Ce travail est financé par les Instituts canadiens de recherche en santé, la Fondation canadienne pour l&#39;innovation, Université de British Columbia Centre for Blood Research et l&#39;Université du Nord de la Colombie-Britannique.

1. Préparation des réactifs <ol><li> Réactifs qui seront utilisés tout au long de l&#39;expérience devrait être préparé avant de commencer le protocole chirurgical. Notez que toutes les solutions ont été faites en utilisant une technique stérile. </li><li> Sérum physiologique (PSS) est le mieux préparé en deux composantes: une solution de sel de base et une solution de bicarbonate de sodium. Préparer des solutions à la concentration de 20X et stocker à 4 ° C. Le bicarbonate de sodium à 20X est 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) et une solution de sel de base à 20X la concentration est 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mm CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), et 23.4mm MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). Les solutions doivent être préparées en DH 2 O et les produits chimiques doivent être ajoutés un à un et agité jusqu&#39;à solution est limpide avant d&#39;ajouter le produit chimique suivante </li><li> Préparer 2L du PSS en diluant des volumes égaux de solution de bicarbonate de sodium et le sel de base et dilue la concentration de 1X (pour deux 2L du PSS diluer 100 ml de chaque solution de bicarbonate de sodium et le sel de base dans dH 2 O </li><li> Fiole jaugée Placez 2L contenant PSS et PSS à 37 ° C bain-marie. Equilibrer la solution avec 5% de CO 2 / azote gazeux équilibre pour 1h avant le début de la procédure chirurgicale. </li><li> Produits chimiques vasoactif (ex. phényléphrine, l&#39;acétylcholine, le nitroprussiate de sodium) sont les mieux préparés à une concentration 1M de dH2O et stockés dans 100 ul aliquotes à -20 ° C. </li></ol> 2. Préparation des animaux <ol><li> Déterminer le poids de la souris et d&#39;administrer la dose initiale de pentobarbital de sodium à 90mg/kg par injection intrapéritonéale. Tout au long de la procédure de la souris est continuellement surveillée pour le plan d&#39;anesthésie par pincement de l&#39;orteil et l&#39;examen minutieux de la fréquence respiratoire. Injections supplémentaires de pentobarbital de sodium doit être administré au besoin, à 20mg/kg de maintenir avion anesthésie. Le plan chirurgical d&#39;anesthésie est entretenu conformément aux règlements fédéraux et institutionnels tel que décrit dans le protocole de soins des animaux approuvée par le Comité de protection des animaux et de l&#39;utilisation (ACUC) de l&#39;University of Northern BC. </li><li> Enlever les poils de la zone abdominale et le flanc / hanche en rasoir. Retirer restantes cheveux dénoués par tampon imbibé d&#39;alcool et de tapoter la zone avec du ruban adhésif. Cela est suffisant que cette procédure expérimentale est en phase terminale. </li><li> Placez la souris sur un conseil clair chirurgicale en position couchée et attacher la souris pour le conseil en enregistrant chaque coussinet plantaire à la planche. La température corporelle est maintenue par une lampe de chaleur externe et surveillé via thermomètre rectal pour s&#39;assurer que l&#39;hypothermie ne se produit pas en raison de l&#39;anesthésie. </li></ol> 3. Procédure chirurgicale <ol><li> Pendant toute la procédure chirurgicale d&#39;assurer tissu exposé est toujours maintenu superfusées avec une solution équilibrée PSS réchauffé. Il est également important de ne jamais entrer en contact avec la vascularisation d&#39;intérêt avec des instruments chirurgicaux ou de blesser les vaisseaux en plaçant à la force de beaucoup sur eux en manipulant les tissus adipeux et le tissu conjonctif qui les entourent. </li><li> Placez la souris sous le microscope à dissection. Faire une incision médiane le long de la surface ventrale de la cavité abdominale et rétracter la peau vers la colonne vertébrale de la souris. </li><li> Une fois que la peau se rétracte pour que le LN est facilement visible, la broche de la peau sur un piédestal de transparence Sylgard 184. </li><li> Retirez la mince couche de tissu conjonctif recouvrant la zone autour de la LN </li><li> Effacer la superposition du tissu adipeux et entourent les ganglions lymphatiques jusqu&#39;à ce que le lit microvasculaire est exposée. Le segment des principales artères pose à côté de la LN et est couramment recouvert par la veinule. La chirurgie prend environ 30 minutes. </li></ol> 4. Imagerie et analyse des navires <ol><li> Une fois le segment des navires d&#39;intérêt est exposé sous le coup de dissection, sécuriser la préparation sur le