Ce travail est soutenu par des subventions de NCI 1R01CA154656, le NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, Fondation Saint-Baldrick, Dana Foundation, Gabrielle Angel Foundation, et Hyundai Motors of America &quot;Hope-sur-roues» du programme.

1. Assemblée porte-souris <ol><li> Superposez le couvercle d&#39;un plat en verre de 100 mm sur le dessus de Petri de 100 mm couvercle de boîte de Petri en plastique vers le bas. Le verre doit être touchant à peine le point de centre de l&#39;assiette en plastique. Utilisation de la vitre comme un pochoir, tracer une marque sur le plat en plastique. </li><li> Utilisation d&#39;une perceuse à main (c.-à-dermiques) pour enlever une partie d&#39;un couvercle plat de 100 mm plastique pour créer une plate-forme en forme de croissant. Ce couvercle en plastique en forme de croissant se servir de support pour la partie supérieure du torse de la souris (figure 1a). Percez deux trous sur le couvercle en forme de croissant pour assurer le masque à gaz avec une attache en métal. Fixez le couvercle en plastique sur le bord du plat en verre de Petri en utilisant la super glue ou un adhésif de manière équivalente forte (figure 1b). </li><li> Coller les couvercles en forme de dôme de deux tubes PCR bouchon (coupés à la charnière) 1 cm de distance au centre de la cuvette inférieure dans le but de rabats d&#39;ancrage de la peau poplités. </li></ol> 2. Préparation de la souris <strong&gt; Remarque: Avec une expérience pratique suffisante, il faut être en mesure d&#39;effectuer la préparation de la souris et les étapes chirurgicales en 20-30 minutes. <ol><li> Anesthésier la souris avec l&#39;isoflurane (2 à 2,5% pour l&#39;induction, de 1,5 à 2% pour la chirurgie / imagerie) mélangé à l&#39;échelle 1:1 O 2: mélange l&#39;air à un débit de 1l/min en utilisant une procédure IACUC approuvé. Une fois que la souris est anesthésiée, sécuriser un masque à gaz sur le nez avec du ruban adhésif. Déterminer si la souris est entièrement anesthésié par l&#39;absence de réponse aux pieds et / ou pincées queue. Le niveau de l&#39;isoflurane peut être ajustée en conséquence pour s&#39;assurer que l&#39;animal est complètement sous sédation, avec une constante, non-travaillé fréquence respiratoire entre 60-80 respirations par minute. </li><li> Utilisez une tondeuse électrique pour enlever les poils sur la patte arrière droite et la région inguinale de la souris. </li><li> Toute trace de cheveux dénoués et en douceur, appliquer une couche modeste de la lotion sur la zone Nair rasée avec un coton-tige. Après une minute de la demande initiale, retirez le Nair et nettoyer la peau exposée avec un chiffon humideserviette en papier. Assurez-vous que la souris est propre et sèche avant de continuer. </li><li> Faire une petite incision de 2 à 3 mm avec des ciseaux au niveau du genou droit d&#39;exposer le tendon extenseur. </li><li> Appliquer Vetbond le long du centre du support de souris, où le corps de la souris et la jambe sera positionné. Fixez soigneusement la souris sur le support, avec le genou droit vers le bas, afin d&#39;exposer la fosse poplitée droite. Fixez le tendon du genou droit avec Vetbond entre les 2 supports lambeau de peau pour aider à stabiliser le champ d&#39;imagerie. </li><li> Stretch et ruban adhésif sur les bras et la jambe gauche à la plate-forme supérieure de la porte. </li><li> Utilisez une attache pour fixer le masque à gaz en place. </li><li> Placez le support sous le microscope à dissection. La LN doit rester absolument immobile, indépendante du mouvement respiratoire de la souris. Par conséquent, des précautions doivent être prises pendant la chirurgie afin d&#39;optimiser la stabilité de la jambe. Déterminer la position de la queue (typiquement au-dessus de la tête) qui contribuera à la plus grandela stabilité à la jambe droite et la bande de la queue vers le bas. </li></ol> 3. Chirurgie <ol><li> Alors que dans le cadre du champ d&#39;application de dissection, de maintenir la température du corps de la souris en utilisant un appareil de chauffage ou un coussin chauffant. Pour l&#39;imagerie réussie de la LN poplitée, il est essentiel de maintenir la température du corps adéquate tout au long de la chirurgie ainsi que pour préserver l&#39;humidité du tissu par l&#39;application constante chaude PBS pour les tissus exposés. </li><li> Stériliser la peau avec de la Bétadine. L&#39;aide de ciseaux stériles, faire une incision médiane à travers la peau à droite à mi-mollet, et continuez à couper verticalement vers le haut à la partie supérieure de la cuisse droite. </li><li> Faire