This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

Nota: Les procédures animaux ont été effectuées en conformité avec le comité d&#39;éthique institutionnel de protection des animaux à Genève, la Suisse et l&#39;Office vétérinaire cantonal. Numéro d&#39;autorisation GE / 63/14. 1. Préparation d&#39;une seule cellule Suspension de la moelle osseuse <ol><li> Sacrifice des souris (8 à 12 semaines de old) par dislocation cervicale. Stériliser pattes de derrière avec 70% d&#39;éthanol. Enlever la peau des pattes postérieures. </li><li> Disséquer les fémurs de souris et les tibias et enlever les tissus des jambes avec un scalpel. Rincer les jambes avec 90% d&#39;éthanol et le placer dans une boîte de culture rempli de PBS. </li><li> Sous le capot de la culture, le tissu propre à partir de fémurs et tibias avec un scalpel et séparé à l&#39;articulation du genou. Couper chaque extrémité de l&#39;os. </li><li> Rincer la moelle osseuse de l&#39;os à l&#39;aide d&#39;une aiguille de 23G et une seringue de 1 ml avec du milieu rempli de préparation (rouge de phénol libre de DMEM / F12, le sérum de rat à 1%), en une vis 50 ml tube. Perturber agrégats de cellules par passage à travers la délicatesse ne 23Gedle et une seringue de 1 ml. Amener le volume total à 25 ml avec du milieu de préparation. </li><li> Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C. Surnageant défausse. Resuspendre le culot dans 1 ml de globules rouges tampon de lyse RBLC (8,3 g NH 4 Cl, 1 g de NaHCO 3, 1 ml d&#39;EDTA (100 mM), complète à 1 L avec de l&#39;eau distillée, filtre de 0,22 um) dans un 15 ml vis tube. Incuber 30 secondes sur la glace. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu de préparation et centrifuger à 250 x g, 5 min, 4 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de milieu de préparation. </li></ol> 2. neutrophiles enrichissement par sélection négative <ol><li> Ajouter 150 pi de souris enrichissement de neutrophiles cocktail (isolement des cellules de kit de plate-forme tels que EasySep). Mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Ajouter 10 ml de phénol DMEM sans rouge. Inversez fois centrifugeuse 250 xg, 3 min, 4 ° C. </li><li> Surnageant défausse. Resuspendre le culot dans 1,75 ml de milieu de préparation dans 5 ml polystyrène tubes ronds de fond. Ajouter 250 ul BiotSélection en cocktail. Mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Vortex les particules magnétiques (du kit de plate-forme d&#39;isolement cellulaire) pendant 30 secondes pour remettre en suspension des particules. Ajouter 500 pi de particules magnétiques à la suspension cellulaire. Mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Placer le tube dans l&#39;aimant. Attendre 3 min. </li><li> Inversez l&#39;aimant sur un nouveau 5 ml polystyrène tubes ronds en bas pour recueillir les cellules non marquées souhaitées. Ne pas prendre la dernière goutte suspendue dans le tube. Les cellules non désirées restent dans le tube à l&#39;intérieur de l&#39;aimant. Jeter ce tube en déchets biologiques dangereux. </li><li> Placez le nouveau tube dans l&#39;aimant. Attendre 3 min. </li><li> Inverser l&#39;aimant sur un nouveau tube de 15 ml à vis pour collecter les cellules non marquées souhaitées. Ne pas prendre la dernière goutte suspendue dans le tube. </li><li> Complète le volume à 5 ml avec du DMEM sans rouge de phénol. </li></ol> 3. L&#39;étiquetage des neutrophiles <ol><li> Ajouter 0,5 pi d&#39;un colorant orange, tels que téléphone mobile Tracker Orange (concentration de travail1 pm, SACSM - chlorométhyl-rodol-acétate, stock 10 mM dans le DMSO). Incuber 2 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 2,5 ml de milieu de préparation. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C. </li><li> Surnageant défausse. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu de préparation, dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Prendre une aliquote de compter avec hématocytomètre. </li><li> Incuber 5 min à 37 ° C. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C. </li><li> Surnageant défausse. Resuspendre le culot dans 1 ml de PBS. Centrifugeuse 250 xg, 5 min, 4 ° C à laver. </li><li> Surnageant défausse. Resuspendre le culot que 10x10 6 cellules par 100 pi de PBS. Garder sur la glace jusqu&#39;à ce que l&#39;injection intraveineuse. REMARQUE: les cellules doivent être iv injecté le plus rapidement possible. 6-12x10 6 neutrophiles / souris sont habituellement obtenue. </li></ol> 4. Préparation de la souris pour Microscopie intravitale REMARQUE:.. Etape 4.1) et 4.2) doit être effectué au début de l&#39;expérience, afin d&#39;éviter le temps d&#39;attente prolongée des neutrophiles marqués sur ice. <ol><li> Peser le CR1 GFP souris CX 3 (8-12 semaine ancienne). </li><li> Préparer 800 ul d&#39;anesthésiques kétamine (60 mg / kg, xylazine 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg dans du PBS). </li><li> Anesthésier la souris. Ip d&#39;injection avec 200 pl / 20 g de souris. Anesthésie de contrôle par l&#39;orteil pincement et en cochant la fréquence respiratoire. </li><li> Injecter neutrophiles (10x10 6 cellules dans 100 pi de PBS) par voie intraveineuse en utilisant les veines de la queue latérales ou le sinus rétro-orbitaire, à la convenance de l&#39;expérimentateur. </li><li> Placez la souris sur le coussin chauffant et protéger les yeux avec du gel oculaire. </li><li> Une lamelle de verre (diamètre 35 mm) est placé dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm, qui a un trou 30 mm de diamètre. Utiliser l&#39;huile est de maintenir la boîte de culture de tissu en contact avec la lamelle. </li><li> Inciser la peau abdominale avec des ciseaux pour exposer le péritoine. Inciser péritoine avec des ciseaux pour exposer intestin. </li><li> Ajouter 200 ul de PBS (pré-chauffée à 37 ° C) dans la peritoneal cavité. Prenez la souris dans votre main et tournez face vers le bas, de sorte que l&#39;intestin sort de la cavité péritonéale avec une légère pression. Placer la souris dans la boîte de culture tissulaire. </li><li> Deroll doucement l&#39;intestin avec des cotons-tiges stériles sur la lamelle afin d&#39;exposer les vaisseaux mésentériques. </li><li> Couper des mouchoirs en papier dans les bandes et les mouiller avec 37 ° C chauffé PBS. Immobiliser l&#39;intestin avec les morceaux de tissus en papier pour diminuer les mouvements résultant de péristaltisme. </li><li> Mettre le plat de culture de tissus et de la souris à l&#39;intérieur de la chambre thermostatée 37 ° C sur la scène du microscope inversé plateau sur mesure. Présentez une seringue