microscope intravitale. Notez que les restes d&#39;animaux sur le plateau claires chirurgicale tandis que sur le microscope intravitale pendant toute la durée de l&#39;expérience. La température corporelle est maintenue par une lampe chauffante et mesurée par thermomètre rectal comme décrit lors de la section chirurgicale. L&#39;avion d&#39;anesthésie est également surveillé tout au long de l&#39;expérience comme décrit dans la section 2.1. </li><li> Mettre en place la surfusion et des lignes d&#39;aspiration. Superfusion du PSS se fait par l&#39;alimentation par gravité à partir d&#39;un réservoir, vers le réservoir d&#39;eau chauffée veste (la veste de l&#39;eau est distribuée et chauffée par le bain-marie circulateur) étant perfusé par le CO 2 5% d&#39;azote équilibré, et en bas une ligne au goutte à goutte à un taux de 10ml / min. Un tuyau d&#39;aspiration doit être utilisée pour continuer tirez PSS superfusées loin de la préparation. Notez que avant l&#39;expérience des lignes d&#39;aspiration et la chemise d&#39;eau sont soigneusement nettoyés et stockés après chaque expérience. Cela garantit la stérilité avant l&#39;expérience suivante. </li><li> Vérifiez la température de la PSS superfusing. Réglez la température de lacirculant bain d&#39;eau et / ou le taux de surfusion PSS pour atteindre une température de ~ 37 ° C à travers la préparation. </li><li> Autoriser la vascularisation s&#39;équilibrer avec PSS pour au moins 60 minutes et de quantifier le diamètre du vaisseau en utilisant l&#39;étrier vidéo. Typiquement, le diamètre du vaisseau devrait être déterminée en des points multiples (par exemple, à 40, 50 et 60 minutes) pour s&#39;assurer que le navire s&#39;est stabilisé. </li><li> Évaluer la santé de la cuve à l&#39;aide d&#39;un agoniste du muscle lisse spécifiques (ex. phényléphrine, PE) et un agoniste endothélium spécifiques (ex.: l&#39;acétylcholine, l&#39;ACh). Concentration d&#39;agoniste doit être ajustée en fonction de l&#39;agoniste, mais pour le PE et Ach le navire doit être évaluée à chaque concentration par addition cumulative (10-5M à 10-9M) à l&#39;superfusat. Chaque demande agoniste doivent être séparées par une phase de lavage (généralement 30 minutes) en utilisant PSS jusqu&#39;à ce que le navire rentre au diamètre de repos. </li><li> Après évaluation de la santé des navires, à la suite médicaments vasoactifs, marquage fluorescent, et la cellule de traçage expériences peuvent être menées. </li><li> Après la fin de l&#39;expérience de l&#39;animal est donné une surdose de pentobarbital de sodium. L&#39;animal est ensuite surveillé pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;ya pas de réponse à pincement de l&#39;orteil et l&#39;absence de mouvement respiratoire ou battement de coeur. Au moment où ceci est suivi par dislocation cervicale. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Après la période d&#39;équilibrage de la préparation devrait donner une image claire qui permet d&#39;identifier à la fois l&#39;artériole et la veinule qui alimente le ganglion lymphatique inguinal. Il devrait y avoir un minimum de cellules adipeuses entourant les vaisseaux pour permettre aux murs de l&#39;artériole et la veinule être clairement observées pour les étriers de la vidéo à superposer pour calculer le diamètre du vaisseau. Le point intégrante d&#39;une préparation réussie est l&#39;artériole a une alimentation riche en sang en mouvement dans la lumière et qu&#39;il ya un degré significatif de tonus vasculaire (c&#39;est à dire l&#39;artériole a la capacité de vasoconstriction et d&#39;vasodilate muscles lisses et endothéliales agonistes spécifiques respectivement) . <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Image de microscopie intravitale des ganglions inguinaux nourrissent artériole (flèche rouge) d&#39;alimentation du ganglion lymphatique équilibrée avec une solution saline physiologique et courir le long du côté de la veinule principale (flèche verte). <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Vasoactifs réponse normale à la phényléphrine superfusées (PE) par addition cumulative d&#39;eau physiologique à partir des concentrations 10 -9 M à 10 -5 M. La présence d&#39;une vasoconstriction robuste est suggestive de la fonction musculaire normale lisses présentes dans l&#39;artériole. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Vasoactifs réponse normale à l&#39;acétylcholine superfusées (ACh) par l&#39;addition cumulée à partir de sérum physiologique des concentrations de 10 -9 M à 10 -5 M. La présence d&#39;une vasodilatation robuste est suggestive de l&#39;actuelle fonction normale endothéliale dans l&#39;artériole.