deux incisions cutanées horizontales en haut de la ligne d&#39;incision verticale pour créer lambeaux cutanés de chaque côté. </li><li> Rentrer et collez-le deux lambeaux cutanés avec Vetbond. Tirer la peau tendue avant d&#39;appliquer Vetbond permettra de promouvoir davantage la stabilité jambe, mais assurez-vous que la tension de la peau n&#39;a pas obstruer la circulation sanguine (à savoir les changements de la vesseL Couleur ou diamètre). Continuer à coller par d&#39;autres secteurs de la peau pour assurer la stabilité de la jambe avant d&#39;exposer la LN. La taille de la souris permettra de déterminer combien la peau supplémentaire est nécessaire pour la colle vers le bas. En règle générale, les grandes souris, il faudra plus de peau à être collé à la porte. </li><li> La LN doit se situer dans la fosse poplitée, soit à droite ou à gauche de la veine poplitée, en fonction de la mise en place de la souris sur le support. Soigneusement séparer la LN à partir de tissus adipeux et les muscles qui entourent l&#39;aide de micro-dissection des pincettes et des pinces. Afin de minimiser les saignements et les traumatismes, utiliser les techniques écarteurs avec des micro-dissection pince à épiler pour les tissus distincts. Dégager prudemment la LN poplitée sans compromettre l&#39;intégrité des vaisseaux sanguins afférents et efférents et les vaisseaux lymphatiques afférents. </li><li> Pour la stabilité des tissus ajouté, un couvercle en verre carré peut être positionné au-dessus de la LN humide, à peine de toucher la LN, tout en évitant occlusion du vaisseau. Le couvercle en verre peut être sécured avec la pâte à modeler de chaque côté de la souris. </li><li> Colorants fluorescents de navires de différentes tailles (par exemple TRITC-dextran, minimum de 70 kDa) peuvent être introduits par voie intraveineuse à ce point pour aider à mettre en évidence la relation structurelle et l&#39;intégrité du LN lors de l&#39;imagerie. </li></ol> 4. 2-Photon Imaging Acquisition ** <ol><li> Une fois que la LN est suffisamment exposée et la stabilité est obtenue, transférer rapidement l&#39;ensemble de la souris tout support sur la platine du microscope muni d&#39;un tampon de température retour chauffage programmable contrôlé dans une chambre de l&#39;environnement microscope maintenue à 37 ° C. Ajouter assez stérile chaude (37 ° C) ou PBS HBSS à submerger la LN. Le volume change en fonction de la taille et l&#39;emplacement de la souris. Alternativement, chaleureux PBS ou HBSS peut être appliqué directement sur la LN disséquée à travers une pipette en verre bien adapté à une pompe péristaltique et scotchée à la colonne de l&#39;objectif objectif à immersion. Le débit du liquide doit être telle que lecolonne d&#39;eau stable peut être maintenu entre la lentille et le tissu. </li><li> Maintenir la température de PBS ou HBSS à 37 ° C à l&#39;aide d&#39;un coussin chauffant avec une sonde de rétroaction. Une sonde de température distincte doit être placé dans le support de la souris pour confirmer la température de la PBS dans la plage de 36,5 à 37,5 ° C Une sonde rectale peut également être utilisé pour surveiller la température centrale du corps de la souris expérimentale long de la session d&#39;imagerie. </li><li> Utilisez une lampe fluorescente epi-pour aider le placement LN guide sous l&#39;objectif. Acquérir piles d&#39;images fluorescentes à l&#39;aide des intervalles de temps qui sont appropriés pour l&#39;interaction cellulaire désiré (généralement de 10 secondes à 1 minute entre chaque pile d&#39;images xyz). </li><li> Surveiller l&#39;état de l&#39;animal dans la chambre du microscope souvent par inspection visuelle ou en utilisant un système de surveillance des animaux. Déterminer si la souris est entièrement anesthésié par l&#39;absence de réponse aux pieds et / ou pincées ongles, et une constante, non-travaillé le rythme respiratoire de 60-80 breaths par minute. Le niveau de l&#39;isoflurane peut être ajustée en conséquence pour s&#39;assurer que l&#39;animal est complètement sous sédation. Avec un suivi adéquat et une hydratation, les animaux peuvent être visualisés pendant 4-6 heures, ou peut-être plus. </li><li> Après l&#39;expérience d&#39;imagerie, euthanasier l&#39;animal dans un chambre de CO 2 en utilisant le protocole approuvé par l&#39;euthanasie IACUC. L&#39;animal ne doit pas être autorisé à sortir de l&#39;anesthésie avant l&#39;euthanasie. </li></ol> ** Cette procédure chirurgicale peut aussi être utile pour d&#39;autres formes d&#39;imagerie intravitale autre que 2P-LSM. 5. Les résultats