Les auteurs tiennent à remercier le Dr Lars Philipsen de l&#39;aide pour optimiser les films intravitale, le Dr Jonathan Lindquist pour les lire attentivement le manuscrit, et tous les membres du laboratoire pour les discussions Gunzer et commentaires très utiles lors du développement de la méthode. Ce travail a été financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) à MG

1. Infection <ol><li> Conidies gonflées de la moisissure Aspergillus fumigatus (souche ATCC 46645) sont générés par la pré-incubation dans du RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Allemagne) supplémenté avec 5% de FCS (v / v). 2x10 7 repos conidies sont remis en suspension dans 5 ml de milieu et incubées dans une plaque à 6 puits de culture de tissu (PPT AG; Trasadingen, Suisse, catalogue # 92006) pour 7h à 37 ° C. </li><li> Après la période de gonflement, les spores sont marqués par fluorescence en ajoutant 10 pl de solution de calcofluor fond blanc (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Allemagne, le numéro de catalogue F3543; [25 mg / ml] dans du DMSO) à chaque Aspergillus contenant bien dans le 6-même plaque, atteignant une concentration finale calcofluor de 50 ug / ml de RPMI. Suite à un mélange doux, les spores sont incubées pendant 15 minutes supplémentaires à 37 ° C. </li><li> Dans l&#39;étape suivante, les spores sont récoltées par filtration à travers un tamis 70 cellules um (BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne). Après un lavage une fois avec 10 ml de PBS (centrifugeuse à 900xg pendant 5 min à température ambiante), le culot est resuspendu dans 2 ml de PBS et le nombre total de conidies gonflées déterminée en comptant avec une chambre de Neubauer. Enfin, la suspension de spores sont centrifugés à 900xg pendant 5 min à température ambiante, le surnageant est soigneusement enlevé, et le culot remis en suspension à la concentration finale de 1x107 spores par 100 ul de PBS. </li><li> Pour l&#39;infection, 100 pi de solution de spores est appliquée par voie intratrachéale à des souris femelles (C57/BL6, 8-10 semaines, Harlan, Allemagne). Si les neutrophiles sont à observer ainsi, l&#39;utilisation de Lys-EGFP souris, portant EGFP sous le promoteur du lysozyme 1 est recommandée. Commencez par anesthésier l&#39;animal avec une injection ip unique de 150 ul Kétamine / Rompun solution (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Allemagne (kétamine) et Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Allemagne (Rompun), 1 ml kétamine [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml de NaCl stérile [0,9%]). 5 minutes plus tard la souris anesthésiée peut être fixé avec une bande élastique par ses dents à la rampe (c&#39;est à dire une surface en pente) pour faciliter l&#39;intubation (figure complémentaire 1). En utilisant des pinces, la langue est tirée d&#39;un côté et un cathéter veineux à demeure 22G (B. Braun AG, Melsungen, Allemagne, Vasofix Braunüle) peut être inséré doucement dans la trachée sous un éclairage permanent avec une lampe col de cygne. L&#39;insertion réussie de la sonde est vérifiée par l&#39;observation de mouvements réguliers du thorax de l&#39;animal avec la fréquence de la ventilation mécanique. Lorsque l&#39;intubation a été confirmée, la suspension 100 ul spores est appliquée à l&#39;aide d&#39;une micropipette 100 pi. Ce volume devrait être inhalés par l&#39;animal sans aucune aide supplémentaire en 1-2 s. Une meilleure répartition des particules fongiques à l&#39;intérieur du poumon est atteint par la ventilation mécanique de l&#39;animal infecté pendant 2 minutes avec un respirateur pour petits animaux (Minivent, Hugo Sachs, Mars-Hugstetten, Allemagne) à raison de 250 respirations par minute et un volume d&#39;inhalation de 300 ul par le souffle (figure supplémentaire 2). Après que les animaux d&#39;infection sont retournés dans leur cage et observées toutes les 5 minutes jusqu&#39;à ce déambulatoire à nouveau. Souris ne montrent aucun signe de douleur ou de détresse pendant la période d&#39;incubation suivant. </li></ol> 2. La préparation du poumon <ol><li> 7 h après l&#39;infection par les spores, l&#39;animal est euthanasié par une surdose de l&#39;isoflurane (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Allemagne) jusqu&#39;en mouvements et la respiration a cessé depuis plus de 30 secondes. Cette étape est suivie par thoracotomie comme méthode secondaire pour assurer la mort clinique et de permettre la visualisation et l&#39;accès de la