contenant des anesthésiques sc dans la patte arrière. NOTE: En outre, la souris peut recevoir de l&#39;oxygène (0,5 L / min) avec un masque. </li><li> La souris de contrôle pour l&#39;anesthésie par orteil pincement et la vérification de la fréquence respiratoire toutes les 30 min. Si nécessaire, fournir un coup de pouce d&#39;anesthésiques (20 pi) de bien entretenir l&#39;anesthésie. NE PASE: Le séchage de la vascularisation doit être évitée. Par conséquent, son humidité est maintenue en mouillant régulièrement les mouchoirs en papier utilisés pour immobiliser l&#39;intestin à 37 ° C et réchauffé PBS. </li></ol> 5. Mesure des neutrophiles et des monocytes Comportement dans les navires enflammées in vivo en utilisant Microscopie intravitale <ol><li> Set lasers à 488- 561- et à la puissance la plus faible nécessaire pour éviter la phototoxicité induite par laser. Dans nos expériences, il est inférieur à 0,5%. Intensité de la GFP dans les monocytes et colorant orange dans les neutrophiles est si brillante que d&#39;habitude 0,3% est suffisant. NOTE: Cela représente une puissance laser de 0,15 à 0,25 mW avec notre système. </li><li> Acquérir des images de 512 x 512 pixels (soit 635 um) à 2.2 sec avec un sténopé ouverte en utilisant l&#39;objectif sèche du microscope inversé 20X. Utilisez un z-profondeur comprise entre 10 à 20 um, qui assure un signal suffisamment avec les puissances laser faible. REMARQUE: Nous effectuons habituellement des expériences avec un z-profondeur comprise entre 12 à 1656; m. Dans le cas des chiffres et des films présentés, la profondeur z-est de 20 um. Le contraste de phase permet l&#39;identification des parois endothéliales et l&#39;imagerie est effectuée sur les veines mésentériques. Comme les cellules de patrouille se déplacent assez lentement à une vitesse de 5 à 10 um / min 6, l&#39;enregistrement d&#39;un champ d&#39;intérêt toutes les 20 secondes est satisfaisant. Avec les réglages décrits, la platine motorisée permet l&#39;enregistrement de jusqu&#39;à 7 domaines d&#39;intérêt dans le même temps. </li><li> Placez la souris et les vaisseaux mésentériques dans la chambre de thermostat du microscope sont de leur permettre de se remettre de la préparation pendant 30 minutes avant l&#39;acquisition du premier film. Pendant ce temps, choisir plusieurs domaines d&#39;intérêt. Focus sur la surface luminale du vaisseau la plus proche de l&#39;objectif. Si nécessaire, profiter de la légère auto-fluorescence de l&#39;endothélium pour définir le focus. REMARQUE: Chirurgie lors de la préparation de la souris souligne légèrement l&#39;endothélium. Par conséquent, le produit laminé de neutrophiles et/ ou des monocytes peuvent être observés dans la première préparation suivante de 15 min de la souris. </li><li> Enregistrer un premier film pendant 30 min dans des conditions d&#39;état stable, une image toutes les 20 secondes. REMARQUE: Le logiciel acquiert chaque champ d&#39;intérêt en 2.2 sec et la platine motorisée se déplace automatiquement d&#39;un champ à l&#39;autre. Elle remonte à la première position dans les 20 secondes pendant les 30 min de l&#39;enregistrement du film. </li><li> Pour lancer inflammation des vaisseaux sanguins, ajouter une goutte de 20 pi de PBS contenant 100 ug de TLR2 / TLR1 agoniste PAM3CSK4 12 directement sur ​​les vaisseaux imagées. </li><li> Contrôler la mise au point pour chaque domaine d&#39;intérêt. NOTE: Dans le cadre de l&#39;acquisition, il ya toujours de légers changements de focalisation sur l&#39;axe z. Malgré le 10-20 um z profondeur, ce qui peut entraîner une diminution de l&#39;intensité de fluorescence. Par conséquent, recentrer manuellement chaque champ d&#39;intérêt à la fin de chaque film, si nécessaire. Enregistrez des vidéos pendant 30 min-périodes et jusqu&#39;à 3 h pourtal après l&#39;initiation de l&#39;inflammation. </li><li> A la fin de l&#39;expérience, les souris anesthésiée sacrifice par dislocation cervicale. </li></ol> 6. génération de fichiers vidéo et de suivi des leucocytes REMARQUE: Le logiciel d&#39;acquisition Nikon génère .nd2 fichiers, mais la procédure suivante serait similaire avec d&#39;autres logiciels et les marques. <ol><li> Exportation de fichiers que la série TIFF. </li><li> Accédez au logiciel ImageJ <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">(http://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> Importez la série de tiff. Chaque canal dans un fichier différent. </li><li> Appliquer un filtre médian avec un rayon de 2.0 pixel pour les canaux vert et rouge pour réduire le bruit de fond (Processus&gt; Filtres&gt; médians ...). </li><li> Convertir des fichiers en binaire (Processus&gt; Binary&gt; Faire binaire). Activer le logiciel pour calculer le seuil pour chaque image. </li><li> Fusionner canaux dans un seul séries d&#39;images (Image&gt; Couleur&gt; Fusionner les couches ...). Sélectionnez les monocytes dans le degrécanal n, les neutrophiles dans le canal rouge et la lumière transmise dans le canal gris. </li><li> Convertir images empilées en couleurs RVB (Image&gt; Couleur&gt; pile pour RGB). </li><li> Enregistrer le fichier .avi que </li><li> Les données sont importées et compilées dans un logiciel Imaris (Bitplane). Mouvements de monocytes et les neutrophiles sont ensuite suivis à l&#39;aide de l&#39;Assistant Suivi Spot. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Hordijk, P. 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Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall.</a> Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).</li><li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nr4a1-dependent+Ly6C(low)+monocytes+monitor+endothelial+cells+and+orchestrate+their+disposal.">Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.</a> Cell. 153, 362-375 (2013).</li><li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo.">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo.">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li><li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation.">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Les méthodes décrites dans ce manuscrit fournissent une approche cohérente pour étudier efficacement monocytes et le comportement des neutrophiles dans les veines mésentériques dans des conditions stables et inflammatoires. L&#39;étape cruciale de la préparation est l&#39;immobilisation de l&#39;intestin avec des tissus PBS-mouillées. Si effectué correctement, les vaisseaux mésentériques sont joliment exposés sur la lamelle pour l&#39;acquisition d&#39;image. Cela permet la sél...

