utilisant les images &quot;XYT&quot; ouvrent le logiciel ImageJ. Sélectionnez le &quot;Fichier&quot;onglet dans ImageJ, cliquez sur «Ouvrir» puis choisissez le fichier d&#39;intérêt. </li><li> Allez dans le menu &quot;plugin&quot; dans ImageJ, sélectionnez LOCI et bio-formats importer options. Dans cette fenêtre, sélectionnez la pile de visualisation des paramètres comme «HyperStack &#39;. Dans l&#39;option d&#39;ordre de superposition, sélectionnez l&#39;option: &quot;xyzct&quot;. Note: Ceci ouvre une fenêtre avec toute la série d&#39;acquisitions. </li><li> Cliquez sur &quot;Plugins&quot; dans le menu et sélectionner l&#39;option ImageJ MTrackJ. Cliquez sur l&#39;icône «add» sur la petite fenêtre et cliquez sur le RBC à suivre. Cliquez sur le même RBC dans chaque trame suivante et cliquez sur l&#39;icône «mesure» pour mesurer la vitesse. Remarque: Le fichier généré peut être enregistré au format .EXL. </li><li> Suivre un minimum de cinq globules rouges par navire et d&#39;analyser un minimum de trois navires individuels de la même taille. </li></ol> 6. Analyse quantitative de RBC vitesse en utilisant les xt images en ligne (Méthode 2) <ol><li> Cliquez sur &#39;Live&#39; pour visualiser le sang ffaible en mode direct. Choisir un vaisseau sanguin pour l&#39;analyse spécifique. Réglez le navire d&#39;intérêt en position horizontale. Arrêtez le mode «Live» une fois que le navire d&#39;intérêt est fixé. </li><li> Sélectionnez le mode de balayage «xt» et mettre la lumière centrale du vaisseau sélectionné le long de la ligne de balayage. Set largeur du format à 1024 x 512, la vitesse = 8,000Hz, de ligne moyenne = 32, temps = 512. Cliquez sur «start» et d&#39;acquérir les images de ligne de xt. </li><li> Générer des stries pour l&#39;analyse quantitative de la vitesse RBC en ouvrant le fichier de .lif et ouvrir l&#39;image de la ligne de xt d&#39;intérêt. Dans le logiciel LAS-AF, sélectionnez &quot;expériences&quot;, ouvrir le .lif et sélectionnez l&#39;image. Remarque: Il ouvrira automatiquement une kymographe. </li><li> Mesurer le temps (t, obtenu sur l&#39;axe Y) requis pour une série de particules (montrant une réflexion sombre) à parcourir une certaine distance (d, obtenu sur l&#39;axe X) sur cette kymographe. Sélectionnez l&#39;outil &quot;tracer une ligne&quot; et tracez une ligne horizontale à la série. Notez la distance enpm et le temps en secondes générée à la suite de l&#39;onglet en bas de l&#39;image. </li><li> Calculer la vitesse V = distance / temps en utilisant les valeurs obtenues à partir de la kymographe. </li><li> Quantifier un minimum de cinq particules stries image xt et par un minimum de trois navires individuels de la même taille. </li></ol>

<ol>
	<li>Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hepatic+microcirculation:+mechanistic+contributions+and+therapeutic+targets+in+liver+injury+and+repair.">The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair.</a> Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).</li><li>Srinivasan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+blood+flow+measured+by+optical+methods.">Absolute blood flow measured by optical methods.</a> SPIE Newsroom. , (2011).</li><li>Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+liver+blood+flow:+a+review.">Measurement of liver blood flow: a review.</a> HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).</li><li>Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+pathology+and+parasite+persistence+in+experimental+visceral+leishmaniasis.">Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis.</a> Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+experimental+Leishmania+donovani-induced+hepatic+granulomas+detects+Kupffer+cell-restricted+antigen+presentation+to+antigen-specific+CD8+T+cells.">Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).</li><li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intravascular+immune+response+to+Borrelia+burgdorferi+involves+Kupffer+cells+and+iNKT+cells.">An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells.</a> Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+immune+surveillance+by+CXCR6++NKT+cells+patrolling+liver+sinusoids.">Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids.</a> PLoS Biol. 3, e113 (2005).</li><li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy.">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).</li><li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver.">In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).</li><li>Vacchina, P., Morales, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+screening+test+using+Leishmania+promastigotes+stably+expressing+mCherry+protein.">In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).</li><li>Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+spleen:+quantitative+analysis+of+parasite+mobility+and+blood.">Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Kamoun, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+RBC+velocity,+flux,+hematocrit+and+shear+rate+in+vascular+networks.">Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks.</a> Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).</li><li>MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittence+of+blood+flow+in+liver+sinusoids,+studied+by+high-resolution+in+vivo+microscopy.">Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy.</a> Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le développement récent de la microscopie intravitale du foie de souris ouvre de nouvelles possibilités pour l&#39;enquête de la réponse physiologique à l&#39;infection in vivo et en temps réel 5,9,10. La circulation sanguine d&#39;organes est un paramètre physiologique critique qui est souvent altérée dans de nombreuses maladies. Toutefois, le statut de l&#39;hémodynamique du foie dans des conditions physiologiques et infectieuses reste un domaine mal exploré. Dans cette étude, les mét...