trachée et les poumons. Ensuite, le coffre est ouvert avec soin afin d&#39;exposer les poumons et les voies respiratoires supérieures. Puis un autre cathéter 22G veineuse est insérée dans la trachée à partir de l&#39;épiglotte exposés. Grâce à ce tubule les poumons sont remplis avec 1 ml préchauffé faible point de fusion d&#39;agarose (2% p / v, Promega, Mannheim, Allemagne) en utilisant une seringue de 1 ml Omnifix (B. Braun). Dès que les poumons sont remplis de la trachée est lié avec un morceau court de fil à coudre et l&#39;animal entier est mis dans un réfrigérateur à 4 ° C. </li><li> 15 min plus tard, quand l&#39;agarose solidifié, tout le poumon est excisé à compter de la trachée. En utilisant une paire de ciseaux pointus, le lobe du poumon droit est ensuite retiré, la surface inférieure est brièvement séché sur une feuille de papier de soie, puis le lobe entier est collé à la préparation d&#39;un bloc de Vibroslice vibratome (Campden Instruments, Royaume-Uni, 752m ) en utilisant une goutte de colle tissulaire pour la fixation (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Allemagne, Roti-Coll 1). Après 1 min le bloc est installé dans la chambre de coupe de l&#39;vibratome, qui est rempli avec pré-réfrigérée (4 ° C) PBS. Le vibratome est fixé à une vibration de milieu de gamme (5 sur 10 max.) Et aussi une vitesse modérée (5 sur 10 max.) Telle que une coupe horizontale de l&#39;poumon est produite. La moitié supérieure de l&#39;organe est ensuite transféré dans une petite boîte de Petri en plastique (5 cm de diamètre) où elle est inversée et fixe avec une rondelle self-made-plat (1 cm de diamètre interne) qui est couvert par un ensemble de fils de nylon en parallèle, chaque mm 1 part (figure complémentaire 3). Enfin, la boîte de Pétri est rempli avec 10 ml de PBS supplémenté avec 10 pl de la teinture orange ADN Sytox [5 mm] (Invitrogen, Allemagne) résultant en une concentration finale de teinture de 5 uM. </li></ol> 3. Microscopie laser 2-photons <ol><li> La boîte de Pétri contenant l&#39;échantillon des poumons est alors installé sous l&#39;objectif du microscope pour que le tampon peut être chauffé à 37 ° C par un capteur de température contrôlée chauffe (figure complémentaire 4). 2-microscopie biphotonique est ensuite réalisée sur la surface de coupe entière en utilisant un microscope Zeiss LSM 710 NLO debout sur une scène Axio Examiner équipé d&#39;un objectif 20xNA1.0 l&#39;eau plongeant (Zeiss, Jena, Allemagne). Pour l&#39;imagerie, les différentes zones le long de la section sont numérisés jusqu&#39;à 400 um de profondeur en utilisant une longueur d&#39;onde de 800 nm d&#39;illumination détecter vert (530 nm) et rouge (580 nm) de fluorescence, ainsi que la génération de second harmonique (SHG) et le signal bleue calcofluor de fluorescence (à 400-470 nm d&#39;émission) avec des détecteurs externes non descanned (DDN). En outre images 2-D et des films laps de temps (1 image toutes les 5-10 secondes), simples ou répétitives piles image en 3 dimensions peuvent ensuite être rendu comme des rendus d&#39;images voxels ou simple attention prolongée ou 4-D des données (3D temps) à l&#39;aide logiciels différents. Cette configuration permet l&#39;observation au microscope du comportement cellulaire dans un environnement presque intacte, car il constitue le port d&#39;entrée pour une variété de pathogènes aéroportés, est d&#39;une importance énorme immunologiques. Motilité cellulaire, la phagocytose et la production nette par les neutrophiles endogènes après infection par la moisissure Aspergillus fumigatus peuvent être facilement étudiés sous ces conditions in situ. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Si c&#39;est fait correctement l&#39;imagerie va générer 2 - ou 3-couleurs des diapositives ou des films. Bien que la coloration est faite dans une procédure de post-traitement et est donc librement adaptables, nous avons généralement de sélectionner un schéma de couleurs qui reflète la couleur naturelle de la teinture / signal, qui est détectée dans le canal relatif. Ainsi, les colorants Sytox sont représentées en rouge, le champignon ainsi que le signal SHG est représentée en bleu, et, s&#39;il est présent, EGFP cellules marquées sont colorées en vert. Dans le premier exemple (fig. 1) le signal SHG bleue représente les fibres du tissu d&#39;un poumon non infectés et le signal rouge Sytox est produite par des noyaux de cellules pulmonaires-résident à ciel ouvert par le vibratome. Dans le second exemple (fig. 2) un poumon infecté est représenté, où les deux structures, alvéolaires ainsi que les masses fongiques, apparaissent en bleu, tandis que les noyaux et les filets sont colorés en rouge. Le troisième exemple (fig. 3) est d&#39;un animal transgénique EGFP-Lys, où en plus des structures de bleu et rouge les neutrophiles vert peut aussi être vu. La migration des neutrophiles et leur phagocytose des éléments individuels fongique dans les séquences laps de temps est montré dans le film supplémentaire. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. L&#39;apparition d&#39;une tranche de poumon non infectés dans les 2-2-couleurs microscopie biphotonique. Une tranche du poumon a été préparée à partir d&#39;un non-infectées C57/BL6 souris et imagé comme décrit dans le protocole. Présentés ici sont le signal SHG de la structure du tissu alvéolaire (A), le signal Sytox de noyaux de cellules à ciel ouvert lors de la préparation de la tranche de poumon (B), et une superposition des deux canaux (C). La zone encadrée en (C) est vu élargi en (D). S&#39;il vous plaît noter le tissu fibreux dans le bas du poumon tranche par rapport à l&#39;organisation clairement alvéolaires dans les zones de respiration-active du poumon ci-dessus. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. L&#39;apparition d&#39;une tranche de poumon d&#39;un type de Aspergillus animal sauvage infecté au 2-2-couleurs microscopie biphotonique. Une tranche poumons d&#39;une souris infectée C57/BL6 7 h avant avec A. fumigatus a été préparé et imagé comme décrit dans le protocole. Montré est la structure combinée de champignons et de SHG du tissu alvéolaire (A), le signal d&#39;Sytox NET ADN ainsi que des noyaux de cellules à ciel ouvert lors de la préparation de la tranche de poumon (B), et une superposition des deux canaux (C) . La zone encadrée en (C) est vu élargi en (D). S&#39;il vous plaît noter que les domaines clairement distincts des masses fongiques, alvéoles, et NET-structures sont marquées par les lettres F, A et N, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. L&#39;apparition d&#39;une tranche de poumon d&#39;un Aspergillus infectés Lys-EGFP animal en 3-2-couleurs microscopie biphotonique. Une tranche des poumons de souris infectées Lys-EGFP 7 h avant avecA. fumigatus a été préparé et imagé comme décrit dans le protocole. Montré est la structure combinée de champignons et de SHG du tissu alvéolaire (bleu), le signal Sytox de noyaux de cellules et de NET (rouge), ainsi que ainsi que de nombreux neutrophiles (vert). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="Figure 4" /> Figure complémentaires 1. Fixation de la souris pour l&#39;intubation. Sous Kétamine / Rompun l&#39;anesthésie de l&#39;animal est fixé avec une bande élastique à ses dents, afin de faciliter l&#39;intubation avec un cathéter veineux à demeure 22G. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 2 supplémentaires. La ventilation mécanique de la souris. La souris intubé est infecté par une application informatique de 1x10 7 spores en suspension dans 100 ul de PBS. Une meilleure répartition des particules fongiques à l&#39;intérieur du poumon est atteint par la ventilation mécanique de la souris infectée par un respirateur de petits animaux. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 3 supplémentaires. Fixation du lobe pulmonaire. Après la préparation du lobe du poumon droit de l&#39;orgue est fixé dans une boîte de Pétri par l&#39;utilisation d&#39;une rondelle en laboratoire fait plat qui est couvert par un ensemble de fils de nylon parallèle. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 4 supplémentaires. Configuration d&#39;imagerie 2-photons. La boîte de Petri contenant le lobe du poumon droit est installé sur un tapis chauffant sous le microscope 2-photons après addition de l&#39;ADN de teinture Sytox Orange. Films supplémentaires:. Neutrophiles neutrophiles migrateurs et la phagocytose des éléments fongiques dans les poumons infectés Aspergillus tel que vu par laps de temps 2-microscopie biphotonique d&#39;une tranche de vie pulmonaires 7 h après l&#39;infection par le champignon sont verts, les éléments fongiques et SHG sont bleus, et des noyaux de cellules que ainsi que NET-structures sont représentées en rouge. Le temps réel de l&#39;expérience est montré en bas à droite. La barre d&#39;échelle représente 50 um. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1 - supplemental.mpg">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a>