représentatifs Diverses cellules immunitaires circulantes sont recrutés à la LN à des taux différents suivant le transfert adoptif. Pour CD4 + et CD8 + lymphocytes, ces cellules commencent à arriver dans la LN dans les hautes endothéliales veinules (HEV) minutes après le transfert iv avec un nombre substantiel qui arrivent dans la LN poplitée après 2 à 4 heures 6,17-18. Pour cel Bls, un nombre important s&#39;accumulent au bout de 8 à 24 heures 19. PED activés devraient commencer à apparaître dans les drainant poplités LN 8 à 16 heures après l&#39;injection du coussinet plantaire 3,11,16-17. La figure 2a montre que, même sans autres repères, des structures telles que les follicules de cellules B peuvent être discernées facilement par l&#39;accumulation de cellules sphériques ronde visible sous 2P-LSM 19. L&#39;utilisation d&#39;un journaliste endogène fluorescent tel que les splénocytes ubiquitine-GFP (figure 2, Vidéos supplémentaires 1 et 2), on peut suivre ces migrations lymphocytes et les comportements pour les jours jusqu&#39;à une semaine dans des conditions non-stimulation des conditions physiologiques. Avec des détecteurs multicanaux à haute sensibilité, il est possible d&#39;acquérir un ensemble de données d&#39;imagerie multiplex qui englobe l&#39;information structurelle ainsi que la dynamique d&#39;interaction entre les multiples partenaires cellulaires 17,19. Lorsque les techniques chirurgicales sont correctement exécutées et les conditions environnementales soigneusement contrôlée, lymtes doit présenter la vitesse de migration caractéristique, comme le montre la figure 2c, 2d et ailleurs 13-14,16. Les lymphocytes peuvent également présenter des différences dans la vitesse de migration en fonction des sous-régions de l&#39;imagerie LN objet, points de repère afin supplémentaires telles que les vaisseaux sanguins (comme l&#39;a souligné par l&#39;introduction de colorants navires) vous aidera à déterminer la qualité d&#39;image globale (à savoir le contrôle de température appropriée , un traumatisme minime à LN, etc) 3,6,20. <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> Figure 1. Construction d&#39;un titulaire de la souris pour souris poplitée Imaging LN a) Schéma de montage porte-souris;. B) la préparation de la souris Représentant intravitale; c) Assemblée Terminé porte-souris; d) gros plans de la LN poplitée après l&#39;exposition chirurgicale. <img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> Figure 2. L&#39;analyse des migrations de GFP + lymphocytesdans la LN poplitée. (a) aperçu 3D prises de la séquence d&#39;imagerie 2P-LSM de l&#39;LN poplitée dans une souris receveuse C57BL / 6 adoptive transféré avec 1x10 7 lymphocytes + 1 jour avant la GFP à l&#39;imagerie. Ligne Dash désigne la frontière des follicules de cellules B; (b) Titres de la migration des lymphocytes au cours de 1 heure de l&#39;imagerie en continu; c) Distribution de la vitesse de migration globale des lymphocytes. Vitesse moyenne = 10,04 ± 4,26 um / min (total de 15,125 pistes analysées), d) Différentiel distribution cellulaire vitesse de migration des cellules présentes dans le follicule des cellules B (open bars; la vitesse moyenne = 8,79 ± 3,90 um / min; total 1.525 pistes analysées ) et des lymphocytes T zone (barres fermées; la vitesse moyenne = 13,77 ± 5,93 um / min; total de 1.250 titres analysés). Échelle = 50 microns. Vidéo supplémentaire 1. Time-lapse intravitale 2P-LSM imagerie d&#39;un LN souris poplitée comme décrit dans la figure 2. Un total de 1x10 7 lymphocytes ont été isolés enom une souris ubiquitine-GFP + et des bailleurs de fonds transférés par voie intraveineuse adoptive dans une souris receveuse C57BL / 6 24 heures avant l&#39;imagerie. Une série de xy (750 mm x 750 um) des images en fluorescence ont été prises par le biais fixe z piles (5 étapes um, 13 étapes) pour obtenir une pile XYZ Imaging (750 mm x 750 mm x 65 um), qui a été répétée toutes les 20 secondes pour un total de 60 minutes, ce qui entraîne une séquence d&#39;imagerie pour l&#39;analyse xyzt vitesse (figures 2c, 2d). La vitesse de lecture = 450x. Échelle = 50 microns. Horodatage = min: sec. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">Cliquez ici pour visionner la vidéo supplémentaire</a> . Vidéo supplémentaire 2 zoom-en vue de la séquence d&#39;imagerie en vidéo supplémentaire 1 au niveau du follicule des cellules B -. Frontière T zone de cellule. La vitesse de lecture = 450x. Échelle = 25 um. Horodatage = min: sec. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>lécher ici pour visionner la vidéo supplémentaire.