Hémodynamique spécifiques d&#39;organes sont des caractéristiques physiologiques importants de tout organe d&#39;un mammifère. Des anomalies dans la circulation sanguine peuvent être la conséquence de l&#39;inflammation et un signe de dysfonctionnement des organes 1. Ainsi, le flux sanguin organisation, la structure et la fonction apparaissent paramètres critiques pour l&#39;analyse dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les techniques qui ont été couramment utilisés pour l&#39;analyse de la circulation sanguine dans un organe spécifique contiennent plusieurs limitations, y compris la limite de résolution de la technique elle-même (par exemple, l&#39;imagerie Doppler du flux sanguin), la capacité de mesure du absolu flux sanguin seulement (volume de sang par unité servant un organe) (par exemple tomographie par cohérence optique) et la mesure du taux de changement de vitesse dans une population nombreuse et hétérogène de vaisseaux sanguins 2,3. Le système circulatoire du foie relie différents sous-types de navires qui sont hétérogènes dans leur taille, la structure et la fonction. Danscette étude, la microscopie intravitale (IVM) la technologie d&#39;imagerie est appliquée pour évaluer l&#39;hémodynamique du foie in vivo, en temps réel, à haute résolution et en parallèle pour découvrir les caractéristiques des vaisseaux sanguins individuels qui composent l&#39;organe hépatique. Le développement récent de cette technique d&#39;imagerie optique puissant permet au chercheur de collecter des données dynamique sur des animaux vivants à une résolution spatiale et temporelle. En permettant la visualisation directe et surveillance en temps réel des processus biologiques spécifiques et rapides in vivo, IVM offre une occasion unique pour le chercheur aux vaisseaux sanguins individuels d&#39;image, et de mesurer et de quantifier la vitesse des globules rouges simples (RBC) dans un spécialement sélectionnés navire hépatique. Dans cette étude, nous avons mis en œuvre la technique IVM dans le foie de souris pour étudier l&#39;influence de l&#39;infection de la souris par le parasite Leishmania hépatotrope sur l&#39;hémodynamique du foie. L. donovaniest l&#39;agent responsable de la leishmaniose viscérale, une maladie grave caractérisée par des réponses inflammatoires aiguës-on-chronique et une pathologie qui est présent dans de multiples organes, y compris la rate et le foie. Dans un modèle expérimental chez la souris de la leishmaniose viscérale, l&#39;infection du foie est auto-résoudre alors que l&#39;infection de la rate est progressive 4. Ces résultats d&#39;infection Leishmania à l&#39;égard des organes individuels ne sont pas encore complètement compris. Enquête de foie et la rate hémodynamique dans des conditions pathologiques va apporter un nouvel éclairage sur les interactions hôte-parasite et la pathogenèse de la maladie. Notre système de modèle expérimental est basé sur l&#39;exposition et l&#39;imagerie du foie d&#39;une souris anesthésiée qui a reçu une injection intraveineuse de colorants fluorescents spécifiques pour l&#39;étiquetage de la intravasculature hépatique. Le foie est un organe favorable pour la microscopie intra-vital. Après avoir effectué un petit incision dans l&#39;abdomen, le foie est extériorisé doucement et placé sur de la gaze humide, puis sur une lamelle avec l&#39;objectif de réduire les artefacts de mouvement en raison de rythme cardiaque et la respiration. Le foie est ensuite placé à l&#39;intérieur de la vue d&#39;un objectif de microscope. Par rapport au noeud de la rate et de la lymphe qui nécessitent l&#39;utilisation de deux microscopie photonique pour les études IVM, l&#39;avantage du foie réside dans son architecture 3D homogène / anatomie qui permet l&#39;utilisation d&#39;un microscope confocal classique, avec une profondeur de pénétration maximum de environ 50 um, par imagerie par microscopie intravitale 5-8. Cette étude décrit deux méthodes d&#39;imagerie indépendantes pour la mesure quantitative de RBC vitesse et la vitesse du flux sanguin dans les vaisseaux sanguins individuels. Dans la première méthode, le débit sanguin hépatique est acquise en utilisant un mode bidimensionnel xy dans le temps. Les données de XYT en découlant sont analysés en utilisant le plugin MtrackJ dans le logiciel ImageJ libre, qui permet le suivi des individuel globules rouges dans le temps. Dans la seconde méthode, un seul vaisseau sanguin est sélectionné et son flux sanguin correspondant est analysée en utilisant le mode de balayage ligne de la confocal à balayage laser microscope acquisition rapide. Le navire d&#39;intérêt est numérisé à haute fréquence le long de son axe central par le biais d&#39;une ligne axiale. La vitesse d&#39;écoulement du sang est ensuite quantifié sur la base de la différence de contraste entre les érythrocytes et le plasma sombres non marquées marqué par fluorescence. Les intensités de fluorescence des globules rouges et le plasma acquises le long de la ligne de balayage sont en fonction du temps pour obtenir des stries, dont les angles sont proportionnels aux vitesses d&#39;un RBC individu. Le but de cet article est de fournir une méthode simple et reproductible pour l&#39;imagerie et mesure de la vitesse du flux sanguin dans les différents vaisseaux sanguins du foie et de mettre à disposition les outils de base pour l&#39;exécution réussie de la chirurgie de la souris, l&#39;IVM et des analyses quantitatives de la vitesse de globules rouges individuels. Tson approche permettra aux chercheurs d&#39;acquérir de nouvelles connaissances dans la vitesse du sang dans des conditions pathologiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Alexa 647</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>A34785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC 500 mol wt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>46947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>PanPharma</td>
			<td>20434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>KP07KEU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetedine</td>
			<td>Pharma Animal</td>
			<td>6869029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate liquid</td>
			<td>Cyanolit</td>
			<td>5833300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N&#176;: 5013</td>
			<td>Molecular machines</td>
			<td>50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm</td>
			<td>DiaPath</td>
			<td>61061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS-SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF viewer&#160;</td>
			<td>Leica software</td>
			<td>Version 3.1.0 buid 8587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics

Microscopie intravitale (IVM) est une technique d&#39;imagerie optique puissant qui a rendu possible la visualisation, la surveillance et la quantification des différents événements biologiques en temps réel et dans les animaux vivants. Cette technologie a considérablement fait progresser notre compréhension des processus physiologiques et les phénomènes de micro-organismes pathogènes médiation dans les organes spécifiques. Dans cette étude, IVM est appliquée sur le foie de la souris et les protocoles sont conçus pour l&#39;image in vivo du système circulatoire du foie et mesurer des globules rouges (RBC) à vitesse vaisseaux hépatiques individuels. Pour visualiser les différents sous-types de navires qui caractérisent l&#39;organe hépatique et effectuer des mesures de vitesse d&#39;écoulement du sang, C57BL / 6 souris sont injectées par voie intraveineuse avec un réactif de plasma fluorescent qui marque le système vasculaire du foie associée. IVM permet in vivo, en temps réel, la mesure de la vitesse de RBC dans un récipient d&#39;intérêt spécifique. L&#39;établissement de cette méthode, il sera possible deenquêter sur l&#39;hémodynamique du foie dans des conditions physiologiques et pathologiques. En fin de compte, cette méthodologie basée imagerie sera important pour l&#39;étude de l&#39;influence de L. infection donovani sur l&#39;hémodynamique hépatiques. Cette méthode peut être appliquée à d&#39;autres modèles infectieuses et des organes de la souris et peut être étendu à une pré-clinique essais de l&#39;effet d&#39;un médicament sur l&#39;inflammation par quantification de son effet sur le flux sanguin.

L&#39;organisation architecturale spécifique des sinusoïdes du foie peut être visualisé basé sur la propriété autofluorescente de cet organe (Figure 1, panneau B et C, vert), l&#39;injection intrapéritonéale de Hoechst pour l&#39;étiquetage des hépatocytes noyaux (figure 1B, bleu) et l&#39;injection intraveineuse de BSA fluorescent pour la coloration du système circulatoire hépatique (figure 1C, rouge). Le foie est composé de plusieurs sous-types différen...

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Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Microscopie intravitale imagerie du foie suivante<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Une évaluation de l&#39;hémodynamique hépatiques

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

11.4K vues.  University of Aix-Marseille. This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Vidéo: Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

L&#39;imagerie in vivo des parasites Leishmania transgéniques dans un hôte en direct

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Recherche

Immunologie et infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagerie intravitale du Thymus souris utilisant la 2-microscopie biphotonique

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopie intravitale de la rate: Analyse quantitative de la mobilité des parasites et la circulation sanguine

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imagerie intravitale du ganglion lymphatique poplité souris

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Two-photon Imaging intravitale des leucocytes au cours de la réponse immunitaire dans le foie de souris traitées Lipopolysaccharide

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Imagerie cellulaire Interaction dans la muqueuse trachéale au cours de l’infection par le Virus grippal à l’aide de la microscopie intravitale biphotonique

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...