<html> Neutrophiles et des monocytes sont des cellules du système immunitaire inné qui circulent en continu dans le sang. Lors de blessure ou d&#39;infection, les signaux inflammatoires induisent diapédèse leucocytaire dans les tissus endommagés et infectés, en entamant le présent mémoire une réponse immunitaire cellulaire 3.1. La rapidité de la mobilisation des leucocytes détermine le résultat positif des réponses immunitaires. Ces processus complexes reposent sur ​​des molécules spécifiques (par exemple, sélectines, des chimiokines de l&#39;endothélium lié) présents sur l&#39;endothélium enflammé qui aident à l&#39;établissement de contacts entre les adhésifs leucocytes circulants et l&#39;endothélium 1-3 .Pour obtenir un aperçu sur les molécules impliquées dans le leucocyte recrutement cascade, il est important de visualiser la cinétique de recrutement de cellules et de suivre le comportement de chaque cellule / population. Une méthode efficace consiste à microscopie intravitale sur des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules d&#39;intérêt. contenu &quot;&gt; À ce jour, plusieurs approches en utilisant la microscopie intravitale ont été développés à l&#39;image du système vasculaire 4,5. Par exemple, l&#39;imagerie du derme de l&#39;oreille vasculaire ou des veines mésentériques par microscopie confocale intravitale a été utilisé pour identifier le comportement de patrouille de Ly6C murin faibles monocytes et humaine CD14 dim CD16 + monocytes sur la face luminale de vaisseaux sanguins dans des conditions d&#39;état d&#39;équilibre de 6-8. Le modèle de système vasculaire crémaster de la souris est souvent utilisé pour surveiller le comportement des neutrophiles ou Ly6C inflammatoire élevés monocytes dans des conditions inflammatoires ou ischémiques chez les souris transgéniques. Dans ce cas, crémaster est stimulée par injection de intrascrotale IL1β, CCL2, TNFß ou fMLP. Après 2-4 heures, les tissus sont ensuite chirurgicalement extériorisés et analysés par microscopie confocale intravitale 9-11. Le protocole suivant décrit un procédé pour surveiller les monocytes et neutrophiles dans le même temps à toutefluorescence inversé de microscope confocal. En outre, notre méthode en détail comment l&#39;image du même navire avant (d&#39;état d&#39;équilibre) et après l&#39;inflammation et comment suivre la cinétique de recrutement des leucocytes. A cet effet, nous utilisons le CX 3 CR1 souris GFP / poids, dont les monocytes expriment eGFP, iv injecté avec une orange neutrophiles murins marqués par un colorant. En utilisant un microscope confocal inversé, il est possible (1) pour suivre et analyser les patrouilles Ly6C faibles monocytes dans des conditions stables et (2) de suivre le recrutement de deux monocytes et neutrophiles dans le même navire après une inflammation locale. Ici, nous créons les conditions inflammatoires en utilisant l&#39;agoniste TLR2 / TLR1 PAM3CSK4 12. En outre, comme l&#39;imagerie peut aider à déterminer le rôle de molécules spécifiques d&#39;intérêt dans les différentes étapes de la cascade de recrutement des leucocytes si elle est effectuée sur des souris knock-out spécifiques ou en présence d&#39;anticorps bloquants 6,9,13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tubes&#160;</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CFI Plan Apochromat 0.45&#160;&#160; DT:4mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75&#160;&#160; DT:1mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Orange CMRA Dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>19762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil Type A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>any viscous oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Life Box Temperature Control System</td>
			<td>Life Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R</td>
			<td>inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol red free DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>any phenol red free medium is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAM3CSK4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>reconstitute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture dish 100</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging neutrophils and monocytes in mesenteric veins by intravital microscopy on anaesthetized mice in real time

