Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health subvention (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) à MM. Notre article est en partie soutenue par Carl Zeiss LLC micro-imagerie.

Espèces réactives de l&#39;oxygène peut être mesurée dans des cellules vivantes en utilisant des colorants d&#39;oxydation sensibles (1 &amp; 2) ou en utilisant des capteurs plasmide (3 &amp; 4) par microscopie confocale. 1. Visualisation des cytosolique ROS dans les cellules J774 <ol><li> Cultivez J774.1 souris dérivées de monocytes macrophages (10 6 cellules / ml) sur fond de verre de 35 mm plats (Harvard Apparatus) pendant 48 h. </li><li> Cellules avec des agonistes TLR Défi (2 pg / ml, Lipo-acides téchoïques TLR2 agoniste; 10μg/ml, le poly (I: C)-agoniste TLR3; 1 pg / ml de LPS-TLR4 agoniste) pendant 6 h à 37 ° C. Remarque: Les macrophages traités dans des conditions similaires ont été utilisés pour la co-culture modèle mobilisation du Ca2 +. </li><li> Ajouter le colorant sensible à l&#39;oxydation de H 2 DCF-DA (Invitrogen) pour donner une concentration finale de 10 uM dans l&#39;ECM (milieu extracellulaire: 121 mM de NaCl, 5 mM NaHCO 3, 10 mM de Na-HEPES, 4,7 mM de KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 2 mM de CaCl2, 10mM de glucose et 2,0% de dextrane à pH 7,4, tous obtenus auprès de Sigma) contenant de la BSA 2% à la vaisselle et les cellules incuber pendant 20 min avant la visualisation en microscopie confocale. </li><li> Après le chargement de teinture, de visualiser les cellules placées sur une scène à température contrôlée d&#39;un système d&#39;imagerie appropriée. Nous utilisons Carl Zeiss LSM 510 META système d&#39;imagerie confocale couplée à laser à ions argon source à une excitation de 488 nm pour DCF fluorescence à l&#39;aide d&#39;huile objectif 40x 13 (fig. 1A et D). </li><li> Analyser des images en utilisant le logiciel ImageJ (1,44), un logiciel disponible gratuitement sur ​​le National Institutes of Health (Rasband, WS, ImageJ, américain National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Etats-Unis, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij /</a> , 1997-2009). </li></ol> 2. Visualisation du MROS en cellules J774 <ol><li> Cultivez J774.1 souris dérivées de monocytes macrophages (10 6 cellules / ml) sur fond de verre de 35 mm plats (Harvard Apparatus) pendant 48 h. </li><li>Défi des cellules avec des ligands de TLR pour induire la production MROS (2 pg / ml, Lipo-acides téchoïques TLR2; 10μg/ml, le poly (I: C)-TLR3; 1 pg / ml de LPS-TLR4) pendant 6 h à 37 ° C. </li><li> Ajouter mitochondriale superoxyde indicateur MitoSOX Rouge (Invitrogen) pour donner une concentration finale de 5 uM de l&#39;ECM contenant de la BSA 2% à la vaisselle et les cellules incuber pendant 30 min à 37 ° C pour permettre le chargement des MitoSOX Rouge. </li><li> Après le chargement de teinture, de visualiser les cellules sur une scène à température contrôlée d&#39;un objectif Carl Zeiss LSM 510 Meta quelques confocale système d&#39;imagerie laser à ions argon avec source à une excitation de 561 nm pour MitoSOX Rouge fluorescence à l&#39;aide d&#39;huile objectif 40x (Fig 1B et E). </li><li> Pour les expériences de contrôle, après colorant de chargement Ajouter PBS ou du DMSO (témoin négatif) ou 2 pm antimycine A. (Comme la superoxyde mitochondriale générateur contrôle positif) pour les cellules avant l&#39;image de l&#39;échantillon tel que décrit au paragraphe 2.4 (figure 1C) </li><li> Analyser les images à l&#39;aide du logiciel ImageJ (1,44). </li></ol> 3. Visualizatisur des ROS dans cytosolique stables Hyper-cyto MPMVECs <ol><li> Nous utilisons Phyper-cyto (Evrogen) un codage vectoriel d&#39;expression mammifère une sonde fluorescente Hyper qui localise dans le cytoplasme et spécifiquement la concentration sens submicromolaires de H 2 O 2 14. </li><li> Transfecter murin pulmonaire cellules endothéliales microvasculaires (MPMVECs) avec Phyper-cyto vecteur en utilisant soit l&#39;électroporation ou réactifs de transfection. Nous