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En temps réel 2-microscopie biphotonique in vivo ou dans les organes intacts a gagné en importance profonde dans les études portant sur la physiologie des cellules immunitaires au cours des 10 dernières années. C&#39;est avec cette technique que des événements importants tels que la dynamique de l&#39;activation des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques Premières Nations devenait visible 2-4. Plus récemment, les chercheurs ont aussi commencé à analyser des fonctions cellulaires, comme les premières étapes de la génération de cellules effectrices dans les tissus lymphatiques en utilisant cette approche 5. Toutefois, bien qu&#39;un certain nombre de nouveaux concepts biologiques ont été révélés en utilisant cette méthode, il ya encore des défis et des questions importantes pour lesquelles aucun des études de visualisation intravitale ont été publiés à ce jour. Notamment cela s&#39;applique au niveau du poumon chez les mammifères. L&#39;aspect intéressant de cet organe, comme le port d&#39;entrée pour une variété de pathogènes aéroportés, en fait l&#39;une des surfaces les plus cruciaux au cours de laquelle les processus immunologiques ont lieu dans le corps des mammifères. Avec chaque respiration au cours de la durée de vie, les particules indésirables sont inhalées dont certains ont le potentiel de provoquer des infections mortelles 6. Il est auto-explicatif que, à un tel site sensible et menacée d&#39;un réseau serré de mécanismes de défense doit être présent présentant l&#39;ensemble du répertoire des réponses immunitaires. D&#39;autre part il est très important que la lutte contre les pathogènes induits immunologiques potentielles à un tel &quot;sale&quot; endroit est étroitement contrôlé. Réactions exagérées du système immunitaire supporter un risque élevé de nuire à son propre corps par les tissus des organes massivement blessant lors de la stimulation des cellules immunitaires non spécifiques actions 7,8. A la lumière de ces réflexions, il serait extrêmement intéressant et utile d&#39;avoir la possibilité d&#39;enquêter comportement des cellules dans les poumons des mammifères en vrai dans des conditions in vivo. Cependant, le fait qu&#39;un tel système n&#39;a jusqu&#39;à présent pas été appliquée avec succès clairement les points sur les difficultés énormes qui doivent être résolus dans la mise en place d&#39;un protocole de travail. Le défi le plus exigeant est sans doute la stabilité de discussion. Le poumon est l&#39;organe responsable de la respiration est sous le mouvement constant dans les trois directions de l&#39;espace pour réaliser l&#39;inhalation. Cette seule circonstance entraîne des problèmes d&#39;imagerie grave et peut être considéré comme un intravitale imageurs &quot;cauchemar&quot;. Déjà un léger mouvement à toute dimension dans l&#39;espace a un effet massif sur la détérioration de vue microscopique, qui doit être stable avec une précision micrométrique, afin de générer des images significatives 9. Compte tenu de son orientation fondamentalement serrés locale 10, 2-microscopie biphotonique est encore plus sensible aux instabilités de contact, comme une dislocation d&#39;une certaine structure de l&#39;ordre de quelques micromètres dans la direction Z est équivalent à une perte complète d&#39;intérêt et donc une expérience ratée. Le protocole présenté dans cette étude pour l&#39;observation des cellules immunitaires dans les poumons de souris n&#39;est toujours pas une application in vivo, mais plutôt un rapprochement étroit avec la situation dans un poumon fonctionnellement intactes 11. Approches ex vivo les lymphocytes imagerie, par exemple dans la lymphe explantés nœuds, il a été démontré à donner des résultats équivalents à true dans 12 observations in vivo et sont donc très pertinents 5. Les observations in situ dans les tranches de poumon, qui ne sont possibles que grâce à notre approche, se déroulent dans un poumon infecté peu de temps après l&#39;excision. L&#39;intégrité 3D pendant le processus de coupe est assurée par la matrice d&#39;agarose, une étape essentielle pour permettre un processus parfaitement contrôlé la coupe du poumon. Bien qu&#39;il soit nécessaire de refroidir les poumons explantés pour une courte période afin de permettre une solidification de la matrice d&#39;agarose, il est possible de revenir à proximité des conditions physiologiques des cellules après la coupe et le réchauffement des tissus. Ceci est clairement démontré par nos données, qui montrent que dans ces conditions neutrophiles sont très actifs et présentent leur plein potentiel comme phagocytes agiles, qui sont nécessaires pour l&#39;apurement effectif de une infection à Aspergillus fumigatus. Ils patrouillent dans les tissus pulmonaires en passant par les barrières épithéliales en vue d&#39;atteindre les parties intérieures des alvéoles et en outre, ils participent activement jusqu&#39;à 11 spores fongiques. Une des principales conclusions de ce travail a été l&#39;apparition de structures ressemblant à des neutrophiles pièges extracellulaires (EVF) dans les Aspergillus organe infecté. NET sont une conclusion très récente d&#39;un mécanisme de défense roman dans les neutrophiles 13. Toutefois, depuis sa première description en 2004, le nombre de conditions physiologiques ou pathologiques dans des modèles animaux ou les humains, où ce phénomène a été observé ou fait défaut a été explosive croissante 14-16. Fait intéressant, bien que le travail tant de choses ont été consacrés à ces structures par tant de groupes différents, la plupart des rapports sont encore à un niveau très descriptive et n&#39;est pas beaucoupsur le mécanisme de libération NET et sa régulation. Avec notre protocole, nous avons pu pour la première fois de montrer fibres NET dans un poumon infecté. Par ailleurs, nous avons pu démontrer l&#39;importance de neutrophiles fraîchement recrutés ainsi que les structures moléculaires des champignons pour leur survenance ou l&#39;inhibition 11. Cela montre clairement le potentiel de notre méthode pour étudier les étapes simples de la formation des NET en détail. On pourrait penser par exemple d&#39;utiliser les neutrophiles de souris knock-out adaptée pour observer leur capacité de formation des NET dans des expériences de transfert adoptif. Ainsi, bien que l&#39;observation directe de l&#39;immigration des neutrophiles du sang périphérique n&#39;est pas possible avec ce système à cause du manque d&#39;approvisionnement en sang après explantation d&#39;organe, nous croyons toujours que notre protocole est une approche précieuse et relativement facile à manipuler qui permet l&#39;imagerie de étapes tôt ou tard dans la défense immunitaire contre les infections pulmonaires. C&#39;est donc une étape importante vers enquête ce phénomène dans les poumons de respiration des animaux vivants.