Réponse immunitaire efficace dépend de mobilisation rapide des leucocytes du sang vers le site de l&#39;infection ou de blessure. Enquêter la migration des leucocytes in vivo est cruciale pour la compréhension de la base moléculaire de la migration des leucocytes transendotheliale et l&#39;interaction avec l&#39;endothélium vasculaire. Une approche puissante implique microscopie intravitale sur des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules d&#39;intérêt. Ici, nous présentons un protocole pour les monocytes et les neutrophiles d&#39;imagerie dans la gfp CR1 / poids iv de la souris injectée avec CX 3 oranges neutrophiles marqués par un colorant avec un microscope confocal inversé. Films time-lapse recueillies auprès de 30 minutes à plusieurs heures d&#39;imagerie permettre à l&#39;analyse du comportement des leucocytes dans les veines mésentériques sous les deux conditions stables et inflammatoires. Nous décrivons également les étapes pour induire localement inflammation des vaisseaux sanguins avec TLR2 / TLR1 agoniste Pam3SK4 et surveiller la subsequent recrutement des neutrophiles et des monocytes. La technique présentée peut également être utilisé pour contrôler d&#39;autres populations de leucocytes et étudier molécules impliquées dans le recrutement des leucocytes ou la traite à l&#39;aide d&#39;autres stimuli ou des souris transgéniques.