utilisons 10 x 10 6 cellules et transfection avec 10 pg d&#39;Phyper-cyto par électroporation en utilisant BioRad Gene pulser électroporateur système (250V, 500 uF). MPMVECs culture dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS, acides aminés non essentiels, le supplément de croissance endothéliale et les antibiotiques. Remarque: Après la transfection, les cellules plaque à faible densité afin de faciliter la croissance de colonies. </li><li> Remplacer moyenne avec un milieu de culture complet supplémenté avec 500 pg / ml de G418, 48 heures après transfection. Ecran de clones qui ont plus fort pourcentage de H<html> cellules yper positifs et le passage Hyper clones positifs pour augmenter le nombre de cellules positives Hyper (Fig. 2). Note: Nous utilisons une dilution en série de cellules de la sélection clonale de cellules individuelles et à l&#39;écran pour les cellules stables exprimant fortement hyper. </li><li> Cultivez stables Hyper-cyto MPMVECs sur 0,2% de gélatine lamelles couché (80% de confluence). Suivant les cellules défi jours avec des ligands de TLR (2 pg / ml, acide TLR2 lipotéichoïque; 10μg/ml, le poly (I: C)-TLR3; 1 pg / ml de LPS-TLR4) pendant 6 h à 37 ° C. Cellules non traitées servent de contrôle. </li><li> Après le traitement, monter les lamelles sur des cellules Attofluor chambre (Invitrogen). Ajouter 1 ml de solution de pré réchauffé saline équilibrée de Hanks (HBSS) à la chambre et le lieu de la chambre sur une scène à température contrôlée de Carl Zeiss LSM 510 Meta système d&#39;imagerie confocale. Visualisez et changer l&#39;image de fluorescence à une excitation de 488 nm en utilisant l&#39;objectif 40x du pétrole (figure 3A et D). </li><li> Analyser des images en utilisant le logiciel ImageJ (1,44) (voir section 6). </li></ol>itre &quot;&gt; 4. Visualisation de l&#39;ADN mitochondrial dans le ROS stables Hyper-dMito MPMVECs <ol><li> Nous utilisons Phyper-dMito (Evrogen) un vecteur d&#39;expression codant pour les mitochondries des mammifères ciblée Hyper qui localise dans la concentration des mitochondries et spécifiquement sens submicromolaires de H 2 O 2. </li><li> MPMVECs Transfecter avec Phyper-dMito et générer stables Hyper-dMito MPMVECs étapes suivantes décrites dans la section 3.2 à 3.3. </li><li> Cultivez stables Hyper-dMito MPMVECs sur 0,2% de gélatine lamelles couché (80% de confluence). </li><li> Suivant les cellules défi jours avec des ligands de TLR (2 pg / ml, acide TLR2 lipotéichoïque; 10μg/ml, le poly (I: C)-TLR3; 1 pg / ml de LPS-TLR4) pendant 6 h à 37 ° C. Cellules non traitées servent de contrôle négatif. Ajouter antimycine 2 pm Un échantillon (superoxyde mitochondrial inducteur positif de contrôle) avant de visualiser. </li><li> Après le traitement, monter les lamelles sur des cellules Attofluor chambre (Invitrogen). Ajouter 1 ml de solution de pré-chauffé saline équilibrée de Hanks (HBSS) à la chambreet le lieu de la chambre sur une scène à température contrôlée de Carl Zeiss LSM 510 META système d&#39;imagerie confocale. Visualiser et modifier l&#39;image de fluorescence à une excitation de 488 nm en utilisant l&#39;objectif 40x huile (Fig. 3B, C et E). </li><li> Analyser des images en utilisant le logiciel ImageJ (1,44) (voir section 6). </li></ol> 5. Co-culture de modèle pour la visualisation des paracrine dérivés ROS déclenché Ca 2 + de signalisation dans les cellules endothéliales Pour la visualisation et la mesure de [Ca 2 +] i les changements que nous utilisons une Ca 2 + sensibles colorant fluorescent fluo-quatre heures (Invitrogen). <ol><li> Cultivez MPMVECs sur 0,2% de gélatine revêtement des lamelles de verre de 25mm (80% de confluence). </li><li> Incuber les cellules cultivées sur des lamelles à température ambiante pendant 30 min dans l&#39;ECM contenant de la BSA 2% et 0,003% d&#39;acide pluronique avec 5 uM fluo-4 AM (Invitrogen) concentration finale pour permettre le chargement de la fluo-4 AM. Après le chargement, se laver les cellules avec une solution d&#39;imagerie expérimental (ECM contenant 0.25% BSA) contenant sulfinpyrazone pour minimiser la perte de teinture. </li><li> Après le chargement fluo-4, monter sur des lamelles Attofluor cellules de chambre (Invitrogen). Ajouter 800μl de la solution d&#39;imagerie pré réchauffé expérimentale de la chambre et le placer sur une scène à température contrôlée de Carl Zeiss LSM 510 META système d&#39;imagerie confocale. </li><li> Dans une étiquette du tube de séparer les macrophages non activé ou activé isolés soit de type sauvage ou de gp91 phox-/ - souris (traitées avec du LPS pendant 6 heures) avec cellule Tracker CMTPX rouge (500ng/ml) (Invitrogen) en ECM contenant 2% de BSA et l&#39;acide pluronique 0,003%. Laver et remettre les cellules avec 200 pl de solution d&#39;imagerie expérimental. </li><li> Ajouter les macrophages étiquetés à fluo-quatre heures chargées MPMVECs dans l&#39;assemblage de chambre. </li><li> Enregistrer la fluorescence verte et rouge toutes les 3s pendant 10-20 min à l&#39;aide de Carl Zeiss LSM510 Meta système d&#39;imagerie confocale avec une source laser Argon ions avec une excitation à 488 et 561 nm pour fluo-4 AM et cellulaire Tracker fluorescence rouge respectively (Fig.4 AC). Note: Alternativement, J774.1 lignée cellulaire pourrait être utilisée pour provoquer MPMVECs Ca 2 + de mobilisation. </li><li> Analyser fluo-4 changements d&#39;intensité de fluorescence à l&#39;aide du logiciel ImageJ (1,44) (voir section 6). </li></ol> 6. L&#39;analyse des données à l&#39;aide du logiciel ImageJ Transférez les images obtenues par le système confocal comme un fichier de format. Lsm pour l&#39;analyse des données. ZEN 2009 et ZEN 2010 logiciels fournis avec le microscope LSM 510 META confocale ou LSM 710 microscope confocal multiphotonique sauve respectivement les fichiers au format LSM.. Nous vous recommandons d&#39;utiliser ce natif. Lsm pour l&#39;analyse d&#39;image que la qualité d&#39;origine est conservé. Ce format de fichier peut être directement ouvert à l&#39;image de l&#39;image programme d&#39;analyse de J. Les étapes suivantes fournissent un exemple d&#39;analyse quantitative de l&#39;image unique. Pas de plug-ins supplémentaires sont nécessaires pour cette analyse de données. <ol><li> Ouvrir. Lsm ou. Fichier TIFF dans le programme Image J en utilisant Fichier&gt; Ouvrir </li><li> Cliquez sur l&#39;onglet Image&gt; COCANAUX LOR&gt; Split et diviser les canaux vert et DIC. Utiliser l&#39;image de la voie verte pour une analyse ultérieure. </li><li> Double-cliquez sur et sélectionnez le «sélection elliptique pinceau&quot; onglet et définissez la valeur du pixel à 20. </li><li> Pour Hyper-cyto images, cliquez sur une cellule unique pour définir la zone circulaire de la mesure. Ensuite, appuyez sur touche &quot;M&quot; pour mesurer l&#39;intensité de la zone sélectionnée. Les valeurs sont conservées dans une nouvelle fenêtre de résultats. </li><li> Suivant en tenant cliquer la touche &quot;Shift&quot; sur une autre cellule pour sélectionner une autre région, puis en appuyant sur &quot;M&quot;. L&#39;intensité est enregistré dans la fenêtre de résultat. Répétez les étapes 4-5 sur 50 cellules différentes. </li><li> Pour Hyper-d mito images, réglez la valeur du pixel à 10 dans la sélection brosse elliptique. Région d&#39;intérêt (ROI) doit être tracée manuellement, y compris les mitochondries des cellules particulières. </li><li> L&#39;utilisation à main levée, trace la région de l&#39;ordre de la mitochondrie et appuyez sur «M». Répétez les étapes 6-7 sur 50 cellules différentes. </li><li> Copiez le moi<html> une des valeurs de la fenêtre de résultats et de la coller dans une feuille Excel ou tout autre logiciel pour tracer les résultats. Nous utilisons soit SigmaPlot ou GraphPad Prism pour tracer les données comme graphique. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs La figure 1 montre cytosolique et mitochondrial production de ROS lors de l&#39;épreuve avec des ligands de TLR. Représentant des images confocale montrent une augmentation du DCF (cytosolique) et MitoSOX Rouge (mitochondries) fluorescence après 6 heures de stimulation. Changements de fluorescence ont été normalisées et exprimées en fold change. La figure 2 montre la génération de la technologie Hyper-cyto stables et hyper-dMito cellules endothéliales. Cellules endothéliales de souris ont été transfectées avec Phyper-cyto-ou Phyper dMito constructions plasmidiques par électroporation. Plasmides cellules exprimant de façon stable ont été sélectionnées avec du G418 pendant deux semaines. Après sélection, les cellules diluées ont été ensemencées dans des plaques 96 puits. Des colonies individuelles ont été isolés et imagées de l&#39;expression homogène. e_content &quot;&gt; Figure 3 montre la mesure de l&#39;endothélium cytosolique et mitochondrial H 2 O 2 niveaux. Représentant images confocales montrent l&#39;augmentation de l&#39;hyper-cyto (cytosolique) et Hyper-dMito (mitochondries) fluorescence après 6 heures de stimulation. modifications intensité de la fluorescence ont été normalisées et exprimé que le changement se coucher. La figure 4 montre l&#39;évaluation des macrophages dérivés de ROS induite endothéliales Ca cytosolique 2 + de mobilisation. LPS macrophages stimulés ont été ajoutés sur les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (PMVEC) qui avait été précédemment chargé avec le Ca 2 + intracellulaire ([Ca 2 +] i) colorant indicateur Fluo-4. Application de type sauvage LPS-macrophages activés évoqué une [Ca 2 +] i dans les PMVECs qui a été atténuée par KO de la NADPH oxydase fonctionnelle (gp91 phox-/ -). <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Visualizatisur des macrophages généré cellulaires ROS et superoxyde mitochondriale. J774.1 cellules ont été contestées par des ligands TLR2, 3 et 4 (2 pg / ml, acide TLR2 lipotéichoïque; 10μg/ml, le poly (I: C)-TLR3; 1 pg / ml de LPS-TLR4). Pendant 6 h à 37 ° C Après le traitement des cellules ont été chargées avec (A) ROS cellulaires indicateur (H 2 DCF-DA; fluorescence verte) ou (B) l&#39;indicateur superoxyde mitochondrial (MitoSOX Rouge; fluorescence rouge). (C) antimycine A a été utilisé comme contrôle positif pour la production de ROS mitochondriale. Les changements d&#39;intensité de fluorescence ont été évalués en utilisant la microscopie confocale. (D) et (E) La quantification de l&#39;évolution moyenne de fluorescence. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Représentation schématique de générer une expression stable de cytosolique des cellules endothéliales et les indicateurs mitochondriale de ROS. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. V. isualization des endothéliales cytosolique et mitochondrial H 2 O 2 niveaux MPMVECs exprimant de façon stable (A) Hyper-cyto ou (B) Hyper-dMito ont été contestées par des ligands TLR2, 3 et 4 (2 pg / ml, acide TLR2 lipotéichoïque; 10 pg / ml, le poly (I: C)-TLR3; 1 pg / ml de LPS-TLR4) pendant 6 h à 37 ° C. (C) antimycine A a été utilisé comme contrôle positif pour la production de ROS mitochondriale. Après traitement, les changements d&#39;intensité de fluorescence ont été évaluées en utilisant la microscopie confocale. (D) et (E) La quantification de l&#39;évolution moyenne de fluorescence. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Macrophages dérivés de ROS susciter altération des cellules endothéliales mobilisation du Ca2 +. (A) Représentation schématique des cellules endothéliales / macrophages étude d&#39;un modèle de co-culture. (B) fraîchement isolées macrophages murins à la fois de WT et gp91phox souris nulles (The Jackson Laboratory) ont été activés par 1 ug / ml de LPS pendant 6 h. Macrophages ont été marquées avec la cellule-tracker Red (rouge) et ajouté sur Fluo-4 PMVECs chargé (vert) pour évaluer paracrine O 2 • -. signalisation (C) activés par LPS des macrophages isolés de souris WT déclenché importante et rapide mobilisation de Ca 2 + dans PMVECs rapport à macrophages de souris nulles gp91phox. Validation de l&#39;activation des macrophages a été démontré précédemment.