direct observation of phagocytosis and net-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy

Après le tractus gastro-intestinal, du poumon est la surface la deuxième plus grande pour l&#39;interaction entre le corps des vertébrés et de l&#39;environnement. Ici, un échange gazeux efficace doit être maintenue, tout en évitant en même temps l&#39;infection par les pathogènes multiples qui sont inhalés lors de la respiration normale. Pour y parvenir, un superbe ensemble de stratégies de défense alliant humorale et cellulaire des mécanismes immunitaires existe. Une des mesures les plus efficaces pour la défense aigu du poumon est le recrutement des neutrophiles, qui soit phagocyter les pathogènes inhalés ou les tuer en libérant des produits chimiques cytotoxiques. Un ajout récent à l&#39;arsenal des neutrophiles est leur libération explosive de l&#39;ADN extracellulaire-NET par lequel les bactéries ou les champignons peuvent être capturés ou inactivés, même après que les cellules libérant NET sont morts. Nous présentons ici une méthode qui permet d&#39;observer directement les neutrophiles, migrent à l&#39;intérieur d&#39;un poumon infecté récemment, la phagocytose des pathogènes fongiques ainsi que de visualiser le NET vaste qu&#39;ils ont produit dans le tissu infecté. La méthode décrit la préparation des tranches épaisses de poumon viables 7 heures après l&#39;infection intra-trachéale de souris avec des conidies de la moisissure Aspergillus fumigatus et leur examen par multicolores time-lapse 2-microscopie biphotonique. Cette approche permet d&#39;enquêter directement sur la défense antifongique dans les tissus pulmonaires natives et ouvre ainsi une nouvelle voie pour l&#39;investigation détaillée de l&#39;immunité pulmonaire.