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Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Les progrès récents en haute résolution dans les techniques d&#39;imagerie in situ, en particulier 2P-LSM, ont été accompagnées par un intérêt croissant pour l&#39;étude du comportement dynamique cellulaire in vivo. La technique d&#39;imagerie 4D sur le LN poplitée d&#39;une souris direct permet de telles analyses dans le comportement dynamique des cellules immunitaires dans le tissu sans perturbation micro-environnement. L&#39;utilisation de 2P-LSM avec des détecteurs multiples s&#39;étendant tout le spectre visible permet simultanée de collecte de données d&#39;imagerie de populations de cellules multiples. Cela peut maintenant être atteint grâce à l&#39;utilisation des cellules in vivo spécifiques souris rapporteurs fluorescents (par exemple l&#39;ubiquitine-eGFP,-DP, ou-ECFP) combiné avec l&#39;utilisation du transfert adoptif de populations de cellules marquées de façon différentielle en utilisant des cellules fluorescentes colorants organiques (p. ex CFSE , Snarf-1, et Cell Tracker Orange) d&#39;examiner les mécanismes cellulaires et de la fonction au sein de la LN. En plus de l&#39;observation directe des interactions entre différentielle suivi cpopulations aune, le jeu de données d&#39;imagerie multiplexe peut subir une analyse plus approfondie avec les programmes d&#39;imagerie disponibles dans le commerce de logiciels de traitement (par exemple Imaris, Bitplane Inc) pour élucider le comportement des cellules et la fonction. Un large éventail de possibilités existe pour étudier les mécanismes d&#39;interaction cellulaire en utilisant ces in vivo et in silico techniques. La principale limitation de l&#39;approche expérimentale décrite ici est la complexité technique inhérente à l&#39;approche chirurgicale. Cette technique nécessite une formation rigoureuse de se familiariser avec l&#39;anatomie pertinente et les procédures précises et des compétences techniques requises par le présent protocole. Facteurs compliquant encore, la difficulté à minimiser les dommages des tissus lors de l&#39;exploration LN, l&#39;optimisation de la stabilité des tissus lors de l&#39;imagerie, et la prévention des blessures thermique et laser à la LN avant et pendant l&#39;expérimentation d&#39;imagerie. Perturbation de l&#39;un de ces facteurs se traduira par moins-que-optimale lymphatiquemotilité ocyte et donc d&#39;interférer avec une interprétation correcte des données d&#39;imagerie résultant des analyses.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Réactif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Société</strong</td&gt;<td<strongNuméro de catalogue&gt;</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L&#39;isoflurane, USP</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corporation</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nair - lotion démaquillante cheveux</td&gt;<td&gt; Nair</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS 1X,</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21-040-CV</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdLe coussin chauffant&gt;</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Chauffage Manette</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Air et O<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgas</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdSonde de température&gt;</td&gt;<td&gt; Harvard Apparatus</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pince à épiler Dumont # 5</td&gt;<td&gt; Monde Precision Instruments, Inc</td&gt;<td&gt; 14101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pince, Graefe Iris, 7 cm incurvée</td&gt;<td&gt; Monde Precision Instruments, Inc</td&gt;<td&gt; 14141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ciseaux</td&gt;<td&gt; Roboz chirurgical Instrument Co., Inc</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Couverture de plat en verre 100x20 mm de culture cellulaire</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Couverture de plat en polystyrène mm 100x20 culture cellulaire</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 430167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdSolution Betadine&gt; (10% povidine-iode solution topique)</td&gt;<td&gt; Produits de Purdue, LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