<ol>
	<li>Madesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+role+for+superoxide+in+InsP3+receptor-mediated+mitochondrial+dysfunction+and+endothelial+apoptosis.">Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis.</a> J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).</li><li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function.">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).</li><li>Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+regulate+cellular+signaling+and+dictate+biological+outcomes.">Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes.</a> Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 .</li><li>Hawkins, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+activates+STIM1+and+alters+mitochondrial+homeostasis.">S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis.</a> J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).</li><li>Madesh, M., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC-dependent+permeabilization+of+the+outer+mitochondrial+membrane+by+superoxide+induces+rapid+and+massive+cytochrome+c+release.">VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release.</a> J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).</li><li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidants+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing.">Oxidants oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li><li>Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmful+molecular+mechanisms+in+sepsis.">Harmful molecular mechanisms in sepsis.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).</li><li>Sanlioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+induces+Rac1-dependent+reactive+oxygen+species+formation+and+coordinates+tumor+necrosis+factor-alpha+secretion+through+IKK+regulation+of+NF-kappa.">Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa.</a> 276, 30188-30198 (2001).</li><li>Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flux+in+endothelial+cells+via+the+chloride+channel-3+mediates+intracellular+signaling.">Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).</li><li>Vliet, A. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+in+lung+biology+and+pathology:+host+defense+enzymes+and+more.">NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more.</a> Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).</li><li>Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+defense+mechanisms.+The+production+by+leukocytes+of+superoxide,+a+potential+bactericidal+agent.">Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent.</a> J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).</li><li>Lambeth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX+enzymes+and+the+biology+of+reactive+oxygen.">NOX enzymes and the biology of reactive oxygen.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).</li><li>Mukhopadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).</li><li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish.">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459, 996-999 (2009).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+innate+immunity.">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode décrite ici permet une mesure rapide et quantitative des espèces réactives de l&#39;oxygène dans les cellules vivantes en utilisant soit des colorants d&#39;oxydation ou de capteurs sensibles plasmide. Les agonistes des récepteurs TLR (Toll-like receptors) sont des composés qui stimulent les cellules à travers le TLR présents sur la surface des cellules et déclencher les voies de signalisation en aval 15. Dans notre protocole, nous avons utilisé trois différents TLR savoir agonistes, Li...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Chambre de la cellule Attofluor </td><td> Invitrogen </td><td> A7816 </td></tr><tr><td> Antimycine A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8674 </td></tr><tr><td> Milieu DMEM faible taux de glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 10567-014 </td></tr><tr><td> Endothéliale complément du facteur de croissance (ECGS) </td><td> Upstate </td><td> 02-102 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Invitrogen </td><td> 12662011 </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Invitrogen </td><td> 10131-027 </td></tr><tr><td> Gélatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1393 </td></tr><tr><td> H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> D-399 </td></tr><tr><td> LPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4516 </td></tr><tr><td> LTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2515 </td></tr><tr><td> MitoSOX Rouge </td><td> Invitrogen </td><td> M36008 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I Réduction milieu sans sérum </td><td> Invitrogen </td><td> 51985091 </td></tr><tr><td> Pen / Strep (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140163 </td></tr><tr><td> Phyper-cyto </td><td> Evrogen </td><td> FP941 </td></tr><tr><td> Phyper-dMito </td><td> Evrogen </td><td> FP942 </td></tr><tr><td> Poly (I: C) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0913 </td></tr><tr><td> Prism 5.0 du logiciel </td><td> GraphPad Software, Inc </td><td></td></tr><tr><td> SigmaPlot 11,0 </td><td> Systat Software, Inc </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400054 </td></tr><tr><td> T-25 Flacons </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> Flacons T-75 </td><td> BD Falcon </td><td> 353136 </td></tr><tr><td> 96-T ainsiC micro plaques à puits </td><td> BD Falcon </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> Zen 2009 logiciels </td><td> Carl Zeiss 510 Meta microscopie confocale </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of vascular ca2+ signaling triggered by paracrine derived ros