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Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Nous montrons, comment utiliser les deux photons de microscopie pour l&#39;observation de la dynamique des granulocytes neutrophiles dans les poumons infectés alors qu&#39;ils phagocyter des pathogènes ou de produire des neutrophiles pièges extracellulaires (NET).

Observation directe de la phagocytose et NET-formation par les neutrophiles dans les poumons infectés en utilisant deux microscopie biphotonique

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.6K vues.  Otto-von-Guericke University Magdeburg. Nous montrons, comment utiliser les deux photons de microscopie pour l'observation de la dynamique des granulocytes neutrophiles dans les poumons infectés alors qu'ils phagocyter des pathogènes ou de produire des neutrophiles pièges extracellulaires (NET).

Vidéo: Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Micro-ondes assistée diagnostic rapide des maladies virales des plantes par microscopie électronique à transmission

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Recherche

Immunologie et infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagerie intravitale du Thymus souris utilisant la 2-microscopie biphotonique

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Video Microscopy cellules vivantes de la phagocytose des pathogènes fongiques

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

L&#39;étude des interactions de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Avec des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie Time Lapse

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

High Throughput Mesure de l&#39;ADN extracellulaire de sortie et quantitative Formation NET dans les neutrophiles humains<em&gt; In vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-lapse imagerie 3D de phagocytose par les Macrophages de souris

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Mesure de la phagocytose d'Aspergillus fumigatus Conidia par des leucocytes humains à l'aide de la cytométrie du flux

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

Quantification en temps réel des espèces réactives d’oxygène dans les neutrophiles infectés par escherichia coli méningitique

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.