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	<li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle.">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li><li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle.">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li><li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle.">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li><li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats.">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li><li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer.">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li><li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries.">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li></ol>

Microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal présentée ici permet de microvascularisation image du ganglion in-vivo. Ainsi, il facilite un moyen de direct, en temps réel d&#39;observation. L&#39;imagerie de la microvascularisation LN est un site unique qui permet d&#39;étudier l&#39;interface entre la réponse immunitaire et le système vasculaire. Utiliser cette préparation, l&#39;accent peut être dirigé spécifiquement à la réponse immunitaire, des altérations dans le système vasculaire, ou à l&#39;interaction entre les deux. Comme avec toutes les approches expérimentales, la norme microscopie intravitale a la fois des avantages et des limites. Standard IVM, tels que la préparation est décrit ici peut facilement être modifié, et a déjà été démontré par les auteurs pour permettre à la microscopie à épifluorescence via l&#39;introduction de colorants traceur fluorescent ou de populations de cellules étiquetées. Bien IVM norme ne donne pas la possibilité de imagerie tridimensionnelle et de traçage, comme serait donné par microscopie à deux photons ou d&#39;angiographie, le suivi de la cellule est toujours réalisé en deux dimensions permettant de cellule à cellule et cellule-à-vasculaire à l&#39;interaction observés et quantifiés et en liaison avec l&#39;administration in vivo et coloration subséquente avec des anticorps fluorescents peuvent être utilisés pour fournir des données sur les protéines / marqueur d&#39;expression en temps réel. Notamment, les techniques d&#39;imagerie alternatives nécessitent un environnement statique pour les images; de serrage de la zone chirurgicale ou l&#39;ajout d&#39;une lamelle sur une préparation plat est souvent nécessaire. Cette limite, voire élimine, la capacité à perfuser activement médiateurs vasculaires ou d&#39;autres sur la préparation d&#39;évaluer l&#39;intégrité vasculaire et de la physiologie etc, ou l&#39;utilisation d&#39;autres techniques telles que des expériences menées dans la vasodilatation de la préparation IVM. Par ailleurs, la norme IVM ne nécessite pas une préparation complètement à plat et n&#39;est pas affectée par le mouvement, tels que celui généré par la respiration de l&#39;animal. Cela permet IVM standard à utiliser dans des zones plus chirurgical avec une plus grande reproductibilité. Ceci est illustré par la préparation ganglion lymphatique inguinal décrites ici. Etant donné la taille et la forme des ganglions lymphatiques, la préparation ne peut être faite à plat, sans blesser les tissus et l&#39;emplacement du nœud donne lieu à des mouvements significatifs dus à la respiration des animaux. Ces questions seraient difficiles à surmonter par d&#39;autres méthodes, mais sont facilement traitées en utilisant la préparation IVM standard décrit. En résumé, la préparation détaillée ci-dessus peuvent être combinés avec n&#39;importe quel nombre d&#39;autres biochimiques, vasculaires et / ou techniques immunologiques telles que le transfert de parties de cellules activées ou étiquetés, l&#39;induction de l&#39;hypoxie, et la sur-expression de l&#39;épuisement des médiateurs vasculaires. Cependant, des applications supplémentaires sont dépendants de la santé de la préparation initiale. Par conséquent, il est essentiel de toujours tester la santé de la vascularisation observée et évaluée. Points clés pour atteindre une préparation de la santé sont d&#39;assurer la préparation est constamment perfusé avec PSS équilibré à la température du corps et de minimiser le contact et le stress placé sur la zone opérée pendant la chirurgie.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th></tr><tr><td> Bicarbonate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Chlorure de Potassium </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Chlorure de calcium </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Nitroprussiate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Phényléphrine </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> L&#39;acétylcholine </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Le chlorure de magnésium heptahydraté </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Sodium pentobarbital </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of the inguinal lymph node