Le manuscrit décrit un protocole optimisé pour contrôler facilement le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques de souris anesthésiées en temps réel. L&#39;utilisation d&#39;une chambre de 37 ° C-thermostatée est impératif de maintenir la température de la souris et également en raison du mouvement des leucocytes dépendant de la température. Préparation de la souris est affiché sur la figure 1. La figure 2 montre l&#39;ensemble de la ...

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Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K vues.  University of Geneva. We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Vidéo: Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Recherche

Immunologie et infection

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

L&#39;étude des interactions de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Avec des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie Time Lapse

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Interactions Microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Imagerie en direct de l&#39;activité par Human Antifongique primaire neutrophiles et des monocytes en réponse à<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Imagerie cellulaire Interaction dans la muqueuse trachéale au cours de l’infection par le Virus grippal à l’aide de la microscopie intravitale biphotonique

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The current protocol represents a practical and reproducible method to visualize the leukocyte endothelium interaction leading to leukocyte recruitment in skeletal muscle derived tissue within the intact organism of the mouse. The model is applicable to all fields of research that focus on granulocyte activation and their role in disease.
We provide a step by step protocol to guide through the method and to highlight potential pitfalls and technical difficulties. The protocol covers the following aspects: experimental settings and required material, anesthesia of the mouse, dissection of the cremaster muscle as well as tracheal and carotid cannulation, IVM recordings and offline analysis. Data formats like adherent leukocytes, rolling flux (RF) and rolling flux fraction (RFF) are explained in detail and appropriate applications are discussed. Representative results from dystrophin deficient mdx mice are provided in the results section.
IVM is a powerful tool to assess leukocyte recruitment in an in vivo setting; however, delineating for example endothelial and leukocyte function may require a combination with ex vivo setups like flow chamber experiments. Furthermore, the genetic background of animals of interest may greatly influence baseline recruitment, requiring individual fine tuning of the protocol provided. Despite its limitations, IVM may serve as a platform to readily translate in vitro findings into a living vertebrate organism.

Here, we show how to perform intravital microscopy on post-capillary venules of the mouse cremaster muscle. Commonly applied to different models of inflammation and sepsis, particularly those induced by chemokines and cytokines, we highlight its relevance in the study of muscolopathies involving exaggerated muscular leukocyte infiltration.

Infiltration de Leukocyte de Cremaster Muscle chez les souris évaluées par microscopie intravitale

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...