Le stress oxydatif a été impliquée dans un certain nombre de conditions pathologiques, y compris une ischémie / reperfusion dommages et la septicémie. Le concept de stress oxydatif se réfère à la formation aberrante de ROS (espèces réactives de l&#39;oxygène), qui comprennent O 2 • -, H 2 O 2, et les radicaux hydroxyles. Espèces d&#39;oxygène réactif influences d&#39;une multitude de processus cellulaires, y compris la transduction du signal, la prolifération cellulaire et 1-6 la mort cellulaire. ROS ont le potentiel de dommages vasculaires et les cellules des organes directement, et peuvent initier des réactions chimiques secondaires et des altérations génétiques qui aboutissent à une amplification du dommage tissulaire ROS médiée initiale. Un élément clé de la cascade d&#39;amplification qui exacerbe les dommages tissulaires irréversibles est le recrutement et l&#39;activation de la circulation des cellules inflammatoires. Durant l&#39;inflammation, les cellules inflammatoires produisent des cytokines comme facteur de nécrose tumorale α-(TNF) et de l&#39;IL-1 quiactiver les cellules endothéliales (CE) et les cellules épithéliales et augmenter encore les 7 réponse inflammatoire. La dysfonction endothéliale vasculaire est un élément bien établi de l&#39;inflammation aiguë. Les macrophages contribuent à la dysfonction endothéliale lors de l&#39;inflammation par des mécanismes qui restent obscures. Activation des résultats des macrophages dans la libération extracellulaire de O 2 • - et diverses cytokines pro-inflammatoires, ce qui déclenche la signalisation pathologique dans les cellules adjacentes 8. NADPH oxydases sont la principale source de ROS et primaire dans la plupart des types cellulaires. Récemment, il est démontré par nous et d&#39;autres que les ROS 9,10 produites par NADPH oxydases induire la production mitochondriale de ROS au cours de nombreuses conditions physiopathologiques. Ainsi la mesure de la production mitochondriale de ROS est tout aussi important en plus de mesurer cytosolique ROS. Les macrophages produisent des ROS par la NADPH oxydase flavoprotéine enzyme qui joue un rôle primordial dans l&#39;inflammation. Une fois activé,NADPH oxydase phagocytaire produit de grandes quantités d&#39;O 2 • - qui sont importants dans le mécanisme de défense de l&#39;hôte 11,12. Bien paracrine dérivés O 2 • - joue un rôle important dans la pathogenèse des maladies vasculaires, la visualisation des paracrine ROS induite signalisation intracellulaire incluant mobilisation du Ca2 + est encore l&#39;hypothèse. Nous avons développé un modèle dans lequel les macrophages activés sont utilisés comme une source d&#39;O 2 • - pour transduire un signal pour les cellules endothéliales adjacentes. En utilisant ce modèle, nous démontrons que les macrophages dérivés de O 2 • - conduire à la signalisation calcique dans les cellules endothéliales adjacentes.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS at JoVE.com