Les ganglions lymphatiques (LN), situés à travers le corps, sont une composante intégrante du système immunitaire. Ils servent un site pour l&#39;induction de la réponse immunitaire adaptative, et donc, le développement de cellules effectrices. En tant que tel, LNS sont la clé de la lutte contre les pathogènes envahisseurs et le maintien de la santé. Le choix de la LN à l&#39;étude est dicté par l&#39;accessibilité et le modèle désiré, le ganglion lymphatique inguinal est bien situé et supporte facilement les études de modèles biologiquement pertinentes de la peau et les muqueuses génitales d&#39;infection. La LN inguinale, comme tous les ganglions, dispose d&#39;un réseau microvasculaire étendue lui fournissant le sang. En général, ce réseau microvasculaire comprend l&#39;artériole l&#39;alimentation principale de la LN que par la suite les branches et les aliments de haute veinules endothéliales (HEV). HEV sont spécialisés pour faciliter le trafic des cellules immunitaires dans le LN pendant les deux homéostasie et de l&#39;infection. Comment réguler le trafic HEV dans la LN en vertu de ces circonstances est une zone d&#39;exploration intense. La LN nourrissent artériole, a une influence directe sur l&#39;amont HEV et l&#39;alimentation principale de nutriments et de cellules du sang riche dans le LN. Par ailleurs, des changements dans l&#39;artériole alimentation sont impliqués dans la facilitation de l&#39;induction de la réponse immunitaire adaptative. Le système microvasculaire LN a une importance évidente dans le maintien d&#39;un approvisionnement en sang optimal à la LN et de réglementer l&#39;afflux de cellules immunitaires dans le LN, qui sont des éléments cruciaux dans la fonction LN et la réponse adéquate suite immunitaire. La possibilité d&#39;étudier la microvascularisation LN in vivo est la clé pour élucider la façon dont le système immunitaire et le système microvasculaire interagissent et s&#39;influencent les uns les autres au sein de l&#39;LN. Ici, nous présentons une méthode pour l&#39;imagerie in vivo du ganglion lymphatique inguinal. Nous nous concentrons sur l&#39;imagerie de la microvascularisation de la LN, en accordant une attention particulière aux méthodes qui assurent l&#39;étude des vaisseaux sains, la capacité à maintenir l&#39;imagerie des vaisseaux viables sur un certain nombre d&#39;heures, et la quantification de l&#39;ampleur du navire. Méthodes pour la perfusion de la microcirculation avec des médicaments vasoactifs ainsi que le potentiel de tracer et de quantifier le trafic cellulaire sont également présentés. Microscopie intravitale de la LN inguinale permet une évaluation directe de la fonctionnalité microvasculaires et en temps réel de l&#39;interface directe entre les cellules immunitaires, les LN, et la microcirculation. Cette technique pourrait être combinée avec des techniques immunologiques nombreuses et l&#39;étiquetage des cellules fluorescentes ainsi que pour étudier la vascularisation manipulé de LNS autres.

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Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Une technique pour effectuer la microscopie intravitale du ganglion inguinal (LN) est décrite. Cette technique permet en temps réel,<em&gt; In vivo</em&gt; Une étude de la microvascularisation des ganglions lymphatiques et de la structure à la fois lors de l&#39;homéostasie et de l&#39;infection. Cette technique peut être adaptée à des études de trafic cellulaire et à d&#39;autres sites ganglionnaires.

Microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

intravital-microscopy-of-the-inguinal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.9K vues.  University of Northern British Columbia. Une technique pour effectuer la microscopie intravitale du ganglion inguinal (LN) est décrite. Cette technique permet en temps réel, In vivo Une étude de la microvascularisation des ganglions lymphatiques et de la structure à la fois lors de l'homéostasie et de l'infection. Cette technique peut être adaptée à des études de trafic cellulaire et à d'autres sites ganglionnaires.

Vidéo: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo l&#39;imagerie de cellules T dans murin tranches avec des ganglions lymphatiques et la microscopie confocale Widefield

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Recherche

Immunologie et infection

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine chirurgie superficielle des ganglions lymphatiques

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagerie intravitale du Thymus souris utilisant la 2-microscopie biphotonique

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopie intravitale de la rate: Analyse quantitative de la mobilité des parasites et la circulation sanguine

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imagerie intravitale du ganglion lymphatique poplité souris

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolement de cellules murines ganglions lymphatiques stromales

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Microscopie intravitale imagerie du foie suivante<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Une évaluation de l&#39;hémodynamique hépatiques

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Collecte et traitement des ganglions lymphatiques des animaux de grande taille pour l’analyse de l’ARN : préparation pour l’étude de transcriptomique ganglion des grandes espèces animales

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...