intravital imaging of the mouse popliteal lymph node

Les ganglions lymphatiques (LNS) sont les organes lymphoïdes secondaires, qui sont stratégiquement situés à travers le corps pour permettre le piégeage et la présentation des antigènes étrangers à partir de tissus périphériques pour amorcer la réponse immunitaire adaptative. Juxtaposé entre innées et adaptatives des réponses immunitaires, la LN est un site idéal pour étudier les interactions cellules immunitaires 1,2. Lymphocytes (cellules T, cellules B et cellules NK), cellules dendritiques) et les macrophages constituent l&#39;essentiel de la moelle osseuse provenant d&#39;éléments cellulaires de la LN. Ces cellules sont stratégiquement positionnés dans le LN pour permettre une surveillance efficace des antigènes du soi et le potentiel des antigènes étrangers 3-5. Le processus par lequel les lymphocytes succès rencontrent des antigènes apparentés est un sujet d&#39;intenses recherches ces dernières années, et implique une intégration des contacts moléculaires, y compris des récepteurs d&#39;antigènes, des molécules d&#39;adhésion, les chimiokines, et les structures du stroma comme le réseau fibro-réticulaire 2,6-12 . </p&gt; Avant le développement de la haute résolution en temps réel fluorescente imagerie in vivo, les enquêteurs comptaient sur l&#39;imagerie statique, ce qui ne propose que des réponses concernant la morphologie, la position et l&#39;architecture. Bien que ces questions sont fondamentales dans notre compréhension du comportement des cellules du système immunitaire, les limites intrinsèques de cette technique ne permet pas l&#39;analyse de déchiffrer le trafic des lymphocytes et des indices environnementaux qui influent sur le comportement dynamique des cellules. Récemment, le développement de intravitale à deux photons microscopie à balayage laser (2P-LSM) a permis aux enquêteurs de voir les mouvements dynamiques et les interactions des cellules individuelles dans les ganglions vivantes en 12-16 in situ. En particulier, nous et d&#39;autres ont appliqué cette technique à un comportement d&#39;image cellulaire et interactions au sein de la poplitée LN, où sa compacte, la nature dense offre l&#39;avantage de multiplex d&#39;acquisition de données sur une zone de tissu avec des tissus divers grande sous-structures 11,17-18 . Il is important de noter que cette technique offre des avantages supplémentaires sur les techniques d&#39;imagerie des tissus explantés, qui exigent la perturbation du sang, circulation de la lymphe, et, finalement, la dynamique cellulaires du système. En outre, les tissus explantés ont une fenêtre de temps très limitée dans laquelle le tissu reste viable pour l&#39;imagerie après explantation. Avec une bonne hydratation et la surveillance des conditions environnementales de l&#39;animal, l&#39;imagerie en temps peut être considérablement étendu avec cette technique intravitale. Ici, nous présentons une méthode détaillée de la préparation de la souris poplitée LN dans le but d&#39;effectuer l&#39;imagerie intravitale.

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Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Les progrès récents dans la microscopie 2-photons ont permis en temps réel<em&gt; Dans</em&gt; Imagerie in situ des tissus vivants dans des modèles animaux, améliorant ainsi notre capacité à enquêter sur le comportement cellulaire dans des conditions à la fois physiologiques et pathologiques. Ici, nous décrivons les préparatifs nécessaires pour effectuer l&#39;imagerie intravitale du ganglion lymphatique poplité souris.

Imagerie intravitale du ganglion lymphatique poplité souris

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.1K vues.  Case Western Reserve University. Les progrès récents dans la microscopie 2-photons ont permis en temps réel Dans Imagerie in situ des tissus vivants dans des modèles animaux, améliorant ainsi notre capacité à enquêter sur le comportement cellulaire dans des conditions à la fois physiologiques et pathologiques. Ici, nous décrivons les préparatifs nécessaires pour effectuer l'imagerie intravitale du ganglion lymphatique poplité souris.

Vidéo: Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Recherche

Immunologie et infection

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo l&#39;imagerie de cellules T dans murin tranches avec des ganglions lymphatiques et la microscopie confocale Widefield

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine chirurgie superficielle des ganglions lymphatiques

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagerie intravitale du Thymus souris utilisant la 2-microscopie biphotonique

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolement de cellules murines ganglions lymphatiques stromales

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Microscopie intravitale imagerie du foie suivante<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Une évaluation de l&#39;hémodynamique hépatiques

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Myéloïde cellule d&#39;isolement de la peau de souris et Vidange ganglion Après intradermique immunisation avec Live Atténuée<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoïtes

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Two-photon Imaging intravitale des leucocytes au cours de la réponse immunitaire dans le foie de souris traitées Lipopolysaccharide

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...