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Une méthode efficace pour mieux comprendre en visualisant l&#39;induction paracrine dérivés du ROS endothéliales de signalisation Ca2 + est décrite. Cette méthode prend avantage de mesurer paracrine dérivés ROS déclenché la mobilisation de Ca2 + dans les cellules endothéliales vasculaires dans un modèle de co-culture.

Visualisation des vasculaire Ca 2 + Signalisation Déclenchée par paracrine Dérivé ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

visualization-vascular-ca2-signaling-triggered-paracrine-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

15.4K vues.  Temple University. Une méthode efficace pour mieux comprendre en visualisant l'induction paracrine dérivés du ROS endothéliales de signalisation Ca2 + est décrite. Cette méthode prend avantage de mesurer paracrine dérivés ROS déclenché la mobilisation de Ca2 + dans les cellules endothéliales vasculaires dans un modèle de co-culture.

Vidéo: Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Techniques d&#39;imagerie Ca 2 + Signalisation dans le sperme humain

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Recherche

Biologie

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualisation de l&#39;ATP synthase dimères dans les mitochondries par cryo-tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal glucocorticoïdes Analyse: Surveillance surrénale non invasive en Equidés

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

La perfusion DiI comme méthode de visualisation vasculaire dans<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualisation de Compaction de l’ADN chez les cyanobactéries par haute tension Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&amp;#946; Signaling

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

Analyse moléculaire de Transition endothéliales-mésenchymateuses induite par le Transforming Growth Factor-β de signalisation

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

Rétiniennes Cryo-sections, ensemble-montages et préparations hypotonique vaisseaux isolés pour la visualisation d’Immunohistochemical des péricytes microvasculaire

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Paracrine or juxtacrine signaling mediates such interactions. The use of a conditioned medium and coculture studies are the most common methods to discriminate between these two types of interactions. However, the effect of localized high concentrations of secreted factors in the microenvironment during the paracrine interactions is not accurately recapitulated by conditioned medium and, thus, may lead to imprecise conclusions. To overcome this problem, we have devised a proximal culture method to study paracrine signaling. The two cell types are grown on either surface of a 10 &#181;m-thick polycarbonate membrane with 0.4 &#181;m pores. The pores allow the exchange of secreted factors and, at the same time, inhibit juxtacrine signaling. The cells can be collected and lysed at the endpoint to determine the effects of the paracrine signaling. In addition to allowing for localized concentration gradients of secreted factors, this method is amenable to experiments involving prolonged periods of culture, as well as the use of inhibitors. While we use this method to study the interactions between ovarian cancer cells and the mesothelial cells they encounter at the site of metastasis, it can be adapted to any two adherent cell types for researchers to study paracrine signaling in various fields, including tumor microenvironment, immunology, and development.

Paracrine and juxtacrine cellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Here, a proximal culture method is used to study paracrine signaling where the localized concentrations of the secreted factors are maintained while preventing direct cellular contact.

Une méthode de Culture Proximal pour étudier la signalisation Paracrine entre cellules

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells downstream of pattern recognition receptors. Best studied are the Dectin-1 and Dectin-2 members of the C-type lectin-like receptor family that induce a SYK- and CARD9-dependent signaling cascade leading to NF-&#954;B activation, in a MALT1-dependent manner. By contrast, Toll-like receptors (TLR), such as TLR-4, propagate NF-&#954;B activation but signal via an MYD88/IRAK-dependent cascade. Nonetheless, whether MALT1 might contribute to TLR-4 signaling has remained unclear. Recent evidence with MLT-827, a potent and selective inhibitor of MALT1 paracaspase activity, indicates that TNF- production downstream of TLR-4 in human myeloid cells is independent of MALT1, as opposed to TNF- production downstream of Dectin-1, which is MALT1 dependent. Here, we addressed the selective involvement of MALT1 in pattern recognition sensing further, using a variety of human and mouse cellular preparations, and stimulation of Dectin-1, MINCLE or TLR-4 pathways. We also provided additional insights by exploring cytokines beyond TNF-, and by comparing MLT-827 to a SYK inhibitor (Cpd11) and to an IKK inhibitor (AFN700). Collectively, the data provided further evidence for the MALT1-dependency of C-type lectin-like receptor &#8212;signaling by contrast to TLR-signaling.

MALT1 regulates innate immunity but how this occurs remains ill-defined. We used the selective MALT1 paracaspase inhibitor MLT-827 to unravel the contribution of MALT1 to innate signaling downstream of Toll-like or C-type lectin-like receptors, demonstrating that MALT1 regulates the production of myeloid cytokines, and downstream of C-type lectin-like receptors, selectively.

Règlement de voie signalisation innée myéloïde par MALT1 Paracaspase activité

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Applications de cartographie spatio-temporelle et Techniques d’analyse des particules pour quantifier la signalisation intracellulaire Ca2 + In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...